CN104857245B - 紫萼玉簪花总皂苷的制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了紫玉簪花总皂苷的制备方法和应用，本发明属于医药技术领域。本发明要解决现有提取紫玉簪总皂苷方法存在得量较少且皂苷的纯度不高的技术问题。本发明的方法如下：一、取新鲜紫玉簪花，清洗后至于磨浆机中，加入乙醇，升温至50℃研磨，再过滤或者离心，挥去乙醇，浓缩，得到浸膏；二、对AB8大孔树脂预处理，装入树脂柱，上样，先用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性，再用20％乙醇洗脱除杂，用50％～70％乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液后回收溶剂，蒸干。本发明中紫玉簪花总皂苷在制备抗肿瘤药物及作为天然来源的抗氧化剂在保健食品和化妆品中的应用。本发明紫玉簪花的总皂苷纯度高，在60％以上。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域；具体涉及紫萼玉簪花总皂苷的制备新方法。
背景技术
紫萼玉簪(Hosta ventricosa Stearn)为百合科玉簪属多年生草本植物。《全国中药汇编》记载紫玉簪具有散瘀止痛、解毒功效，可治跌打损伤、胃痛、咽喉肿痛等疾病。化学成分主要是甾体皂苷、黄酮类(山萘酚苷)、苯丙素类(7-羟基香豆素)等。我们前期研究发现紫萼玉簪花具有抗肿瘤作用。经过MTT法跟踪筛选发现，总甾体皂苷是紫萼玉簪抗肿瘤的活性部位，且增殖抑制作用显著；同时发现其具有良好的抗氧化作用，是一种非常具有开发前景的肿瘤预防和治疗药物，同时也可作为保健品开发应用。但目前紫萼玉簪总甾体皂苷的制备方法皂苷得率和纯度都很低，制约了其深度开发和应用。本发明主要是建立了紫萼玉簪总甾体皂苷的高效、高纯度、低成本的制备工艺，为后续药品和保健品的研发奠定基础。
皂苷的提取方法有许多种，常用的有浸渍法、渗滤法、回流法、超声提取法等。浸渍法、渗滤法操作简单，成本低廉，但耗时长。回流法提取过程中皂苷类成分长期受热，容易破坏皂苷结构。超声法具有提取率高，加快细胞内有效成分的溶出，缩短提取时间，温度低的特点，但限于提取器的容积不适合工业化大生产。文献报道采用超声提取，硅胶柱色谱结合D101大孔树脂纯化紫萼玉簪花总皂苷，提取方法仅限于实验室研究，纯化过程繁琐，总皂苷纯度不高。
发明内容
本发明要解决现有提取紫萼玉簪总皂苷方法存在得率较少且皂苷的纯度不高的技术问题。
本发明的提供了一种紫萼玉簪花总皂苷的制备方法。
本发明还提供了紫萼玉簪花总皂苷的应用。
本发明紫萼玉簪花总皂苷提取方法高效、省时、节能、经济，采用AB8大孔树脂进行纯化，获得精制总皂苷。采用MTT法，选择人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549四种肿瘤细胞进行体外活性筛选，从而进行药效学评价。采用紫外分光光度法，评价紫萼玉簪花总皂苷对羟基自由基体系、DPPH自由基体系的体外抗氧化活性。
本发明中紫萼玉簪花总皂苷的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取新鲜紫萼玉簪花，清洗后至于磨浆机中，按紫萼玉簪花与乙醇质量比为1:10～15配比加入体积分数大于等于85％的乙醇，升温至50℃研磨10min～15min，然后过滤或者离心，提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得到浸膏。浸膏用热水分散成真溶液后用1～3倍的水饱和正丁醇萃取5～8次，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇萃取物。
步骤二、AB8大孔树脂进行预处理，然后装入树脂柱，步骤一得到的正丁醇萃取物用热水分散成真溶液后上样，先用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性，再用体积分数为30％乙醇洗脱除杂；然后用体积分数为70％的乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱处理，洗脱液的用量为6～8倍树脂柱体积，洗脱流速控制在2BV/h，收集乙醇洗脱液后回收溶剂，蒸干，即得到紫萼玉簪花总皂苷。
本发明采用热磨，工艺简单，热磨加快了纤维的断裂，而且原料研磨的更加细小，有利于有效成分的溶出。
本发明方法获得紫萼玉簪花总皂苷的得率在5.0％以上。
本发明方法获得紫萼玉簪花的总皂苷纯度高，在60％以上。
采用MTT法实验结果显示紫萼玉簪花总皂苷进对以人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞HepG2、人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549有较强的增殖抑制作用，IC50分别为26.47、21.94、20.54和22.95μg/L，紫萼玉簪花总皂苷具有抗肿瘤活性。
