CN105585608A - 从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，它包括以下步骤：以黄绿蜜环菌子实体为原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取；取上清进行一维液相分离，采用Silica正相硅胶色谱柱，A相正己烷、B相乙醇二元有机相，B相浓度由0％至75％梯度洗脱；得一维组分进行二维液相分离，洗脱方式变为B相浓度4-8％等度洗脱；得二维组分进行三维液相分离，洗脱方式变为B相浓度2-3％等度洗脱，得目的产物。该方法采用高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，操作简单省时。实验发现该化合物对Hep-g2和A549具抑制作用，故具有抗癌药物开发潜力，为新药研发提供理论依据。

Description

从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法及其应用

技术领域

本发明涉及药物化学及生物医药技术领域，具体涉及一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，以及该麦角甾醇过氧化物在制备抗肝癌药物、抗肺癌药物中的应用。

背景技术

黄绿蜜环菌(Armillarialuteo-rivens)，又名黄蘑菇、金蘑菇、黄环菌，隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属。黄绿蜜环菌子实体中等大，菌盖扁半球形至平展，直径5-12cm，菌盖边缘内卷，表皮开裂形成近环状排列的纤毛状后磷片。菌褶近似菌盖色，稍密，弯生，不等长。菌柄柱形，茎部膨大，长2-10cm，直径2-2.5cm，白色或或带黄色，内实。菌环中位，单层，菌环以上为白色，菌环以下为黄色鳞片。在显微镜下观察，担孢子椭圆形，无色至微黄色，淀粉质，担孢子棒状，无色，具4个孢子，菌丝具明显锁状联合。菌丝分布在土壤5-10cm。该菌夏秋季生于针叶林地或草地上，尤其喜生于高山草地上，菌丝可与主要植被为嵩草和高山杂类草等形成菌根。在牧草生长季节，由黄绿蜜环菌菌丝顶端生长，在草地上形成或大或小的圆圈、半圆或条带状的蘑菇圈。圈的宽度大约为50cm，圈的直径大约6cm左右(周连玉.黄绿蜜环菌的研究概述.安徽农学通报[J].2010,16(3):52-54)。

国内对黄绿蜜环菌营养成分进行了初步分析，富含氨基酸、蛋白质、多糖多肽等营养和药用成分，具有较高的保健和药用价值。但目前的蜜环菌制剂主要以初提混合物为原料，如郭顺星等在“蜜环菌的化学成分及应用研究”(微生物学通报[J].1996,23(4):239-240)中提出：蜜环菌糖浆以蜜环菌培养液(菌丝连同发酵液)为主要原料，煮沸浓缩制成，主治眩晕头痛，神经衰弱，失眠，美尼尔综合症；蜜环菌浸膏以菌丝体为原料，煮沸、过滤，残渣醇析，醇析物与滤液合并浓缩制成，用于治疗血管性头痛、神经衰弱、冠心病、脑动脉血管硬化等病；蜜环菌片以菌丝体烤干后磨成细粉压片而成，对高胆固醇血症、高甘油三酯血症、降低血压有一定效果。由于蜜环菌制剂成分一般为混合物，缺乏必要的药效物质基础和药效研究，所以其缺乏合理的质量控制标准，难以确保临床用药的有效性、安全性、可持续性。可见，对黄绿蜜环菌的化学成分进行进一步提取和研究非常有必要。

麦角甾醇过氧化物是黄绿蜜环菌中一种重要的植物甾醇类物质。目前对该化合物的提取步骤繁琐，重复性不高，且得率低，制备量小，仅能满足实验室研究需求。而对该化合物的研究，多用于生化方面，对其抗癌的药理活性研究鲜有报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，该方法采用离线高效液相色谱进行分离纯化，分离方法稳定，重复性高，制备量大，得到的麦角甾醇过氧化物纯度可达98％以上；且使用该方法制备麦角甾醇过氧化物提取率高，每公斤原料可达目的产物30mg，相比现有技术提取率高，操作简单省时，能满足工业化生产需求。

