CN103588826B - 一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法 - Google Patents

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CN103588826B CN201210290152.0A CN201210290152A CN103588826B CN 103588826 B CN103588826 B CN 103588826B CN 201210290152 A CN201210290152 A CN 201210290152A CN 103588826 B CN103588826 B CN 103588826B
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Abstract

本发明涉及一种复方丹参浸膏中低聚糖的分离纯化方法，该方法采用固相萃取法，对复方丹参浸膏中的糖类成分进行分离纯化，先得到复方丹参浸膏总糖提取物，然后采用凝胶色谱法，对复方丹参浸膏总糖提取物中的低聚糖成分实现了很好的分离，得到了一个低聚四糖成分：α‑D‑吡喃半乳糖‑(1→6)‑α‑D吡喃半乳糖‑(1→6)‑α‑D‑吡喃葡萄糖‑(1→2)‑α‑D‑呋喃果糖。

Description

一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法
技术领域：
本发明属于中药领域，具体涉及一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法。
背景技术：
复方丹参滴丸是由丹参、三七和冰片制成的滴丸剂，在临床上广泛用于冠心病、心绞痛的预防、治疗、急救，现已成为国内心血管市场上的主导品牌之一。复方丹参浸膏为复方丹参滴丸的制剂中间体，是由丹参和三七药材，经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏。
复方丹参滴丸上市十余年中逐步建立了完善的工艺质量控制体系，目前正在以药品的形式进行FDA申报研究。但是相对于西药，复方丹参浸膏目前的已知组分仍然较低，提升产品工艺质量控制水平，需要针对其中更多的中药化学成分进行深入研究，从而更加准确地把握产品质量，降低用药风险，同时为国际注册提供支持。
糖类在中草药中分布十分广泛，也是中药材及中药产品中的主要组成成分，所占含量比例很高。测定结果表明，复方丹参浸膏中的糖类成分含量达到约50%，因此糖类成分的研究对于复方丹参浸膏的全面质量控制有着重要意义。
复方丹参滴丸在制备过程中用到丹参和三七的提取物（该提取物的制备属于现有技术，也称为复方丹参浸膏，详见中国专利ZL 01136155.7或03144300.1中复方丹参浸膏的制备方法），从该提取物中分离出了多种糖类成分，获得这些成分可以用于分析复方丹参滴丸中不同糖类成分的比例关系，了解它们的作用，同时可以用于控制产品的质量，本发明在于提供一种从该提取物中分离低聚四糖成分的方法，该方法快速，准确，操作简单，分离效果好，得到的产品纯度高，收率高，可用于糖类成分的定性和定量检测。
发明内容：
本发明经过长期反复的摸索，最终得到一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法，并对该低聚四糖进行了结构确认，确认该化合物为α-D-吡喃半乳糖-(1→6)-α-D吡喃半乳糖-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-α-D-呋喃果糖（以下简称低聚四糖）。
该分离纯化方法包括如下步骤：
（1）复方丹参浸膏总糖提取物的制备；
（2）复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；
（3）低聚四糖成分的收集；
其中步骤（1）所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：
复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。
其中所述固相萃取柱采用Cleanert PS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗；
其中所述复方丹参浸膏为丹参和三七药材经水提、醇沉、浓缩后得到的浸膏，其制备方法具体为：分别取41.06份丹参、8.03份三七药材，粉碎，放入提取罐中，加入上述生药5倍量的碱水（PH=7.0），提取2小时，过滤，收集初滤液，药渣加入4倍量水，煎煮1小时，滤过，与第一次提取的滤液混合，减压浓缩，直至溶液体积(L)与生药质量(Kg)的比为0.9-1.1，加入95%的乙醇直至含醇量至69-71%，静置12小时，滤过，滤液浓缩回收乙醇成浸膏，相对密度为1.32-1.40。该方法属于现有技术。
其中步骤（2）所述过聚丙烯酰胺凝胶层析柱是将得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为35-45℃，用超纯水进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集流出量相当于0.55-0.65柱体积时的流份。
其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱为现有技术，可以用以下方法得到：
称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶，倒入超纯水中，在室温下润涨12小时以上，真空脱气，装柱到需要的高度（100~120cm），再用2~3倍柱体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱。
优选的，步骤（2）中层析柱的柱温为40℃。
步骤（2）中所述上样量为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶。
步骤（2）中所述层析柱的洗脱流速为0.0184-0.0367柱体积/小时。
其中步骤（3）所述的低聚四糖成分的收集方法为：用HPLC方法对洗脱液进行检测，收集保留时间为30.5min±0.2min的洗脱液，蒸干，得到洗脱物低聚四糖。
所述HPLC对洗脱液进行检测的方法为：
采用HPLC-ELSD法，色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
本发明的洗脱物低聚四糖的结构确认方法为高分辨质谱，方法如下：
本发明的洗脱物为白色粉末，易溶于水、稀醇、乙醇。Molish反应呈阳性。说明该化合物可能是糖类。
ESI-MS（m/z）：高分辨质谱测得本品的[M+Na]+峰的质量数为689.2118，与C24H42O21理论计算值689.2111的相对误差为-1.03ppm，表明由高分辨质谱给出的最为匹配的分子式C24H42O21，故该待测化合物的化学式C24H42O21。
1H-NMR（D2O，500MHz）与13C-NMR（D2O，125MHz）的谱图数据及类别归属在表2中给出。
表21H-NMR与13C-NMR数据汇总
Table2 Datas of 1H-NMR and 13C-NMR
表2中汇总的图谱数据经查阅，与文献报道的化合物O-α-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-gluctopyranos yl-(1→2)-O-α-D-fructofuranoside一致，因此确定化合物1为O-α-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-galactopyranosyl-(1→6)-O-α-D-gluctopyranos yl-(1→2)-O-α-D-fructofuranoside，即α-D-吡喃半乳糖-(1→6)-α-D吡喃半乳糖-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-α-D-呋喃果糖。化合物1的结构见图2。
附图说明：
图1复方丹参浸膏总糖提取物ELSD-HPLC色谱图
图2本发明分离纯化出的低聚四糖的结构
图3本发明低聚四糖的1H-NMR图谱
图4本发明低聚四糖的13C-NMR图谱
图5本发明低聚四糖的ESI-MS图谱
图6本发明低聚四糖的DEPT图谱
图7本发明低聚四糖的H-Hcosy图谱
图8本发明低聚四糖的H-Htocsy图谱
图9本发明低聚四糖的HSQC图谱
图10本发明低聚四糖的HMBC图谱
具体实施方式：
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，实施例中所用的浸膏为依照现有技ZL01136155.7或03144300.1中所列的制备方法制得，下述实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制，根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
实施例1
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-QAcademic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取0.4g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为1mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.2g，复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量，的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.2g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在40℃。
