CN103830306B - 一种忍冬叶有效提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种忍冬叶有效提取物的制备方法，包括以下步骤：醇回流提取、调酸过滤、大孔树脂洗脱除杂和浓缩、干燥等。本发明操作简单，所用大孔树脂可再生利用，制备成本低且环境污染小；使用乙醇溶液作为提取纯化溶剂，安全性高，廉价易得；所得的忍冬有效提取物中绿原酸、总黄酮含量高，成分全，不仅含绿原酸、黄酮类有效成分，也含环烯醚萜苷类和酚酸类等成分，与忍冬叶各组分天然比例接近。

Description

一种忍冬叶有效提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及一种忍冬叶有效提取物的制备方法，属于中药领域。

背景技术

忍冬叶为忍冬属忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥叶，李时珍谓：“忍冬茎叶及花功用皆同”，药效及成分与金银花基本相同，具有清热解毒、疏风通络、保肝利胆之功效，常用于治疗上呼吸道感染，咽痛、喉痹、扁桃体炎、口腔炎等。忍冬叶的主要有效成分为绿原酸、黄酮、苷类（皂苷、环烯醚萜苷）、挥发油和其它微量成分等，具有抗病原微生物、降血压、降血脂、抗肿瘤等多种作用。

忍冬花因其产量有限，常供不应求。而忍冬叶与花同株，为了保证花蕾的正常生长，忍冬需多次修剪整形，每年可得大量的叶，而这些忍冬叶为忍冬传统的废弃部分，一直被视为非药用部位而长期未得到利用，浪费现象十分严重。有文献报道，忍冬叶与金银花的主要有效成分均为酚酸类化合物，单位重量的忍冬叶有机酸的含量为金银花的70%，总黄酮含量高于花蕾，而且忍冬叶粗黄酮的抑菌效果和抗氧化活性均高于忍冬花中的绿原酸粗品，具有相当高的研究和应用价值。

对于忍冬叶中绿原酸、总黄酮、总酚酸和环烯醚萜苷等大类成分的提取、分离，国内已有详细的专利及文献报道，例如，中国专利文献CN102988457A公开了一种用灰毡毛忍冬叶提取总黄酮的方法，包括水提醇沉、D101或AB—8树脂纯化等步骤；中国专利CN103183616A提供了一种从红腺忍冬叶中提取绿原酸的方法，包括醇提、凝絮沉淀、树脂分离、浓缩、重结晶等步骤；中国专利CN103142677A公开了一种从忍冬叶中提取酚酸类化合物的方法，具体步骤包括水煎煮提取、调节pH、聚酰胺柱纯化等步骤；胡润准以60%的乙醇破碎提取忍冬叶3次，每次2min，合并醇提液，浓缩，上聚酰胺柱以不同浓度的乙醇洗脱，得相应的洗脱份，即得绿原酸和总黄酮的分离产物（胡润准，袁珂，孙德梅.忍冬叶中绿原酸和总黄酮分离工艺的研究[J].河南科学，2006，17（4）：382-384.）；姜洪芳等以70%的乙醇回流提取忍冬叶，浓缩后以正丁醇萃取，正丁醇相减压蒸干，上硅胶柱，再用乙酸乙酯、乙醇洗脱，洗脱液以甲醇或乙醇重结晶，得黄酮类化合物（姜洪芳，张卫明，张玖.忍冬叶黄酮类化合物的提取分离与结构鉴定[J].安徽农业科学，2008，36（27）：11795-11797.）；马俊利等以75%的乙醇回流提取忍冬叶3次，合并提取液，减压浓缩，后以正丁醇萃取，取正丁醇层经硅胶色谱柱层析，以氯仿—甲醇梯度洗脱，后经反复硅胶色谱柱色谱和制备液相色谱分离纯化，再经重结晶处理，得到环烯醚萜苷类成分（马俊利，肖楠，宋琨.忍冬叶中的环烯醚萜苷类成分[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（9）：121-123.）。