本发明所采用的技术方案为：

一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；

(2)使用乙醇体积分数为10-35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；

(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％梯度洗脱45-75min，根据紫外吸收光谱收集10-14min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；

(4)用乙醇体积分数为2-13％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；

(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4-8％等度洗脱20-30min，根据紫外吸收光谱收集6-8min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；

(6)用乙醇体积分数为2-13％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；

(7)进行再分离纯化：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为300-1500μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度2-3％等度洗脱35-45min，根据紫外吸收光谱收集22-24min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物麦角甾醇过氧化物。

所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。

所述步骤(5)、(7)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。

本发明还进一步提供上述提取得到的麦角甾醇过氧化物在制备抗肺癌药物中的应用。该麦角甾醇单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。

本发明进一步提供上述提取得到的麦角甾醇过氧化物在制备抗肝癌药物中的应用。该麦角甾醇单体化合物作为有效成分，按常规方法如口服、注射，与药学上的可接受载体或赋形剂，制成适合口服、注射等给药方式的剂型，如：片剂、胶囊、注射剂等。

本发明原料黄绿蜜环菌化学成分复杂、物质极性比较集中，目的化合物麦角甾醇过氧化物极性较小，所以本发明先选用乙酸乙酯进行有效组分的粗提。根据相似相溶原理，该溶剂可以尽可能多地溶解目的组分以及与相近的小分子杂质，且乙酸乙酯为脂溶性溶剂，与其相似相溶的目的组分也应该具备进入生物活性细胞所必需的脂溶性特性，从而具有更高的进入细胞参与细胞内作用的可能性。

其次在色谱分离的选择上选用离线液相色谱技术进行有效组分的提取，其优势在于液相色谱不仅具有更高的峰容量，而且三维具有不同的选择性。经过一维简化的组分可以在二维、三维上根据不同的选择性实现互补分离，结构相似的化合物可以在二维、三维上达到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。

本发明利用液相色谱制备的方法成功从黄绿蜜环菌中提取分离得到纯度达98％的天然小分子麦角甾醇过氧化物，该方法工艺简单，时间周期短，试剂耗费量小，制备量大，稳定可控，重复性好，实用性高，适用于大规模工业化生产的需要。

现在药理研究表明，黄绿蜜环菌具有多种药理作用和保健作用并被广泛应用于心脑血管疾病、妇科各类疾病的治疗。因此从中分离出具有确切结构并且易于进行化学合成的集抗癌活性为一体的化合物必将为抗癌新药的研发奠定基础。本发明得到的黄绿蜜环菌提取物麦角甾醇过氧化物性质稳定，通过细胞在线实时监测的方法观测其在体外的抗肿瘤作用，发现该化合物对肝癌Hep-g2细胞和肺癌A549细胞均具有抑制作用；该化合物在体外实验抗肿瘤作用明显，具有抗癌药物开发潜力，为抗癌天然药物的开发提供了有力的依据。

附图说明

图1所示的是本发明实施例1中的一维高效液相色谱图；

图2所示的是本发明实施例1中的二维高效液相色谱图；

图3所示的是本发明实施例1中的三维高效液相色谱图；

图4所示的是本发明实施例2中的一维高效液相色谱图；

图5所示的是本发明实施例2中的二维高效液相色谱图；

图6所示的是本发明实施例2中的三维高效液相色谱图；

图7所示的是本发明所得目的组分的分析型高效液相色谱图；

图8所示的是本发明所得目的组分的MS质谱图；

图9所示的是本发明所得目的组分的H¹NMR核磁图；

图10所示的是本发明所得目的组分的C¹³NMR核磁图；

图11所示的是本发明所得目的组分的HMQC谱图；

图12所示的是本发明所得目的组分的HMBC谱图；

图13所示的是本发明所得麦角甾醇过氧化物对肺癌A549细胞的抑制作用；

图14所示是本发明所得麦角甾醇过氧化物对肝癌Hep-G2细胞的抑制作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

