CN105616470A - 一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，包括以下步骤：褐参酶解、醇提、离心、褐参多糖提取、褐参皂苷提取，将多糖和皂苷同时提取和分离，得到的皂苷的抗肿瘤活性比已有的皂苷提取物显著提高。提取过程中，将醇提法与水提法中得到的沉淀合并，使得药渣中的有效成分充分保留，提高了有效成分多糖的提取率。

Description

一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法
技术领域
本发明涉及褐参的提取方法，具体涉及一种从褐参中同时和分离提取皂苷和多糖的方法。
背景技术
人参为珍贵的药用植物，能够保护心脏、调节血糖血压、增强免疫力等。人参皂苷和人参多糖被认为人参主要有效成分。人参皂苷根据皂苷元的不同被分为原人参二醇类皂苷、原人参三醇类皂苷及齐墩果酸类皂苷，对中枢系统、内分泌系统等都表现出一定的调节效果。人参多糖组成复杂，结构多样，根据单糖组成不同，可将人参多糖主要分为人参中性糖和人参酸性果胶两大类。多糖作为人参的有效活性成分，具有多样的生物活性，如抗肿瘤、免疫调节、抗辐射、降血糖等。因此，对于人参中皂苷、多糖的提取研究意义深远。它将为阐明人参的生物活性与药理作用，进一步研究人参药理作用机制奠定良好的基础。
CN101780128A公开了一种褐参的制备方法，将鲜人参、生晒参、红参等粗原料经β-D-葡萄糖苷酶水解，在合适的条件下进行高温蒸汽处理，和加热烘干，获得的人参制品。在酶解和高温蒸汽处理过程中，人参中Rg1，Re均脱糖转化为Rg3，Rh2等稀有皂苷，因此该褐参制品具有稀有皂苷Rg3，Rh2等含量高的特点。稀有皂苷Rg3，Rh2等具有抗疲劳、舒张血管、提高免疫力和抗肿瘤等药理作用[程慧,药物评价研究,2010,33(4)]。因此，制备和转化高人参皂苷Rg3、Rh2含量的褐参深加工产品具有重要的意义。
褐参的提取物方面，目前仅褐参乙醇提取物有提取和应用的报道，CN104523789A，由于褐参中具有较高含量的稀有皂苷Rg3、Rh2等，其乙醇提取物和未处理人参的乙醇提取物相比，抗肿瘤活性显著提高。
发明内容
本发明提供一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，该方法可以同时提取皂苷和多糖，且皂苷抗肿瘤活性提高，成本低，对仪器设备要求低，能够使褐参的活性成分得到充分的开发和利用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）褐参酶解：取褐参样品，粉碎，过筛，添加α-淀粉酶酶解，添加量为0.1-0.5微升/1克褐参；
（2）醇提：酶解后降温，加入乙醇水溶液，提取2～5次，合并提取液，剩余药渣；
（3）离心：提取液冷却，静置，离心，得到滤液和固形物料渣；
（4）褐参多糖提取：将步骤（2）中的药渣挥去溶剂，加入蒸馏水，回流提取，提取2～4次，过滤，合并提取液，浓缩，醇沉，室温放置，离心，沉淀为粗糖提取物，与步骤（3）的固形物料渣合并，水溶，醇沉，离心，沉淀为褐参多糖，活性炭脱色，得多糖粉末；
（5）褐参皂苷提取：步骤（3）中滤液，减压过滤回收乙醇，大孔树脂纯化得褐参皂苷。
优选地，步骤（1）中α-淀粉酶酶解温度为70-90℃，时间为20-40min。
优选地，步骤（2）乙醇水溶液的体积百分浓度为70%-100%，添加量为褐参样品质量的3-10倍。
优选地，步骤（4）中提取液的浓缩为减压浓缩，浓缩体积为提取液体积的1/8-1/3。
本发明的有益成果是：
1.利用酶解、提取、浓缩、静置、离心、脱色、大孔吸附树脂柱纯化等简单的操作方法，将多糖和皂苷同时提取，得到的皂苷的抗肿瘤活性比已有的皂苷提取物显著提高。
2.褐参中淀粉较多，加入α-淀粉酶有效的去除淀粉，减少淀粉对多糖药效的影响和皂苷提取过程中对皂苷的吸附。
