CN105367530B - 桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C的制备方法及其应用 - Google Patents

桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C的制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，可有效解决快速从桃儿七中制备两个异戊烯基化双黄酮类化合物的问题，方法是，将桃儿七粉碎成粗粉，用乙醇回流提取，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，乙酸乙酯萃取，得桃儿七粗提取物；对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，再高速逆流色谱纯化，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。本发明方法稳定可靠，效率高，时间短，产率高，可快速从桃儿七中分离得到两个异戊烯基化双黄酮类化合物，且纯度高，并经活性试验表明对前列腺癌细胞PC‑3具有细胞毒活性，有效用于制备治疗前列腺癌的药物，经济和社会效益显著。

Description

桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C的制备方法及其应用。
背景技术
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国和欧洲成年男性的恶性肿瘤中发病率最高。而随着人们生活条件逐渐改善，人均寿命不断延长以及饮食结构发生的巨大变化，前列腺癌的发病率和死亡率在我国均有逐渐升高的趋势，且发现时已多属中晚期，约有80％的病人首先被发现有远处转移病灶，然后才确诊为前列腺癌。对于转移性晚期前列腺癌主要治疗方法是内分泌治疗，然而经过几个月的治疗后，对内分泌敏感的前列腺癌常常转变为激素非依赖型前列腺癌，并且对常规治疗方案都产生耐受性。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，为改变晚期前列腺癌治疗的困境，从中草药中寻找高效低毒的抗前列腺癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗前列腺癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
桃儿七是小檗科桃儿七属植物鬼臼(Sinopodophyllum emodi(Wall.)Ying)的干燥根及根茎。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见，不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。关于桃儿七的化学成分研究表明主要含有木脂素和简单取代的黄酮类化合物。双黄酮类化合物首次在该属植物中被发现，该类成分具有重要而广泛的生物活性如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、镇痛、扩张血管、抗凝血等。双黄酮类化合物是由两个黄酮单体经过C-C键或C-O-C键聚合而成，一般与其他类天然产物共存或在植物体内含量较低，且具有复杂的结构，对于该类成分的提取分离仍旧是一项具有挑战性的工作。截止目前，异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C仅仅从植物八角莲(Podophyllum versipelle)的细胞培养物中提取分离得到。具体的提取分离过程为，八角莲的细胞培养物采用甲醇作为溶剂连续回流提取，甲醇提取物采用XAD-2Amberlite大孔树脂柱色谱划分为三个组分，含有目标成分的第二个组分经过反相制备高效液相色谱进行分离，得到的单体化合物最后再经过色谱柱纯化。该提取分离方法涉及到3次色谱操作，分离周期较长，并且由于所用的吸附剂对目标成分的不可逆吸附，会导致样品的回收率降低。高速逆流色谱是一种新型的无固相载体的连续液液分配色谱技术，近年来广泛应用于生命科学、中医药、现代农业等领域活性成分的分离纯化。高 速逆流色谱技术不需要任何固态载体，避免样品与固相载体的作用而产生样品的变性、失活和不可逆吸附等，同时还具有高效、快速、样品制备量大、回收率高、费用低等优点。现有的异戊烯基化双黄酮类化合物的分离方法中，尚未见凝胶柱色谱法和高速逆流色谱法相结合用于桃儿七中异戊烯基化双黄酮单体分离的有关技术报道。据文献报道podoverine B和podoverine C具有抗炎活性，对化学发光抑制的IC50值分别为6.4×10- 6mol/L和8.9×10-5mol/L。本发明所涉及的podoverine B和podoverine C的逆流色谱分离和抗肿瘤活性(前列腺癌)，迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，可有效解决快速从桃儿七中制备两个异戊烯基化双黄酮类化合物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，其分子结构式分别为：
制备方法是：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七3-6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6-12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90-95℃回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1.5-2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量7-12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min-1，每7-10mL为1个流份，共收集50-60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4-6︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100-110℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10-14小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100-200mg，分别加入浓缩物20-50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750-850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25-27℃，高速逆流色谱仪转速750-850r/min，流动相流速2.0-2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
所述方法制备的桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C在制备抗前列腺癌药物中的应用。