1、原料、材料：

黄绿蜜环菌子实体采摘自青海祁连并经过鉴定；A549细胞、Hep-G2细胞由中国医学科学院血液病医院提供。

2、试剂：

无水乙醇购自天津市北方天医化学试剂厂；色谱级乙酸乙酯、正己烷购自Honeywell公司；DMSO购自天津康科德科技有限公司；F-12K培养基购自LifeTechnologiesCorporation；MEM培养基购自LifeTechnologiesCorporation。

3、仪器设备：

超微粉碎机购自山东三清不锈钢设备有限公司；台式冷冻离心机购自Thermo公司；恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科学仪器有限公司；旋转蒸发仪上海亚容生化仪器厂；silica硅胶色谱柱购自博纳艾吉尔有限公司；制备型高效液相色谱仪购自江苏汉邦科技有限公司；iCELLigence实时无标记细胞功能分析仪购自艾森生物(杭州)有限公司；细胞培养箱购自立德泰勀(上海)科学仪器有限公司。

实施例1：

本实施例从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。

(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉3kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：3kg黄绿蜜环菌超微粉加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡36h，浸泡结束后，20℃、4000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入15L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束后，20℃、4000rpm离心30min，收集上清液。将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。

(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为25％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成125mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。

(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为100mL/针，流动相流速为580mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3-10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱60min。得到的一维液相色谱图如图1所示，得到如图10个主要粗组分，收集10-14min(图中5号峰)洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分。

(5)用乙醇体积分数为10％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为100mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。

(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度6％进行等度洗脱20min。得到的二维液相色谱图如图2所示，第一个主峰为目的峰，收集6-8min(图中5-1号峰)洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干(232mg)，得到二维液相组分。

(7)用乙醇体积分数为10％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为60mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到三维上样溶液。

(8)对三维上样溶液进行三维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为900μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度2.6％进行等度洗脱40min。得到的三维液相色谱图如图3所示，第二个峰为目的峰，收集22-24min洗脱液(图中5-1-2号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干(82mg)，即为本发明目的组分。

实施例2：

本实施例从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，室温阴干处理后，在70℃烘干脱水，然后在-20℃超微粉碎1min，即得黄绿蜜环菌超微粉。

(2)取上述黄绿蜜环菌超微粉5kg，经过三次乙酸乙酯浸泡，第一次浸泡：5kg黄绿蜜环菌超微粉加入25L乙酸乙酯，25℃浸泡48h，浸泡结束后，20℃、4000rpm离心30min，分别收集上清液和残渣，上清液通过旋转蒸发浓缩后转移至60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重。第二次乙酸乙酯浸泡：第一次的残渣加入25L乙酸乙酯，25℃浸泡36h。(浸泡结束，按第一次浸泡方法进行处理，其中水体乙酸乙酯上清可与第一次提取上清混合，烘干至恒重)。第三次浸泡：第二次浸泡残渣加入25L乙酸乙酯，25℃浸泡24h，浸泡结束，按第一次浸泡处理方法进行处理，将三次浸泡上清合并，旋蒸浓缩后烘干至恒重。

(3)将干燥至恒重的乙酸乙酯上清用乙醇体积分数为35％的正己烷-乙醇二元混合溶剂溶解配制成150mg/mL的溶液，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到黄绿蜜环菌子实体小分子提取物的一维上样溶液。

(4)对一维上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(150mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为150mL/针，流动相流速为600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm；乙醇活化色谱柱3-10倍柱体积，正己烷平衡3倍柱体积，一维上样溶液上样，采用B相浓度由0％至75％进行梯度洗脱60min。得到的一维液相色谱图如图4所示，得到如图10个主要粗组分，收集10-14min洗脱液(图中5号峰)作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分。

(5)用乙醇体积分数为8％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为85mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到二维上样溶液。