采用紫外分光光度法，通过与Vc对比，评价紫萼玉簪花总皂苷对羟基自由基体系和DPPH自由基体系的体外抗氧化活性。实验结果表明，紫萼玉簪花总皂苷具有清除羟基自由基和DPPH自由基的能力，且清除能力与样液浓度呈量效关系，其IC50分别为4.67mg/mL，0.09mg/mL。抗氧化作用与紫萼玉簪花总皂苷含量呈正相关，紫萼玉簪花总皂苷具有抗氧化活性。
本发明的方法简单，操作方便。
本发明紫玉簪花的总皂苷可以制成片剂、冲剂、胶囊剂等口服制剂用于癌症治疗。此外，作为天然来源的抗氧化剂也可用于保健食品和化妆品。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中紫萼玉簪花总皂苷的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取新鲜紫萼玉簪花，清洗后至于磨浆机中，按紫萼玉簪花与乙醇质量比为1:10～15配比加入体积分数大于等于85％的乙醇，升温至50℃研磨10min～15min，然后过滤或者离心，提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得到浸膏。浸膏用热水分散成真溶液后用1～3倍的水饱和正丁醇萃取5～8次，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇萃取物。
步骤二、对AB8大孔树脂进行预处理，然后装入树脂柱，步骤一得到的正丁醇萃取物用热水分散成真溶液后上样，先用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性，再用体积分数为30％乙醇洗脱除杂；然后用体积分数为70％的乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱处理，洗脱液的用量为6～8倍树脂柱体积，洗脱流速控制在2BV/h，收集乙醇洗脱液后回收溶剂，蒸干，即得到紫萼玉簪花总皂苷。
对AB8大孔树脂进行预处理(取大孔树脂适量，加入5倍量乙醇浸泡24h，充分溶胀。装柱后用蒸馏水冲洗至无白色浑浊现象为止。5％HCL冲至流出液PH为3，静置2h，蒸馏水洗至中性，再用5％NaOH冲至流出液PH为9，静置2h，蒸馏水洗至中性，备用。)
采用下述实验验证发明效果
对比例1：取30g新鲜紫萼玉簪花，干燥后，粉碎，加入乙醇300mL放入50℃体积分数等于80％的乙醇中浸提50min，过滤，浓缩乙醇，得到浸膏。浸膏用热水分散成真溶液后用1～3倍的水饱和正丁醇萃取8次，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇萃取物。
对比例2：取30g新鲜紫萼玉簪花，干燥后，粉碎，加入乙醇300mL放入50℃体积分数等于80％的乙醇超声提取50min，过滤，浓缩乙醇，得到浸膏。浸膏用热水分散成真溶液后用1～3倍的水饱和正丁醇萃取8次，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇萃取物。
表1不同提取方法对正丁醇萃取物得率和皂苷纯度的影响
表2不同提取方法对紫萼玉簪花总皂苷得率和纯度的影响
由表1和2可知，本实施方式方法产品的得率高，产品纯度高。
取6根(内径为1.5cm、高20cm)同一型号的树脂柱，分别取预处理树脂15g装柱。按药材用量与树脂量比1：30取已知含量的紫萼玉簪花总皂苷溶液上样，以1.0mL/min的流速上样，过夜后蒸馏水及30％乙醇洗脱除杂，再用相当于树脂保留体积8倍量的50％、60％、70％、80％、95％乙醇溶液洗脱，以相同的流速洗脱，收集洗脱液，定容于100ml容量瓶中，测定皂苷含量。精密量取50ml洗脱液减压回收乙醇并置浓缩液于蒸发皿中干燥恒重，计算纯度，结果见表3。综合干膏质量、皂苷转移率和干膏纯度三个方面，选择70％乙醇溶液作为洗脱溶剂较为适宜。
表3洗脱溶剂的筛选
由表3可知，采用70％乙醇溶液洗脱得到紫萼玉簪花总皂苷的纯度高。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用HPD826大孔树脂替换步骤二所述的AB8大孔树脂。其它步骤和参数与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：用D101大孔树脂替换步骤二所述的AB8大孔树脂。其它步骤和参数与具体实施方式一相同。
采用下述实验验证发明效果
称取预处理好的AB-8、D101、HPD100、H103、HPD826、NKA-96种型号的大孔吸附树脂各15g，放于100mL烧杯中，分别加入40mL紫萼玉簪花总皂苷溶液(总皂苷的含量为6.26mg/mL)，放入振摇器中振荡8h后，抽滤，收集滤液，用紫外测定滤液中皂苷质量，此为M残。再将树脂装入层析柱(内径为1.5cm、高20cm)中，径高比1:9，并用3BV蒸馏水除杂，流速2～3BV/h，收集水液，测定皂苷质量，此为M水。100mL(相当于树脂保留体积8倍量)70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液，定容于100ml容量瓶中，测定皂苷含量，此为M洗脱，精密量取50ml洗脱液减压回收乙醇并置浓缩液于蒸发皿中干燥恒重，精密称取干膏重量，计算干膏总皂苷含量，见表4。由图可知AB8型大孔吸附树脂较其他5种树脂分离效果更好，选择AB8型大孔吸附树脂对紫萼玉簪花总皂苷进行纯化。