以上都是关于忍冬叶中绿原酸、总黄酮、总酚酸和环烯醚萜苷等大类成分的提取、分离，但有关忍冬叶总有效成分提取物的提取、纯化研究却甚少。马俊利用70%的乙醇回流提取干燥的金银忍冬叶3次，合并提取液，减压浓缩得浸膏，将浸膏混悬于适量的水中，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经反复硅胶色谱柱，以氯仿—甲醇（200:1—1:1）梯度洗脱，TLC检测，得10个流份，2—4流份经硅胶色谱柱分离、纯化，得到目标产物（马俊利.金银忍冬叶化学成分的分离与鉴定[J].亚太传统医药，2013，9（2）：33-34.）。该方法使用较多有害溶剂，操作步骤繁琐，所得并非忍冬叶总有效成分提取物，而且其主要目的是为了分离忍冬叶中的化学成分并进行鉴定；胡润准，万焱用15倍量60%的乙醇提取忍冬叶3次，每次1小时，合并醇提液，减压浓缩，加入0.5%的活性炭煮沸0.5小时，过滤，在减压的条件下制备成干粉，将干粉加适量的水溶解后加在D101大孔吸附树脂柱上部，后用10%、20%、30%、40%、50%、60%和70%的乙醇作为洗脱剂进行洗脱，按每份100mL收集，以TLC检识并合并相同成分的洗脱液，分离得到绿原酸、总黄酮和其它成分（胡润准.万焱.忍冬叶活性成分分离工艺的研究[J].中成药，2007，29（7）：附6-附7.）。该方法中相同的洗脱组分要不断用TLC检识，操作步骤繁多，且分别用不同浓度乙醇洗脱、收集，大生产中难以实现，而且其得到的是分开的大类成分，并非忍冬叶总有成分提取物。

鉴于现有技术的不足，有必要发明一种新的制备忍冬叶有效提取物的制备方法，使之既能简化操作过程，在最大程度上少用或不用有害溶剂，适合工业化大生产，又能提高有效提取物中各有效成分的含量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有提取、纯化工艺的不足，提供一种简单、有效的制备忍冬叶有效提取物的方法。

本发明的发明目的是通过以下方式实现的。

本发明忍冬叶有效提取物的制备方法包括：醇回流提取、调酸过滤、大孔树脂洗脱除杂和浓缩、干燥等步骤。

进一步，本发明所涉及的一种忍冬叶有效提取物的制备方法包括以下步骤：

1）取忍冬叶，用乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩，待用；

2）步骤1）浓缩液调pH值至1.0～6.0，过滤，待用；

3）步骤2）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的大孔树脂柱上，调节纯水pH至1.0～6.0，洗至洗脱液澄清，再用7倍柱床体积的60%的乙醇以3BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得忍冬叶有效提取物。

优选地，步骤2）浓缩液调节pH值至5.0；

优选地，步骤3）所述的大孔树脂为弱极性、中级性和极性大孔树脂中的一种。

优选地，步骤3）所述的大孔树脂为AB-8、HPD400、HPD100、HPD826、LS-300B、LS-303中的一种，最优为LS-303B。

优选地，步骤3）用盐酸调节纯水pH至5.0；

优选地，步骤3）所述的干燥方法为真空干燥、微波真空干燥中的一种，最优为微波真空干燥。

与现有技术比较，本发明忍冬叶有效提取物制备方法具有以下显著的进步：

1、操作简单，条件可控，具良好的可重复性，所用大孔树脂可重复利用，制备成本低且不污染环境，适合工业化生产；

2、本发明使用乙醇溶液作为提取纯化溶剂，廉价易得，有效提取物无有害溶剂残留，所得的忍冬叶有效提取物药物安全性高；

3、与现有的忍冬叶有效成分制备方法相比较，用本发明方法制备的有效提取物中绿原酸、总酚酸、总黄酮含量高，经测定，其总酚酸含量在58%以上，总黄酮在15%以上；

4、与现有忍冬叶有效成分提取分离方法相比较，用本发明方法制备的忍冬叶有效提取物成分全，不仅含绿原酸、环烯醚萜苷类，也含有酚酸类和黄酮类等成分，与忍冬叶各组分天然比例接近。