用超纯水以0.2mL/min（0.0245柱体积/小时）的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集0.55-0.65柱体积时的流份（即135-160管、270-320ml的流份），进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。
实施例2
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×120cm，美国Bio-Red公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取0.4g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为0.75mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.24g复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.0833g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为120cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.2g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在40℃。
用超纯水以0.0245柱体积/小时的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集流出量相当于0.55-0.65柱体积时的流份的流份，进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5min±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。
实施例3
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-QAcademic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取0.5g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为0.75mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.25g，复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量，的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.25g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在45℃。
用超纯水以0.0184柱体积/小时的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集流出量相当于0.55-0.65柱体积时的流份的流份，进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5min±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。
实施例4
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-QAcademic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取0.3g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为1mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.15g，复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.075g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.15g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在45℃。
用超纯水以0.0245柱体积/小时的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集收集流出液相当于0.55-0.65柱体积时的流份，进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5min±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。
实施例5
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTA prime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（2.5cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-QAcademic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取0.3g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为0.5mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.15g，复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.075g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为100cm。再用2～3倍床体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.15g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在35℃。
用超纯水以0.0184体积/小时的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集140-160管（330-360ml）的流份（相当于0.55-0.65柱体积时的流份），进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5min±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。
实施例6
1、仪器与试药
1.1仪器
AKTAprime蛋白质纯化系统（美国通用电气公司GE医疗集团）；高压水冷夹层层析柱（5.0cm×100cm，上海楚柏实验室设备有限公司）；Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）；Waters 2420ELSD检测器（美国Waters公司）；Bio-Gel P-2聚丙酰胺凝胶（美国Bio-Red公司）；Milli-Q Academic超纯水处理系统（美国Millipore公司）；固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL，Agela科技有限公司）；恒温水浴锅（宁波天恒仪器厂）。
1.2试剂与试药
乙腈（色谱纯，Merck公司）；甲醇（分析纯，天津康科德科技有限公司）；超纯水（Milli-Q超纯水处理系统制得，电导率18.2MΩ·cm）。
1.3复方丹参浸膏总糖提取物的制备
将固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL）用10mL甲醇冲洗，之后再用10mL水冲洗，冲洗后即可备用。此处是常规处理方法，起到活化柱子的作用。
称取1.6g复方丹参浸膏，加10mL水，超声使其完全溶解。上至已处理好的固相萃取柱（Cleanert PS-SPE，500mg/6mL），流速为0.5mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液45ml，蒸干，称重，共得到0.8g，复方丹参浸膏总糖提取物，备用。
1.4低聚四糖的分离制备
1.4.1聚丙酰胺凝胶的处理
称取一定量，的聚丙烯酰胺凝胶（Bio-Gel P-2），缓慢倒入超纯水中,在室温下润涨12小时以上。将上层细小颗粒倾倒出去，反复数次，至无悬浮的细小颗粒为止。此处聚丙烯酰胺凝胶的用量于上样量有关，比例为0.10g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶
1.4.2层析柱的准备
将处理好的聚丙酰胺凝胶真空脱气，之后用自动沉降法装柱到需要的高度，装柱高度为100cm。再用2～3倍柱体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱，即可供后续分离使用。
1.4.3上样、洗脱、收集洗脱液
将得到的0.8g处理后样品用0.5mL的超纯水溶解，溶解后上样至已处理好的层析柱，层析柱温度要始终保持在40℃。
用超纯水以0.0367体积/小时的速度进行洗脱，每10min收集1管洗脱液，收集流出量相当于0.55-0.65柱体积时的流份，进行HPLC检视。
1.4.4洗脱液的检测
色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表1，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60%。
表1流动相梯度设置
Table1 program of the mobile phase in the experiment
将收集得到的各管洗脱液，按照上述色谱条件，直接依次进样，进行检测，记录响应值。
1.4.5低聚四糖的收集
将只含有保留时间约为30.5min±0.2min色谱峰的洗脱液合并，蒸干，得化合物。

