CN110172065B - 一种化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化合物、其制备方法、应用以及抗炎药物。该化合物具有式I或式Ⅱ所示结构。该化合物对正常A7r5细胞生长无影响，但对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

Description

一种化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明总地涉及医药技术领域，特别涉及一种植物源化合物、其制备方法、应用以及抗炎药物。

背景技术

独活为伞形科(Umbelliferae)当归属(Angelica L.)植物重齿毛当归(Angelicapubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根。主产于四川、湖北、安徽等地。性味辛、苦，微温。归肾、膀胱经。具有祛风除湿、通痹止痛之功效，主要用于治疗风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛，风寒挟湿头痛等症。现代药理研究表明，独活有抗肿瘤、抗炎、镇痛、镇静、抑制血小板聚集和降压等多种活性。

迄今，从独活根及根茎分出的主要为香豆素类和挥发油成分，还有少量甾醇和糖类成分。其中，独活挥发油具有明显的抗炎和镇痛作用，香豆素类化合物是植物次生代谢产物，具有消炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、抑制血小板聚集和血栓形成等生物活性，该类化合物在医药、农业等领域有广泛应用。以独活为主要原料的中成药种类多样，有独活止痛搽剂、独活寄生合剂、独活寄生丸、复方独活吲哚美辛胶囊等。同时，独活在保健领域的应用历史悠久，《神农本草经》上就有关于独活“久服，轻身、耐老”的记载，近年来已进入家畜保健领域。独活乙醇提取物对柑桔青霉、绿霉、炭疽、酸腐病菌的抑制活性也较好，在植保领域也出现应用，以独活为原料的植物源农药发展前景也十分广阔。鉴于独活多样的生物活性和广阔的市场前景，有必要对其化学成分进行进一步的研究，以探究其发挥药效的物质基础，为开发和利用独活资源提供参考依据。

现代医学研究表明，血管平滑肌是血管壁的重要组成部分，对于维持血管结构和功能起着很重要的作用。动脉粥样硬化、高血压等许多疾病的发生发展过程都与动脉平滑肌的异常增殖有关，其发展过程中有大量炎症因子参与。诱发炎症的因素有很多，如烧伤、化学刺激、物理损伤以及毒素等。其中，脂多糖(LPS)是细菌感染性炎症反应中最主要的促炎因子，可诱导炎症细胞合成并释放多种炎症因子，导致机体出现一系列病理生理反应。LPS诱导的血管平滑肌细胞异常增殖和功能紊乱在血管病变过程中起重要作用。

发明内容

本发明的目的在于从中药独活中分离制备出一种具有抗炎活性的化合物，并提供了其在制备抗炎药物中的应用。

本发明提供了一种倍半萜类化合物，具有式I或式Ⅱ所示结构，

本发明还提供了一种前述化合物的制备方法，其包括如下步骤：

步骤1：将独活药材加乙醇提取，提取液浓缩得到浸膏；

步骤2：将浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；

步骤3：将乙酸乙酯浸膏进行柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的二氯甲烷-丙酮体积比为20:1～0:1，收集二氯甲烷-丙酮体积比为5:1的部位；

步骤4：将步骤3得到的部位进行凝胶柱色谱纯化，以甲醇洗脱，收集洗脱液；

步骤5：将步骤4得到的洗脱液进行色谱分离纯化，以12％～40％的有机溶剂水溶液进行洗脱，收集洗脱液，获得上述式I和式Ⅱ所示化合物。

优选地，所述步骤1中所述乙醇体积分数为65％-80％。

优选地，所述独活药材与所述乙醇的重量比为1:(8～15)。

优选地，所述步骤4中，凝胶柱色谱中所用凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G15或Sephadex G50。

优选地，所述步骤5中，所述色谱分离纯化为高效液相色谱、中低压制备色谱或动态轴向压缩柱色谱分离。

或优选地，所述步骤5中，所述洗脱用有机溶剂为甲醇、乙醇或乙腈。

本发明还提供了上述化合物在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提供了一种抗炎药物，其包括上述化合物。

优选地，所述抗炎药物为用各种药学上可接受的辅料制备的口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。