本发明方法稳定可靠，效率高，时间短，产率高，可快速从桃儿七中分离得到两个异戊烯基化双黄酮类化合物，且纯度高，并经活性试验表明对前列腺癌细胞PC-3具有细胞毒活性，有效用于制备治疗前列腺癌的药物，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七3kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为1mL/min-1，每7mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压浓缩回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置12小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100mg，分别加入浓缩物50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到 含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25℃，高速逆流色谱仪转速850r/min，流动相流速2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
实施例2
桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七5kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七10倍重量的体积浓度为95％的乙醇95℃回流提取2次，得乙醇提取液，每次2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量10倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min-1，每9mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100℃加热5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各200mg，分别加入浓缩物25倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为800r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为26℃，高速逆流色谱仪转速800r/min，流动相流速2.1mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
实施例3
桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方 法，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七8倍重量的体积浓度为95％的乙醇92℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量8倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6mL/min-1，每10mL为1个流份，共收集50个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各120mg，分别加入浓缩物40倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为27℃，高速逆流色谱仪转速850r/min，流动相流速2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
实施例4
桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七4kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6倍重量的体积浓度为95％的乙醇95℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min-1，每9mL为1个流份，共收集60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比6︰1的二 氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，102℃加热5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置12小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各200mg，分别加入浓缩物50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为27℃，高速逆流色谱仪转速750r/min，流动相流速2.1mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经经高分辨率质谱(HR-ESI-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)、碳谱(13C-NMR)、二维谱(HSQC、HMBC)、CD光谱分析进行了鉴定，分别鉴定为异戊烯基化双黄酮类化合物的podoverine B和podoverine C。活性结果表明podoverine B和podoverine C对前列腺癌细胞PC-3具有细胞毒活性，有关实验资料如下：
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)、高分辨质谱(HR-ESI-MS)及CD光谱技术鉴定，其中：
化合物1，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 685.1557[M+H–H2O]+(calcd for C36H29O14,685.1535)，确定分子式为C36H30O15。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.55(1H,s,5-OH)。四组芳环上质子偶合系统信号：一组1,3,4-二取代苯环δ7.11(1H,d,J＝2.1Hz)，6.89(1H,dd,J＝8.4,2.1Hz)，6.68(1H,d,J＝8.4,Hz)；两组1,2,3,5-四取代苯环δ5.97(2H,s)、6.22(1H,d,J＝1.6Hz)、6.34(1H,d,J＝1.6Hz)；一组1,2,3,4-四取代苯环δ7.13(1H,d,J＝8.4Hz)，7.01(1H,d,J＝8.4Hz)。一组异戊烯基氢信号δ3.28(2H,d,J＝7.0Hz)，5.01(1H,t,J＝7.0Hz)，1.48(3H,s)，1.27(3H,s)。一个甲氧基氢信号δ3.67(3H,s)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)谱中给出36个碳信号，除了一个甲氧基碳信号δ60.1，一组异戊烯基碳信号δ25.5、121.2、131.7、17.3、25.3，剩下30个碳信号中包括2个羰基碳信号δ178.0，187.3；24个芳香碳信号；2个连氧烯碳信号δ157.5、139.0，2个二连氧脂肪碳季碳信号δ100.1、90.2，提示结构中存在黄酮醇母核和2,3,3-三羟基黄烷酮母核片段。在HMBC谱中，由芳香氢质子δ7.13(1H,d,J＝8.4Hz,H-6′)与C-2(δ157.5)，亚甲基质子δ3.28(2H,d,J＝7.0Hz)与C-2′(δ129.3)，甲 氧基质子δ3.67(3H,s)与C-3(δ139.0)的远程相关，结合1,2,3,5-四取代苯环δ6.34(1H,d,J＝1.6Hz)；6.22(1H,d,J＝1.6Hz)的存在，提示结构中存在podoverine A结构单元。