(6)对二维上样溶液进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1200μL/针，流动相流速为26mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度6％进行等度洗脱25min。得到的二维液相色谱图如图5所示，第一个主峰为目的峰，收集6-8min洗脱液(图中5-1号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干(361mg)，得到二维液相组分。

(7)用乙醇体积分数为8％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为55mg/mL，溶解后过0.45μm的有机滤膜，得到三维上样溶液。

(8)对三维上样溶液进行三维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱(20mm×250mm，硅胶粒径10μm)，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷，B相为乙醇，进样量为1000μL/针，流动相流速为20mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210nm，采用的洗脱方式为等度洗脱方式：B相浓度3％进行等度洗脱35min。得到的三维液相色谱图如图6所示，第二个峰为目的峰，收集22-24min洗脱液(图中5-1-2号峰)作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干(117mg)，即为本发明目的组分。

实施例3：麦角甾醇过氧化物的确认

1、HPLC进行纯度分析：

将实施例1得到的目的组分(图3中5-1-2峰)进行HPLC进行纯度分析。经高效液相检测纯度达到98％以上，为单一化合物，HPLC谱图见图7。

2、质谱分析：

对目的组分(图3中5-1-2峰)进行质谱分析：瀚盟生物技术(天津)有限公司，质谱图见图8。EI-MSm/z：467(M+K)，429(M+H)⁺。

3、核磁共振分析：

对目的组分(图3中5-1-2峰)进行核磁共振分析：由碳谱、氢谱、COSY相关谱(如图9-12)佐证分析得到以下结果：

1H-NMR(CDCl3,400MHz)：δ3.95(1H,m,H-3),6.26(1H,d,J＝8.5Hz,H-6),6.52(1H,d,J＝8.5Hz,H-7),0.83(3H,s,H-18),0.86(3H,s,H-19),1.01(3H,d,J＝6.6Hz,H-21),5.16(1H,dd,J＝8.5,15.4,Hz,H-22),5.22(1H,dd,J＝7.8,15.4Hz,H-23),0.81(3H,d,J＝6.6Hz,H-26),0.83(3H,d,J＝6.6Hz,H-27),0.92(3H,d,J＝6.8Hz.H-28)。

1D¹³C-NMR(CDCl₃,400MHz)：δ34.71(H-1)，66.43(H-3),36.94(H-4),82.17(H-5),135.38(H-6),130.74(H-7),79.40(H-8),51.12(H-9),36.98(H-10),23.41(H-11),39.36(H-12),44.57(H-13),51.70(H-14),20.64(H-15)，28.64(H-16)，56.22(H-17)，12.83(H-18)，18.18(H-19)，39.72(H-20)，20.89(H-21)，135.12(H-22)，132.22(H-23)，42.79(H-24)，33.07(H-25)，19.95(H-26)，19.64(H-27)，17.56(H-28)。

根据EI-MS、NMR鉴定结果，经结构解析，确定其为麦角甾醇过氧化物，其分子

结构式如下：

对实施例2得到的目的组分(图6中5-1-2峰)进行如上分析，结果与上述一致。

取本发明得到的麦角甾醇过氧化物进行以下实施例3～4肿瘤抑制试验。

实施例4：抑制人肺肿瘤A549细胞生长的试验

细胞培养：

在5％CO₂、37℃、饱和湿度下，用F-12K(10％FBS+1％PS)培养基培养人肺肿瘤A549细胞，选取对数期生长的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

细胞生长情况监测：

将细胞实时监测仪放入37℃、5％CO₂，饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLF-12K培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的A549细胞悬液345μL，至每孔细胞数约2×10⁴个，静置3min，在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μl稀释好的药物(本发明得到的麦角甾醇过氧化物)至终浓度为25μg/ml，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。