表4大孔吸附树脂型号筛选结果
由表4可知，本发明采用AB8大孔吸附树脂产品的纯度高。
具体实施方式四：采用氮唑盐还原法(MTT法)考察紫萼玉簪花总皂苷(纯度62.50％)对人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞HepG2，人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549的体外抗肿瘤活性。
细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7，人肝癌细胞HepG2，人胃癌细胞SGC-7901和人肺癌细胞A549购自上海和元生物技术有限公司。
MTT实验：用0.25％胰蛋白酶消化对数生长期的3种肿瘤细胞后，加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液将其稀释成为5×104个/mL的细胞悬液，接种于96孔培养板中以每孔100μL的体积，置于CO2培养箱中(5％，37℃)培养24h后，每孔加入药液100μL使总液体量为200μL，每个剂量设6个平行孔，纯化紫萼玉簪花总皂苷的浓度分别为3.125、6.25、12.5、25、50、100、200μg/L，空白对照组加入相同体积的RPMI 1640培养液，置于CO2培养箱中(5％，37℃)培养48h后，弃去上清液，每孔再加入MTT液(0.5mg/mL)100μL，置于37℃培养4h后弃上清液，每孔加入DMSO150μL，在微型振荡器上振荡5min后，用酶标仪在检测波长570nm测定吸光度OD570nm值，并计算IC50，检测结果如表5所示。紫萼玉簪花总皂苷作用于肿瘤细胞48h后，3.125μmol/L～50μmol/L浓度下OD值显著降低，随着紫萼玉簪花总皂苷浓度的增加，细胞的生长抑制率逐渐升高，与空白对照组比较具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，紫萼玉簪花总皂苷对肿瘤细胞MCF-7、SGC-7901、HepG2和A549有较强的抑制作用，经计算其IC50分别为26.47μg/L，20.54μg/L，21.94μg/L，22.95μg/L。紫萼玉簪花总皂苷具有抗肿瘤作用。
表5 MTT法测定紫萼玉簪花总皂苷对肿瘤细胞生长抑制率(±s，n＝6)
*与空白组比较p<0.05，**与空白组比较p<0.01
具体实施方式五：将紫萼玉簪花总皂苷配置成浓度为45.0mg/mL的样液，采用紫外分光光度法，评价紫萼玉簪花总皂苷对羟基自由基体系、DPPH自由基体系的体外抗氧化活性。
按羟基自由基试剂盒所标明的操作方法，分别把样品溶液稀释成9.0mg/mL、7.2mg/mL、5.4mg/mL、4.5mg/mL、3.6mg/mL、2.25mg/mL进行实验，计算样品的清除率。清除率(％)＝(A0﹣As)/A0×100％其中A0是对照管吸光度；As是测定管吸光度。结果见表6。实验结果表明，紫玉簪花总皂苷具有清除羟基自由基，且清除能力与样液浓度呈量效关系，IC50为4.67mg/mL，紫玉簪花总皂苷具有抗羟基自由基活性。
表6紫萼玉簪花总皂苷清除羟基自由基抑制率
按抑制与产生DPPH自由基的操作方法，分别把样品溶液稀释成0.18mg/mL、0.135mg/mL、0.08926mg/mL、0.045mg/mL、0.02239mg/mL、0.011195mg/mL进行实验。计算样品的抑制DPPH自由基能力。清除率(％)＝(A0﹣As)/A0×100％。其中A0是对照管吸光度；As是测定管吸光度。结果见表7。实验结果表明，紫玉簪花总皂苷具有清除DPPH自由基的能力，且清除能力与样液浓度呈量效关系，IC50为0.10mg/mL，紫玉簪花总皂苷具有抗DPPH自由基的活性。
表7紫玉簪花总皂苷清除DPPH自由基抑制率
Claims (2)
1.紫玉簪花总皂苷的制备方法，其特征在于紫玉簪花总皂苷的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、取新鲜紫萼玉簪花，清洗后至于磨浆机中，按紫萼玉簪花与乙醇质量比为1:10～15配比加入体积分数大于等于85％的乙醇，升温至50℃研磨10min～15min，然后过滤或者离心，提取3次，合并乙醇提取液，浓缩得到浸膏；浸膏用热水分散成真溶液后用1～3倍的水饱和正丁醇萃取5～8次，合并正丁醇萃取液，浓缩得到正丁醇萃取物；
步骤二、AB8大孔树脂进行预处理，然后装入树脂柱，步骤一得到的正丁醇萃取物用热水分散成真溶液后上样，先用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性，再用体积分数为30％乙醇洗脱除杂；然后用体积分数为70％的乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱处理，洗脱液的用量为6～8倍树脂柱体积，洗脱流速控制在2BV/h，收集乙醇洗脱液后回收溶剂，蒸干，即得到紫萼玉簪花总皂苷。
2.根据权利要求1所述的紫玉簪花总皂苷的制备方法，其特征在于步骤二中热水的温度为70～80℃。
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