由HMBC谱中的芳香氢质子δ6.89(1H,dd,J＝8.4,2.1Hz,6″′)与C-2″(δ100.2)远程相关、一个1,2,3,5-五取代苯环δ5.97(2H,s)，以及两个二连氧脂肪季碳信号δ100.1、90.2，提示结构中另一个黄酮结构单元为2,3,3,5,7,3′,4′-七羟基黄烷酮。将化合物1的13C NMR谱与podoverine A的比较发现，化学位移的变化主要发生在C-3′、C-4′、和C-5′位，即化合物1的C-3′、C-4′向高场约移了5–6个单位，而C-5′向低场约移了2个单位[化合物1：δ138.3(C-3′),142.0(C-4′),115.1(C-5′)；podoverine A：δ144.0(C-3′),147.3(C-4′),113.2(C-5′)]，证明结构单元podoverine A被取代的位点在C-4′位。由二连氧脂肪季碳δ90.2(C-3″)，证明黄烷酮上被取代的位点为C-3″。因此两个黄酮结构单元podoverine A和2,3,3,5,7,3′4′-七羟基黄烷酮通过C-4′-O-C-3″聚合而成。首次通过CD光谱数据分析，确定了结构中C-2″和C-3″的绝对构型。与化合物1四种异构体的计算CD谱比较发现，化合物1的测试CD光谱与2″S,3″R异构体的CD光谱基本一致，确定了C-2″和C-3″的绝对构型分别为S和R。将该化合物1的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表1)。根据以上光谱数据分析，确定该化合物1的结构为podoverine B。
化合物2，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 669.1589[M+H–H2O]+(calcd for C36H29O13,669.1608)，确定分子式为C36H30O14。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示1个与羰基缔合的羟基质子信号δ12.55(1H,s,5-OH)。四组芳环上质子偶合系统信号：一组1,4-二取代苯环δ7.44(2H,dd,J＝6.9,2.1Hz)，6.75(2H,dd,J＝6.9,2.1Hz)；两组1,2,3,5-四取代苯环δ5.99(1H,d,J＝2.1)、5.98(1H,d,J＝2.1)、6.22(1H,d,J＝1.6Hz)、6.34(1H,d,J＝1.6Hz)；一组1,2,3,4-四取代苯环δ7.12(1H,d,J＝8.4Hz)，7.01(1H,d,J＝8.4Hz)。一组异戊烯基氢信号δ3.27(2H,d,J＝6.8Hz)，5.01(1H,t,J＝6.8Hz)，1.48(3H,s)，1.26(3H,s)。一个甲氧基氢信号δ3.66(3H,s)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)谱中给出36个碳信号，除了一个甲氧基碳信号δ60.1，一组异戊烯基碳信号δ25.5、121.2、131.6、17.3、25.2，剩下30个碳信号中包括2个羰基碳信号δ178.0，187.3；24个芳香碳信号；2个连氧烯碳信号δ157.4、139.0，2个二连氧脂肪碳季碳信号δ100.2、90.2，提示结构中存在黄酮醇母核和2,3,3-三羟基黄烷酮母核片段。在HMBC谱中，由芳香氢质子δ7.12(1H,d,J＝8.4Hz,H-6′)与C-2(δ157.4)，亚甲基质子δ3.27(2H,d,J＝6.8Hz)与C-2′(δ129.3)，甲氧基质子δ3.66(3H,s)与C-3(δ139.0)的远程相关，结合1,2,3,5-四取代苯环δ6.34(1H,d,J＝2.1Hz)；6.22(1H,d,J＝2.1Hz)的存在，提示结构中存在podoverine A结构单元。由HMBC谱中的芳香氢质子δ7.44(2H,dd,J＝6.9,2.1Hz,H-2″′,6″′)与C-2″(δ100.2)远程相关、一个1,2,3,5-五取代苯环δ5.99(1H,d,J＝2.1Hz)、5.97(1H,d,J＝2.1Hz)，以及两个二连氧脂肪季碳信号δ100.5、90.6，提示结构中另一个黄酮结构单元为2,3,3,5,7,4′-六羟基黄 烷酮。将化合物2的13C NMR谱与podoverine A的比较发现，化学位移的变化主要发生在C-3′、C-4′、和C-5′位，即化合物1的C-3′、C-4′向高场约移了5–6个单位，而C-5′向低场约移了2个单位[化合物1：δ138.3(C-3′),142.0(C-4′),115.1(C-5′)；podoverine A：δ144.0(C-3′),147.3(C-4′),113.2(C-5′)]，证明结构单元podoverine A被取代的位点在C-4′位。由二连氧脂肪季碳δ90.2(C-3″)，证明黄烷酮上被取代的位点为C-3″。因此两个黄酮结构单元podoverine A和2,3,3,5,7,4′-六羟基黄烷酮通过C-4′-O-C-3″聚合而成。化合物2的CD光谱数据与化合物1基本一致，确定了C-2″和C-3″的绝对构型分别为S和R。将该化合物的1H NMR、13C NMR信号通过HSQC、HMBC谱进行归属(见表1)。根据以上光谱数据分析，确定该化合物2的结构为podoverine C。
表1.化合物1和2的1H NMR和13C NMR光谱数据
本发明制备的异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C经试验，对人前列腺癌细胞株PC-3具有细胞毒活性，有关实验资料如下：
1.实验材料
人前列腺癌细胞株(PC-3)由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
PC-3细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37C、5％CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4–5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37C、5％CO2温箱中培养。2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/mL)MTT溶液(培养基配置)。37C孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑 制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人前列腺癌细胞株(PC-3)对podoverine B和podoverine C进行细胞毒活性测试，结果见表2：
表2.化合物I-II对PC-3细胞的细胞毒活性
化合物 IC50(μM)
podoverine B 26.5±2.9
podoverine C 60.2±4.8
本发明首次采用凝胶柱色谱法富集目标成分，再用高速逆流色谱法分离纯化，建立了桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的快速制备方法。该方法稳定可靠、效率高，时间短，样品回收率高，得到的目标成分纯度高。同时发现podoverine B和podoverine C对人前列腺癌细胞(PC-3)具有细胞毒活性，具有制备临床上抗前列腺癌药物的应用前景。本发明为桃儿七药材的深入开发和利用奠定了理论基础，经济和社会效益显著。

Claims (5)

1.一种桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B(1)和podoverineC(2)的制备方法，其特征是，分子结构式分别为：
