CN105713005B - 一种水线草中耳草酮a的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，包括将水线草用醇溶剂进行提取，分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取；浓缩得精提浸膏；甲醇超声溶解，过滤，滤液经正相硅胶柱层析，然后采用柱层析分离法或制备液相分离法或刮板法进一步纯化，得到耳草酮A。本发明方法分离水线草中耳草酮A成分的产率高，方法简便快捷，纯度高；所得耳草酮A可用于制成抗肿瘤的辅助药物，为研发抗癌药物提供一定的应用价值。

Description

一种水线草中耳草酮A的提取分离方法

技术领域

本发明涉及中药提取分离技术领域，具体涉及一种水线草中耳草酮A的提取分离方法。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命的的重大疾病。据统计，恶性肿瘤已成为城乡居民的首要死因，而且呈现年轻化合逐年上升趋势，全国癌症的平均5年存活率仅为25％左右，可见肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤的主要治疗手段，虽然目前已经开发了数十种抗肿瘤药物，有效延长了患者生命或者提高了患者生存质量，但是肿瘤的药物研究还是面临着巨大挑战，抗癌药物多有细胞毒药物，副作用多；而中药有几千年的人体毒性实验的基础，从天然产物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性化合物一直是研究热点。

水线草，又名伞房花耳草，为茜草科一年生草本植物，耳草属植物水线草Hedyotiscorymbosa(L.)的干燥全草。苦、寒，入肺、大肠二经；具有清热解毒之功效，常用于烫伤，与常山、马鞭草混合煎服能治疟疾。目前临床上，水线草的主要用途是与白花蛇舌草混用治疗癌症(南京新医学院.中药大辞典.上海.上海科学技术出版社,1977:535.)，但其抗肿瘤物质基础尚不明确。

水线草中主要含的化学成分为环烯醚萜及其苷类和三萜酸类。耳草酮A、鸡屎藤苷甲酯(鸡矢藤苷甲酯)都为环烯醚萜类，从水线草中分离得到，且都不存在于白花蛇舌草中。2007年，研究者首次从水线草分离得到耳草酮A，现代研究从水线草中分离的耳草酮对P-多蛋白糖介导的多向性抗药的人体肝细胞瘤逆转时发现耳草酮能够明显地选择性地抑制R-HepG2和HepG2增殖，而且对正常的人体肝细胞WRL-68没有影响，表明耳草酮A有很好的抗肿瘤活性(Grace Gar-Lee Yue,Julia Kin-Ming Lee,Ling Cheng,Ben Chung-Lap Chan,LeiJiang,Kwok-Pui Fung,Ping-Chung Leung and Clara Bik-San Lau.(2012).Reversal ofP-glycoprotein-mediated multidrug resistance in human hepatoma cells byhedyotiscone A,a compound isolated from Hedyotis corymbosa.Xenobiotica,42(6):562-570.)。

目前尚未检索到水线草中耳草酮A提取分离方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种水线草中耳草酮A的提取分离方法。

为实现本发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，包括以下步骤：

1)将水线草用醇溶剂进行提取，得到水线草醇提物；

2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取；取乙酸乙酯萃取部位，浓缩得精提浸膏；

3)将所述精提浸膏用甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经正相硅胶柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液；所述洗脱剂为石油醚-乙酸乙酯洗脱剂，和二氯甲烷-石油醚洗脱剂；

4)将步骤3)所得洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法或刮板法进一步纯化，制得耳草酮A；

所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；

或者所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液经ODS反相柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；

所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液进制备液相，以甲醇水为流动相进行洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；所述制备液相采用LC-3000高效液相Thermo C18(250×21.2mm)制备柱；

所述刮板法包括将步骤3)所得洗脱液通过薄层硅胶板分离，制得耳草酮A

上述水线草中耳草酮A的提取分离方法，其中：

步骤1)中优选先将水线草粉碎再进行提取，优选为60-80目；所述提取温度优选为60-80℃；所述醇溶剂为乙醇或甲醇溶剂，优选为甲醇溶剂；所述醇溶剂的浓度为50％-70％(质量浓度)，优选70％(质量浓度)；更优选为70％的甲醇(质量浓度)；所述提取方法为回流提取、超声提取、浸渍提取等方法中的一种或几种；优选为回流提取；所述醇溶剂的用量为水仙草重量的5-15倍，优选为10倍。