Claims (10)

1.一种复方丹参浸膏中低聚四糖的分离纯化方法，包括如下步骤：
(1)复方丹参浸膏总糖提取物的制备；
(2)复方丹参浸膏总糖提取物过聚丙烯酰胺凝胶层析柱；
(3)低聚四糖成分的收集；所述低聚四糖为α-D-吡喃半乳糖-(1→6)-α-D吡喃半乳糖-(1→6)-α-D-吡喃葡萄糖-(1→2)-α-D-呋喃果糖。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(1)所述复方丹参浸膏总糖提取物的制备方法为：
复方丹参浸膏加水超声溶解，上至已处理好的固相萃取柱，流速为0.5-1.0mL/min，再用水分次洗涤，收集上样液和洗涤流出液，蒸干，得复方丹参浸膏总糖提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述固相萃取柱采用Cleanert PS-SPE萃取柱，使用前经过处理，处理方法为：将固相萃取柱用甲醇冲洗，之后再用水冲洗。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(2)所述过聚丙烯酰胺凝胶层析柱是将得到的复方丹参浸膏总糖提取物用超纯水溶解，上样至已处理好的层析柱，层析柱的柱温为35-45℃，用超纯水进行洗脱，收集流出量相当于0.55-0.65柱体积时的流份。
5.如权利要求1所述的方法，其中，聚丙烯酰胺凝胶层析柱用以下方法得到：
称取聚丙烯酰胺凝胶，倒入超纯水中，在室温下润涨12小以上真空脱气，装柱，装柱高度为100-120cm，再用2～3倍柱体积的超纯水以恒定的流速平衡层析柱。
6.如权利要求4所述的方法，其中层析柱的柱温为40℃。
7.如权利要求4所述的方法，其中所述上样量为0.075-0.125g复方丹参浸膏总糖提取物/100克聚丙烯酰胺凝胶。
8.如权利要求4所述的方法，其中所述层析柱的洗脱流速为0.0184-0.0367柱体积/小时。
9.如权利要求1所述的方法，其中步骤(3)所述的低聚四糖成分的收集方法为：用HPLC方法对洗脱液进行检测，收集保留时间为30.5min±0.2min的洗脱液，蒸干，得到洗脱物。
10.如权利要求9所述的方法，所述检测方法为：
采用HPLC-ELSD法，色谱条件：采用PrevailTM Carbohydrate ES色谱柱，以乙腈为流动相A，水为流动相B，梯度设置见表，流速为0.8mL/min，柱温30℃；采用WATERS 2420ELSD检测器，参数设置为增益10，气压25psi，漂移管60℃，Neb heater为60％；
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