制备方法是：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七3-6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6-12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90-95℃回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1.5-2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量7-12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min-1，每7-10mL为1个流份，共收集50-60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4-6︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100-110℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10-14小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100-200mg，分别加入浓缩物20-50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750-850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25-27℃，高速逆流色谱仪转速750-850r/min，流动相流速2.0-2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
2.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverine C的制备方法，其特征是，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七3kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为1mL/min-1，每7mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置12小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100mg，分别加入浓缩物50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25℃，高速逆流色谱仪转速850r/min，流动相流速2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverine C。
3.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverine C的制备方法，其特征是，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七5kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七10倍重量的体积浓度为95％的乙醇95℃回流提取2次，得乙醇提取液，每次2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量10倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min-1，每9mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100℃加热5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各200mg，分别加入浓缩物25倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为800r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为26℃，高速逆流色谱仪转速800r/min，流动相流速2.1mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
4.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverine C的制备方法，其特征是，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七8倍重量的体积浓度为95％的乙醇92℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量8倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6mL/min-1，每10mL为1个流份，共收集50个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热4min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各120mg，分别加入浓缩物40倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为27℃，高速逆流色谱仪转速850r/min，流动相流速2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
5.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverine C的制备方法，其特征是，由以下方法实现：
1)、粗提取物的制备：将桃儿七4kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6倍重量的体积浓度为95％的乙醇95℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；
2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min-1，每9mL为1个流份，共收集60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比6︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，102℃加热5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；
3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置12小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各200mg，分别加入浓缩物50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为27℃，高速逆流色谱仪转速750r/min，流动相流速2.1mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。
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