为尽量将水仙草中耳草酮A提取出来，步骤1)优选包括将水线草粉碎至60-80目，加入5-15倍重量的70％甲醇(质量浓度)，搅匀，先超声提取0.5-1h，然后回流提取1-3h，提取温度为60-80℃；过滤；滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取；共提取三次，合并滤液，减压浓缩得到水线草醇提物(即粗提浸膏)。

步骤2)所述石油醚萃取优选为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草醇提物与石油醚的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留水部位。

步骤2)所述正丁醇萃取优选为将所述水部位部位用正丁醇萃取3-5次，所述水部位与正丁醇的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留正丁醇萃取部位。

步骤2)所述乙酸乙酯萃取优选为将所述正丁醇萃取部位用乙酸乙酯萃取3-5次，所述正丁醇萃取部位与乙酸乙酯的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留乙酸乙酯部位。

最后取乙酸乙酯萃取部位，浓缩(例如减压浓缩)得精提浸膏。

按上述方法萃取处理后，最大限度地去除了所述水线草醇提物中杂质。

步骤3)优选将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，再进行过滤。

步骤3)所述梯度洗脱包括以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，分别以石油醚-乙酸乙酯(体积比)为7:1，5:1，2:1进行第一次梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯为5:1的洗脱液；再以石油醚-二氯甲烷为洗脱剂，分别以石油醚-二氯甲烷(体积比)为2:1，1:1，1:2进行第二次梯度洗脱，收集石油醚-二氯甲烷1:1的洗脱液。

本发明所述第二次梯度洗脱是指收集第一次洗脱液，硅胶拌样经正相硅胶柱层析，进行第二次洗脱。

步骤3)优选采用100-200目的正相硅胶柱层析。

本发明所述ODS反相柱是指十八烷基硅烷填料反相柱。

步骤4)所述制备液相分离法为先将步骤3)所得洗脱液经0.22μm微孔滤膜过滤，再取滤液进制备液相。所述洗脱剂为65％甲醇水。所述制备液相使用LC-3000高效液相ThermoC18(250×21.2mm)制备柱。

具体地，步骤4)所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进制备液相，以65％甲醇水为洗脱剂等度洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250×21.2mm)制备柱柱。

具体地，所述刮板法包括将步骤3)第二次梯度洗脱所得石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液浓缩，通过在薄层硅胶板上点样，进行洗脱定量，以正己烷:乙酸乙酯＝2:1为展开剂展开，置紫外光灯(365nm)下检视定位后，将在硬板薄层板上样品区带的吸附剂定量刮下，用溶剂进行洗脱、定量，得到化合物耳草酮A。

较佳地，本发明所述水线草中耳草酮A的提取分离方法，包括以下步骤：

1)将水线草粉碎至60-80目，加入5-15倍重量的70％甲醇，搅匀，先超声提取0.5-1h，然后回流提取1-3h，提取温度为60-80℃；过滤；滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取；共提取三次，合并滤液，减压浓缩，得到水线草醇提物；

2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取；取乙酸乙酯萃取部位，浓缩得精提浸膏；

所述石油醚萃取为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草醇提物与石油醚的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留水部位；

所述正丁醇萃取优选为将所述水部位用正丁醇萃取3-5次，所述水部位与正丁醇的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留正丁醇萃取部位；

所述乙酸乙酯萃取为将所述正丁醇萃取部位用乙酸乙酯萃取3-5次，所述正丁醇萃取部位与乙酸乙酯的用量(重量)比例为1-3∶4-6；萃取后保留乙酸乙酯萃取部位；

3)将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经100-200目正相硅胶柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液；

具体地，所述梯度洗脱包括以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，分别以石油醚-乙酸乙酯(体积比)为7:1，5:1，2:1进行第一次梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯为5:1的洗脱液；再以石油醚-二氯甲烷为洗脱剂，分别以石油醚-二氯甲烷(体积比)为2:1，1:1，1:2进行第二次梯度洗脱，收集石油醚-二氯甲烷1:1的洗脱液；

4)将步骤3)所得第二次梯度洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法或刮板法进一步纯化，得到耳草酮A；

所述柱层析分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；或者所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液经ODS反相柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；