空白对照孔(DMSO)：不加药物，加1‰DMSO；

实验孔(HMG-5-1-2)：加药物，即本发明所得麦角甾醇过氧化物。

试验结果如图13所示。

结果表明：本发明产物麦角甾醇过氧化物对A549细胞生长抑制较强。

实施例5：抑制人肝肿瘤Hep-G2细胞生长的试验

细胞培养：

在5％CO₂、37℃、饱和湿度下，用MEM(10％FBS、1％PS)培养基培养人肺肿瘤Hep-G2细胞，选取生长状态良好的细胞作为实验细胞。细胞计数后用培养基稀释为一定浓度的细胞悬液。

细胞生长情况监测：

将细胞实时监测仪放入5％CO₂、37℃饱和湿度培养箱中。取八孔板，每孔加入150μLMEM培养基，放入细胞实时监测仪中走基线，走完基线后取出八孔板，每孔加入稀释好的Hep-G2细胞悬液345μL，至每孔细胞数约4×10⁴个，静置3min,在倒置显微镜下观察细胞是否均匀。每孔加入5μL稀释好的药物(本发明得到的麦角甾醇过氧化物)至终浓度为25μg/ml，含1‰DMSO的培养基作为空白对照组，放入细胞实时监测仪中检测，检测完毕时拍照记录。

空白对照孔(DMSO)：不加药物，加入1‰DMSO；

实验孔(HMG-5-1-2)：加药物，即本发明所得麦角甾醇过氧化物。

实验结果如图14所示。

结果表明：本发明目的组分麦角甾醇过氧化物能较强地抑制HeP-G2细胞生长。

实验证明，在一定浓度范围内，麦角甾醇过氧化物具有很好的抑制肿瘤细胞生长的活性，但由于前人没有研究其药理作用，因此其抗肿瘤作用并未为人所知，其潜在的抗肿瘤活性还未被挖掘。本发明提供了该小分子的一项新的提取方法和新的应用，为新药的研发提供理论依据。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合中药提取和肿瘤实验的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (5)

1.一种从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)以黄绿蜜环菌子实体为原料，经干燥并磨成粉末状后，用乙酸乙酯以液固比(5-10)mL︰1g进行浸泡，然后过滤取上清，得到乙酸乙酯提取液，并浓缩至膏状；

(2)使用乙醇体积分数为10-35％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解步骤(1)得到的膏状乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上样溶液；

(3)对上样溶液进行一维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为50-150mL/针，流动相流速为550-600mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm；采用的洗脱方式为B相浓度由0％至75％梯度洗脱，根据紫外吸收光谱收集10-14min洗脱液作为目的组分，减压浓缩至膏状，得到一维液相组分；

(4)用乙醇体积分数为2-13％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解一维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；

(5)进行二维液相色谱分离：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为500-2000μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度4-8％等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集6-8min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到二维液相组分；

(6)用乙醇体积分数为2-13％的乙醇-正己烷二元混合溶剂溶解二维液相组分，溶解至浓度为50-100mg/mL；

(7)进行再分离纯化：采用的色谱柱为Silica正相硅胶色谱柱，采用的流动相为二元混合有机相，其中A相为正己烷、B相为乙醇，进样量为300-1500μL/针，流动相流速为10-30mL/min，检测器为紫外检测器，检测波长210-260nm，采用的洗脱方式为B相浓度2-3％等度洗脱，根据紫外吸收光谱收集22-24min洗脱液作为目的组分，旋转蒸发浓缩至干，得到目的产物麦角甾醇过氧化物。

2.根据权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径150mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。

3.根据权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法，其特征在于：所述步骤(5)、(7)中的Silica正相硅胶色谱柱的尺寸为直径20mm、柱长250mm，其中硅球粒径为10-50μm，使用时柱温为室温或25-40℃。

4.权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法得到的麦角甾醇过氧化物在制备抗肺癌药物中的应用。

5.权利要求1所述的从黄绿蜜环菌中提取麦角甾醇过氧化物的方法得到的麦角甾醇过氧化物在制备抗肝癌药物中的应用。