3.提取过程中，将醇提法与水提法中得到的沉淀合并，使得药渣中的有效成分充分保留，提高了有效成分多糖的提取率。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
实施例1
（1）取褐参样品，褐参样品购自吉林玉参医药科技有限公司，粉碎，过30目筛。加热至90℃，加入α-淀粉酶溶液，加入量为0.1微升/1克褐参样品，酶解20min。
（2）降温至室温，加入体积百分浓度为75%的乙醇水溶液，加入质量为褐参质量10倍。超声提取30min，提取2次，合并提取液，剩余药渣。
（3）提取液室温静置3天，有沉淀析出。三足式离心机离心，得到滤液和固形物料渣。
（4）将步骤（3）中药渣挥去溶剂之后，向其中加入8倍质量的水于水浴中加热回流提取，回流3小时，反复提取3次，合并提取液。将上述提取液减压浓缩为水提取液体积的1/8后，加入95%乙醇使乙醇浓度80%，进行醇沉，室温放置3天，离心，取沉淀，得粗糖提取物。该粗糖提取物与步骤（3）中的固形物料渣合并，经水溶后，加入95%乙醇使乙醇浓度80%，醇沉放置3天，离心，沉淀为褐参多糖。加入褐参多糖重量15%的活性炭100℃回流30分钟脱色，离心，重复4次，取水层浓缩、干燥，得到棕褐色褐参多糖粉末。
（5）取步骤（3）中离心滤液，减压回收乙醇，水浴蒸发至无醇味。取足量大孔吸附树脂，装柱。吸取人参样品液上柱，预吸附1小时，过柱流出液重吸附1次，吸附流速2.0mL/min。超纯水洗至流出液近无色，70%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，用量5倍柱体积，洗脱流速为1mL/min。减压浓缩，减压蒸干，真空干燥，得褐参皂苷。
褐参多糖得率为30.2%，纯度为64.3%，褐参皂苷得率为22.3%，纯度为68.2%。
实施例2：
（1）取褐参样品，褐参样品购自吉林玉参医药科技有限公司，粉碎，过40目筛。加热至70℃，加入α-淀粉酶溶液，加入量为0.5微升/1克褐参样品，酶解40min。
（2）降温至室温，加入纯乙醇，加入质量为褐参质量3倍。水浴锅中热回流提取3h，提取5次，合并提取液，剩余药渣。
（3）提取液室温静置1天，有沉淀析出。三足式离心机离心，得到滤液和固形物料渣。
（4）将步骤（3）中药渣挥去溶剂之后，向其中加入10倍质量的水于水浴中加热回流提取，回流3小时，反复提取3次，合并提取液。将上述提取液减压浓缩为水提取液体积的1/3后，加入95%乙醇使乙醇浓度85%，进行醇沉，室温放置3天，离心，取沉淀，得粗糖提取物。该粗糖提取物与步骤（3）中的固形物料渣合并，经水溶后，加入95%乙醇使乙醇浓度85%，醇沉放置3天，离心，沉淀为褐参多糖。加入褐参多糖重量20%的活性炭105℃回流30分钟脱色，离心，重复4次，取水层浓缩、干燥，得到棕褐色褐参多糖粉末。
（5）取步骤（3）中离心滤液，减压回收乙醇，水浴蒸发至无醇味。取足量大孔吸附树脂，装柱。吸取人参样品液上柱，预吸附1小时，过柱流出液重吸附1次，吸附流速2.0mL/min。超纯水洗至流出液近无色，70%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，用量5倍柱体积，洗脱流速为1mL/min。减压浓缩，减压蒸干，真空干燥，得褐参皂苷。
褐参多糖得率为31.8%，纯度为67.9%，褐参皂苷得率为23.4%，纯度为67.6%。
实施例3
（1）取褐参样品，褐参样品购自吉林玉参医药科技有限公司，粉碎，过50目筛。加热至80℃，加入α-淀粉酶溶液，加入量为0.2微升/1克褐参样品，酶解30min。
（2）降温至室温，加入体积百分浓度为95%的乙醇水溶液，加入质量为褐参质量5倍。微波提取20min，提取3次，合并提取液，剩余药渣。
（3）提取液室温静置3天，有沉淀析出。三足式离心机离心，得到滤液和固形物料渣。