所述制备液相分离法包括将步骤3)所得第二次梯度洗脱液经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进制备液相，以65％甲醇水为洗脱剂等度洗脱，制得耳草酮A；所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250×21.2mm)制备柱。

所述刮板法包括将步骤3)第二次梯度洗脱所得石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液浓缩，通过在薄层硅胶板上点样，进行洗脱定量，以正己烷:乙酸乙酯＝2:1为展开剂展开，置紫外光灯(365nm)下检视定位后，将在硬板薄层板上样品区带的吸附剂定量刮下，用溶剂进行洗脱、定量，制得耳草酮A。

本发明所述耳草酮A结构如下式(I)所示：

本发明所述水线草，又名伞房花耳草，为茜草科一年生草本植物，耳草属植物水线草Hedyotis corymbosa(L.)的干燥全草。

本发明有益效果

本发明方法分离水线草中耳草酮A成分的产率高，方法简便快捷，纯度高；所得耳草酮A可用于制成抗肿瘤的辅助药物，为研发抗癌药物提供一定的应用价值。

附图说明

图1为耳草酮A紫外吸收图。

图2为耳草酮A质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。

实施例1

本实施例提供一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，包括以下步骤：

1)称取粉碎至60-80目的水线草10kg，加入100L体积的70％甲醇(质量浓度)，搅匀，先超声提取30min，然后80℃下回流提取1h，过滤；滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取；共提取三次，合并滤液，减压浓缩得到水线草醇提物(粗提浸膏)0.21kg。

2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取；取乙酸乙酯萃取部位，减压浓缩，得精提浸膏0.674kg。

所述石油醚萃取为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3次，所述水线草醇提物与石油醚的重量比例为1∶4；萃取后保留水部位；

所述正丁醇萃取为将所述水部位用正丁醇萃取3次，所述水部位与正丁醇的用量(重量)比例为1∶4；萃取后保留正丁醇萃取部位；

所述乙酸乙酯萃取为将所述正丁醇萃取部位用乙酸乙酯萃取3次，所述正丁醇萃取部位与乙酸乙酯的用量(重量)比例为1∶4；萃取后保留乙酸乙酯萃取部位；

3)将该精提浸膏用3倍重量的甲醇超声溶解，过滤，去除滤渣，滤液硅胶拌样经100-200目正相硅胶柱。

以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，分别以石油醚-乙酸乙酯(体积比)为7:1，5:1，2:1进行第一次梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯为5:1的洗脱液；

再以石油醚-二氯甲烷为洗脱剂，分别以石油醚-二氯甲烷(体积比)为2:1，1:1，1:2进行第二次梯度洗脱，收集石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液。

4)将步骤3)第二次梯度洗脱所得石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液采用葡聚糖凝胶(sephadex LH-20)柱层析分离纯化，用甲醇为洗脱剂进行洗脱；

经TLC检测，以正己烷:乙酸乙酯＝2:1为展开剂展开，置紫外光灯(365nm)下检视与标准品一致显相同的蓝色荧光斑点，合并相同组份，有晶体析出，过滤经重结晶后制得该化合物即耳草酮A 1.00g。

实施例2

本实施例提供一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，与实施例1的区别在于，步骤4)采用制备液相分离法，即将步骤3)第二次梯度洗脱所得石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进制备液相，以65％甲醇水为洗脱剂等度洗脱，使用LC-3000高效液相Thermo C18(250×21.2mm)制备柱柱。以标准品出峰时间比较接样，收集洗脱液，最终制得化合物耳草酮A 1.16g。

实施例3

本实施例提供一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，与实施例1的区别在于，步骤4)采用刮板法，即将步骤3)第二次梯度洗脱所得二氯甲烷-石油醚为1:1的洗脱液浓缩至少量，通过在薄层硅胶板上点样，进行洗脱定量，正己烷:乙酸乙酯＝2:1为展开剂展开，置紫外光灯(365nm)下检视定位后，可用刀片在硬板薄层板上样品区带的吸附剂定量刮下，再用合适的溶剂进行洗脱、定量，得到化合物耳草酮A 52mg。

实施例4

本实施例提供一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，与实施例1的区别在于，步骤4)所述柱层析分离法包括将步骤3)所得二氯甲烷-石油醚为1:1的洗脱液经ODS反相柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液；制得化合物耳草酮A 52mg。