式I和式Ⅱ所示结构的化合物均对正常A7r5细胞生长无影响，但对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

附图说明

图1为本发明制备例4制备的化合物2的ESI-MS图；

图2为本发明制备例4制备的化合物2的¹H-NMR图；

图3为本发明制备例4制备的化合物2的¹³C-NMR图；

图4为本发明制备例4制备的化合物2的DEPT图；

图5为本发明制备例4制备的化合物2的¹H-¹H COSY图；

图6为本发明制备例4制备的化合物2的HMBC图；

图7为本发明制备例4制备的化合物2的HSQC图；

图8为本发明制备例4制备的化合物2的NOESY图；

图9为本发明制备例4制备的化合物1的¹H-NMR图；

图10为本发明制备例4制备的化合物1的¹³C-NMR图；

图11为本发明制备例4制备的化合物1的HSQC图；

图12为本发明制备例4制备的化合物1的HMBC图；

图13为本发明制备例4制备的化合物1的¹H-¹H COSY图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

其次，需要注意的是，本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。其它除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。

药材与试剂

除液相色谱用甲醇和乙腈为色谱纯外，其余试剂均为分析纯。独活药材为伞形科(Umbelliferae)当归属(Angelica L.)植物重齿毛当归(Angelica pubescensMaxim.f.biserrata Shan et Yuan)的干燥根，该药材购于安徽亳州。

制备例1

独活药材10kg，粉碎后加入10倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-丙酮(20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-丙酮(5:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，采用C18柱(21.2×250mm，5μm)，检测波长230nm，流速15mL/min，以30％的乙腈水溶液进行洗脱，得到化合物1 4.5mg和化合物24.8mg。

制备例2

独活药材5kg，粉碎后加入12倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-丙酮(20:1、15:1、8:1、5:1、2:1、0:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-丙酮(5:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，采用C18柱(21.2×250mm，5μm)，检测波长230nm，流速15mL/min，以32％的乙腈水溶液进行洗脱，得到化合物1 2.8mg和化合物23.6mg。

制备例3

独活药材8kg，粉碎后加入15倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-丙酮(20:1、15:1、8:1、5:1、2:1、0:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-丙酮(5:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，采用C18柱(21.2×250mm，5μm)，检测波长230nm，流速15mL/min，以32％的乙腈水溶液进行洗脱，得到化合物1 4.4mg和化合物24.8mg。

制备例4

独活药材15kg，粉碎后加入10倍量的75％乙醇回流提取2次，每次2h，滤过，滤液回收乙醇并浓缩得到浸膏。此浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位减压回收乙酸乙酯并浓缩，得到乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏利用硅胶柱层析，以二氯甲烷-丙酮(20:1、15:1、8:1、5:1、2:1、0:1)梯度洗脱，每500ml接收一个流份，收集二氯甲烷-丙酮(5:1)的组分，经减压浓缩后，再进行Sephadex LH-20凝胶柱纯化，甲醇洗脱，每5ml收集一个流份，减压浓缩后，经高效液相色谱分离，采用C18柱(21.2×250mm，5μm)，检测波长230nm，流速15mL/min，以32％的乙腈水溶液进行洗脱，得到化合物1 8.4mg和化合物27.5mg。

实施例1

制备例1-4所得化合物均为白色粉末，采用ESI-MS、¹H NMR、¹³CNMR、HSQC、HMBC和¹H-¹H COSY谱对制备例4所得2个成品进行结构鉴定。

化合物2的HR-ESI-MS(positive)给出m/z为305.1368[M+Na]⁺(理论计算值为282.1467)，进而推测化合物分子式为C₁₅H₂₂O₅，不饱和度为5。