（4）将步骤（3）中药渣挥去溶剂之后，向其中加入5倍质量的水于水浴中加热回流提取，回流3小时，反复提取3次，合并提取液。将上述提取液减压浓缩为水提取液体积的1/5后，加入95%乙醇使乙醇浓度90%，进行醇沉，室温放置3天，离心，取沉淀，得粗糖提取物。该粗糖提取物与步骤（3）中的固形物料渣合并，经水溶后，加入95%乙醇使乙醇浓度90%，醇沉放置3天，离心，沉淀为褐参多糖。加入褐参多糖重量20%的活性炭105℃回流30分钟脱色，离心，重复4次，取水层浓缩、干燥，得到棕褐色褐参多糖粉末。
（5）取步骤（3）中离心滤液，减压回收乙醇，水浴蒸发至无醇味。取足量大孔吸附树脂，装柱。吸取人参样品液上柱，预吸附1小时，过柱流出液重吸附1次，吸附流速2.0mL/min。超纯水洗至流出液近无色，70%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，用量5倍柱体积，洗脱流速为1mL/min。减压浓缩，减压蒸干，真空干燥，得褐参皂苷。
褐参多糖得率为32.5%，纯度为67.1%，褐参皂苷得率为24.7%，纯度为69.4%。
褐参总皂苷的含量测定：
以人参皂苷Re为对照品（上海圻明生物医药公司提供），香草酸-冰醋酸显色后，用分光光度法在波长为555nm处进行吸光度测定，以吸光度值（Y）对人参皂苷质量（X）进行线性回归，回归方程为Y=4.9821X+0.0003（R=0.9996）。根据回归方程计算提取物中皂苷含量。
褐参多糖的含量测定：
以葡萄糖为标准品，苯酚-浓硫酸显色后，用紫外分光光度法在波长为489nm处进行吸光度测定，以吸光度值（Y）对葡萄糖质量（X）进行线性回归，计算得到线性回归方程：Y=0.3238X+0.0005，相关系数R=0.9987，根据回归方程计算出待测样品中多糖含量。
细胞毒测试：
实验样品：褐参总皂苷根据实施例1方法制备；人参总皂苷购自吉林宏久生物科技有限公司；褐参提取物根据专利CN104523789A制备而成。
实验肿瘤细胞系：K-562，人慢性髓原白血病细胞；Hela，人宫颈癌细胞。
实验方法：体外抗肿瘤细胞实验按不同剂量加入人参提取物样品。
实验结果：
实验结果显示，针对K-562细胞和Hela细胞，根据本研究提出方法制备的褐参总皂苷与人参总皂苷和已有报道的褐参乙醇提取物相比活性显著提高（P<0.05）。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）褐参酶解：取褐参样品，粉碎，过筛，添加α-淀粉酶酶解，添加量为0.1-0.5微升/1克褐参；
（2）醇提：酶解后降温，加入乙醇水溶液，提取2～5次，合并提取液，剩余药渣；
（3）离心：提取液冷却，静置，离心，得到滤液和固形物料渣；
（4）褐参多糖提取：将步骤（2）中的药渣挥去溶剂，加入蒸馏水，回流提取，提取2～4次，过滤，合并提取液，浓缩，醇沉，室温放置，离心，沉淀为粗糖提取物，与步骤（3）的固形物料渣合并，水溶，醇沉，离心，沉淀为褐参多糖，活性炭脱色，得多糖粉末；
（5）褐参皂苷提取：步骤（3）中滤液，减压过滤回收乙醇，大孔树脂纯化得褐参皂苷。
2.根据权利要求1所述的一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，其特征在于，步骤（1）中α-淀粉酶酶解温度为70-90℃，时间为20-40min。
3.根据权利要求1所述的一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，其特征在于，步骤（2）乙醇水溶液的体积百分浓度为70%-100%，添加量为褐参样品质量的3-10倍。
4.根据权利要求1所述的一种从褐参中同时提取和分离皂苷和多糖的方法，其特征在于，步骤（4）中提取液的浓缩为减压浓缩，浓缩体积为提取液体积的1/8-1/3。
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