实验例1

以实施例1制得的耳草酮A为样品，经波谱解析和化学方法确定其化学结构式如式(I)所示；并且测得其纯度为99.96％(面积归一法)。图1为耳草酮A紫外吸收图；图2为耳草酮A质谱图。

核磁共振(NMR)

¹H NMR(400MHz，CD3OD)：δ7.6(d，J＝9.5Hz，1H，H-4)，δ6.80(s，J＝2Hz，1H，H-5)，δ6.23(d，J＝9.5Hz，1H，H-3)，δ5.44(t，J＝9.0Hz，1H，H-8)，δ4.55–4.53 5.21(s，1H，H-2‘)，δ4.90(t，J＝1.2Hz，1H，H2’)，δ3.95(s，3H，6-OCH3)，δ3.55(dd，J＝9.8/16，1H，H9-a)，δ3.22(dd dd，J＝9.8/16，1H，H9-b)，δ1.81(s，3H，H-3’)。

¹³C-NMR(400MHz，CD3OD)：δ164.1(C-2)，δ153.1(C-7)，δ148.1(C-9)，δ145.2(C-4)，δ142.1(C-1)，δ141.2(C-6)，δ113.2(C-8)，δ115.5(C-2b)，δ113.4(C-10)，δ115.5(C-3)，δ108.8(C-5)，δ88.7(C-2’)，δ54.2(OCH3)，δ33.8(C-3’)，δ16.2(C-3”)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种水线草中耳草酮A的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将水线草粉碎至60-80目，加入5-15倍重量的70％甲醇，搅匀，先超声提取0.5-1h，然后回流提取1-3h，提取温度为60-80℃；过滤；滤渣按上述方法再次进行超声提取、回流提取；共提取三次，合并滤液，减压浓缩，得到水线草醇提物；

2)将所得水线草醇提物分别用石油醚、正丁醇、乙酸乙酯反复多次萃取；取乙酸乙酯萃取部位，浓缩得精提浸膏；

所述石油醚萃取为将步骤1)所得水线草醇提物用石油醚萃取3-5次，所述水线草醇提物与石油醚的重量比例为1-3∶4-6；萃取后保留水部位；

所述正丁醇萃取为将所述水部位用正丁醇萃取3-5次，所述水部位与正丁醇的重量比例为1-3∶4-6；萃取后保留正丁醇萃取部位；

所述乙酸乙酯萃取为将所述正丁醇萃取部位用乙酸乙酯萃取3-5次，所述正丁醇萃取部位与乙酸乙酯的重量比例为1-3∶4-6；萃取后保留乙酸乙酯萃取部位；

3)将所述精提浸膏用3-5倍重量的甲醇超声溶解，过滤，滤液硅胶拌样后经100-200目正相硅胶柱层析，用洗脱剂进行梯度洗脱，收集洗脱液；

具体地，所述梯度洗脱包括以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂，分别以石油醚-乙酸乙酯体积比为7:1，5:1，2:1进行第一次梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯为5:1的洗脱液；再以石油醚-二氯甲烷为洗脱剂，分别以石油醚-二氯甲烷体积比为2:1，1:1，1:2进行第二次梯度洗脱，收集石油醚-二氯甲烷1:1的洗脱液；

4)将步骤3)所得第二次梯度洗脱液采用柱层析分离法或制备液相分离法或刮板法进一步纯化，制得耳草酮A；

所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液采用葡聚糖凝胶柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；

或者所述柱层析分离法包括将步骤3)所得洗脱液经ODS反相柱层析，以甲醇作为洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，制得耳草酮A；

所述制备液相分离法包括将步骤3)所得洗脱液经0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进制备液相，以65％甲醇水为洗脱剂等度洗脱，制得耳草酮A；所述制备液相使用LC-3000高效液相Thermo C18(250×21.2mm)制备柱；

所述刮板法包括将步骤3)第二次梯度洗脱所得石油醚-二氯甲烷为1:1的洗脱液浓缩，通过在薄层硅胶板上点样，进行洗脱定量，以正己烷:乙酸乙酯＝2:1为展开剂展开，置紫外光灯下检视定位后，将在硬板薄层板上样品区带的吸附剂定量刮下，用溶剂进行洗脱、定量，制得化合物耳草酮。