¹H NMR(400MHz，CD₃OD)谱显示该化合物有四个甲基质子信号：两个偕甲基δ1.11(3H，s，H-11)，1.28(3H，s，H-12)，一个连在烯碳上的甲基δ1.96(3H，s，H-14)，一个单峰甲基δ1.40(3H，s，H-13)；两个连氧的次甲基质子信号δ4.17(1H，dd，J＝7.1，6.1Hz，H-9)，4.61(1H，m，H-7a)，一个烯碳质子信号δ5.90(1H，s，H-5)。¹³C NMR和DEPT谱显示有15个碳信号，推测该化合物可能是倍半萜类，其中一个羰基碳信号δ198.3(C-4)，一对双键碳δ126.2(C-5)，161.4(C-6)，一个季碳δ114.7(C-2)，两个偕氧的季碳信号δ84.1(C-8)，81.8(C-3)，两个连氧的次甲基碳信号δ76.2(C-9)，73.0(C-7a)，一个次甲基碳δ53.7(C-3a)，2个亚甲基碳δ38.1(C-10),36.2(C-7)，4个甲基碳δ27.3(C-11),23.2(C-14),21.5(C-12),19.9(C-13)。

¹H-¹HCOSY谱显示δ4.17(1H，dd，H-9)与δ2.15(1H，dd，H-10a)和δ2.27(1H，dd，H-10)相关；δ4.61(1H，m，H-7a)与δ2.81(1H，d，H-3a)和δ2.6(1H，t，H-7)。HMBC谱中，烯烃质子δ5.90(1H，s，H-5)与δ53.7(C-3a)、23.2(C-14)、36.2(C-7)的碳相关；δ2.81(1H，d，J＝9.2Hz，H-3a)与δ198.4(C-4，C＝O)、73.0(C-7a)、36.2(C-7)的碳相关，表明结构中存在一个取代的环己烯酮片段。δ1.96(3H，s，H-14)与δ161.4(C-6)、126.2(C-5)和36.2(C-7)的HMBC相关也证明了C-6位被甲基取代。证明化合物2存在以下结构：

此外，δ1.35(3H，s，H-13)与δ53.4(C-3a)、81.6(C-3)、115.2(C-2)的碳相关，证明了侧链的存在，且环己烯酮的C-3a位与侧链的δ81.6(C-3)相连；δ2.03(1H,dd,J＝14.3,5.9Hz,H-10a)与δ115.2(C-2)、84.4(C-8)、76.5(C-9)的碳相关，δ3.85(1H，dd，J＝7.1，6.1Hz，H-9)与δ115.2(C-2)、26.2(C-11)的碳相关；该化合物存在5个不饱和度，除了2个双键和一个A环外，结构中还必须有2个环系。综合以上信息，δ84.4(C-8)的季碳只有与δ115.2(C-2)的季碳通过氧相连并成环才合理，同样的，δ73.2(C-7a)的次甲基碳只有与δ115.2(C-2)的季碳通过氧相连并成环才合理。至此，该化合物2的平面结构确定：

其相对构型通过NOESY谱确定。NOESY谱中，H-3a/H-7a，H-3a/H-13的相关证明H-3a，H-7a和H-13在同侧，H-9/H-13无相关证明H-9和H-13在不同侧。至此，该化合物2的结构确定：

化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR谱与化合物式2的相似，不同点在于C-9位的羟基构型，HMBC谱表明其平面结构和化合物2相同。NOESY谱中，化合物式1能明显看到H-9/H-13的相关，而化合物2无此相关，证明OH-9构型与式Ⅱ相反。化合物1的结构确定：

表1本发明提供的式I所和式Ⅱ示化合物的核磁数据

注：测试条件式I和式Ⅱ为氘代甲醇，¹H NMR 400MHz，¹³C NMR100MHz。

实施例2

本实施例用于采用化合物1、2进行体外抗炎试验。

1、试验材料

1.1细胞：A7r5大鼠胸主动脉平滑肌细胞购自于上海中科院细胞库，传至第三代进行试验。

1.2试剂：DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，胰蛋白酶(Gibco)，LPS(Sigma)，DMSO(sigma)，一氧化氮(NO)检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；化合物1(结构式如式(I)所示)。化合物2(结构式如式(Ⅱ)所示)。

1.3仪器与设备：超净工作台(苏净安泰)，二氧化碳培养箱(Thermo scientific3100)，倒置显微镜(OLYPUS)，96孔细胞培养板(美国Costar)，25cm²细胞培养瓶(美国Costar)，酶标仪(MD)，移液枪(Eppendorf)，BXM-30R立式压力蒸气灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)，LD4-2A离心机(北京众益中和生物技术有限公司)，细胞自动计数仪(Invitrogen，Cl028)。

2、试验方法

2.1供试品配制：称取化合物1、2分别溶于DMSO中配制成浓度为50mM的储存液，检测时用无血清DMEM培养液稀释1/1000作为供试品药液。

2.2细胞培养：细胞以8×10⁴个/mL的浓度接种于96孔细胞培养板，每孔100μL，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。

2.3化合物对正常A7r5细胞生长的影响：取2.2培养细胞，吸尽上清，按照正常对照组、化合物1组、化合物2组给予无血清培养基100uL，化合物1、化合物2组用无血清培养基配制，使其终浓度为50μM，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。每组设三个复孔，计时提前4h按终浓度5mg/mL加入MTT，继续培养4h，小心吸尽上清，按150uL/孔加入DMSO溶解结晶，混匀后与酶标仪检测各孔OD570。

2.4化合物对LPS刺激A7r5细胞后NO分泌的影响：取2.2培养细胞，吸弃上清，按照实验需要分成正常组、模型组、化合物1组、化合物2组，正常对照组给予无血清培养基100μL，模型组给予用无血清培养基配制的终浓度为3μg/mL的LPS 100μL，化合物1组和化合物2组供试品药液用浓度为3μg/mL的LPS配制，使其终浓度为50μM，于37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养24小时。每组设三个复孔。计时结束后，吸取50μL细胞上清液加入空白96孔板，加入室温50μL Griess ReagentⅠ，加入室温50μL Griess ReagentⅡ，于540nm测定吸光度，用于NO的检测。

3、统计方法

使用SPSS 16.0统计软件进行分析，实验数据均以

表示，p<0.05为差异有统计学意义。

4、结果

在化合物对正常A7r5细胞生长的影响试验中，与正常对照组相比，化合物1组、化合物2组在50μM的浓度下对A7r5细胞生长无明显影响，结果见表2。在LPS采集A7r5细胞的炎症反应中，与正常对照组相比，模型组LPS刺激24h后A7r5细胞上清液中NO含量显著升高，而经过化合物预处理24h后，细胞上清液中NO的释放受到明显抑制，结果见表3。

表2化合物对A7r5细胞生长的影响

与正常组比较，化合物1组、化合物2组均未有统计学差异，p>0.05。

表3化合物对LPS刺激A7r5细胞产生NO的影响

与正常对照组比较，##p≤0.01；与模型组比较，**p≤0.01，*p≤0.05

综上可知，本发明提供的化合物1、2均对正常A7r5细胞生长无影响，但对LPS刺激A7r5细胞产生NO有明显的抑制作用，具有良好的抗炎作用。

最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (8)

1.一种倍半萜类化合物，具有式I或式Ⅱ所示结构，

2.一种权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：将独活药材加乙醇提取，提取液浓缩得到浸膏；

步骤2：将浸膏加水悬浮，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯萃取部位浓缩，得到乙酸乙酯浸膏；

步骤3：将乙酸乙酯浸膏进行柱色谱分离，以二氯甲烷-丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的二氯甲烷-丙酮体积比为20:1～0:1，收集二氯甲烷-丙酮体积比为5:1的部位；

步骤4：将步骤3得到的部位进行凝胶柱色谱纯化，以甲醇洗脱，收集洗脱液；

步骤5：将步骤4得到的洗脱液进行色谱分离纯化，以12％～40％的乙腈水溶液进行洗脱，收集洗脱液，获得式I和式Ⅱ所示化合物；

其中所述色谱分离纯化为高效液相色谱、中低压制备色谱或动态轴向压缩柱色谱分离；

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1中所述乙醇体积分数为65％-80％。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述独活药材与所述乙醇的重量比为1:(8～15)。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，凝胶柱色谱中所用凝胶为Sephadex LH-20、Sephadex G15或Sephadex G50。

6.权利要求1所述化合物在制备抗炎药物中的应用。

7.一种抗炎药物，其包括权利要求1所述化合物。

8.根据权利要求7所述的抗炎药物，所述抗炎药物为用各种药学上可接受的辅料制备的口服给药剂型、注射给药剂型、外用给药制剂。

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