附图说明

图1.水洗脱部位

图2.10%醇洗脱部位

图3.30%醇洗脱部位

图4.60%醇洗脱部位

具体实施方式

以下通过忍冬叶提取及纯化工艺试验例和忍冬叶有效提取物制备的具体实施方式对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

实施例1忍冬叶纯化工艺优选

1大孔树脂型号选择试验设计

忍冬叶中酚酸类具有一定的极性和水溶性，且多酚羟基，易和大孔树脂形成氢键，故本工艺选用以下六种对酚羟基具有较好富集效果的树脂作为考察目标，进行筛选。

根据酚酸类的性质和树脂的吸附性能，选择AB-8、HPD400、HPD100、HPD826、LS-300B、LS-303六种型号的大孔树脂供优化选择，其主要性能见表1。

表1各型号大孔树脂的性能

2大孔树脂的预处理

将各型号大孔树脂：AB-8、HPD400、HPD100、HPD826、LS-300B、LS-303用95%乙醇溶液浸泡24小时，充分溶胀后用乙醇洗至洗出液与水混合（1:3）不呈白色浑浊，然后以大量去离子水洗至无醇味，备用。取树脂时以树脂在水中溶胀后的体积（ml）为单位。

3上样液的制备

称取忍冬叶200g，照前述最佳醇提工艺提取，浓缩后定容至1000ml（生药浓度0.2g/ml），静置，滤过，备用。

4适用树脂的筛选

采用静态及动态吸附法，通过测定吸附残留液和解吸液中的指标性成分浓度，计算各树脂的吸附量和解吸率来筛选最适树脂。

5静态吸附法

量取已处理好的各型号树脂各3克，加上样液6ml，吸附24小时，振摇，滤过，滤液收集，树脂加水30ml洗涤，洗液与滤液合并定容于50ml容量瓶中，然后从中精密吸取1ml，水稀释定容于250ml容量瓶中作为残留液；将已吸附过的树脂用95%的乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，剩余用水定容于100ml容量瓶中，然后从中精密吸取1ml，水稀释定容于100ml容量瓶中。分别测总酚酸含量，计算吸附量、解吸量和解吸率。

5.1指标选择以总酚酸含量为试验指标

5.2含量测定

测定方法紫外分光光度法

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50%的甲醇制成每1ml约含500ug的溶液，即得。

测定法精密称取绿原酸标准品20.45mg，甲醇定容至100ml；从中准确量取0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4ml，分别定容至50ml，测其吸光度值。取100ug/ml的绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200～500nm扫描，得绿原酸最大吸收峰为327nm，以327nm分别测定不同浓度标准溶液的吸光值，以绿原酸标准品浓度（ug/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为：y=0.0518x-0.0068，相关系数R²=0.9995。

5.3结果列于表2。

表2不同型号树脂对绿原酸的静态吸附率和解吸率

比吸附量=（上样液中总酚酸量–残留液总酚酸量）/上样液中总酚酸量

解吸率=解吸液中总酚酸量/树脂吸附总酚酸量

由上表可知树脂LS-303B的吸附量最大，其次为AB-8和LS-300；树脂HPD826的解吸量最大，其次为LS-303B、AB-8。综合考虑树脂的吸附量及解吸率，我们选用LS-303B型树脂用以分离、纯化忍冬叶中绿原酸成分。

6动态吸附法

量取已处理好的各型号树脂各25ml，湿法装柱，将忍冬叶样品液以2BV/h的流速分别上样，按树脂柱体积收集流出液，测定流出液中总酚酸的含量，当流出液中总酚酸是含量达到样品液中总酚酸含量的10%时，即为吸附终点；然后均用95%乙醇洗脱，至洗脱液中检测不到绿原酸为止。计算树脂吸附量和解吸率。

6.1指标选择以总酚酸含量为试验指标

6.2含量测定方法

同【静态吸附含量测定方法】

6.3结果列于表3

表3不同型号树脂对绿原酸的动态吸附量和解吸率

吸附率=（吸附前质量浓度×吸附液体积–吸附后质量浓度×吸附液体积）/树脂体积×100%

解吸率=（解吸液质量浓度×解吸液体积）/（上样液质量浓度×上样液体积）×100%

由上表可知树脂LS-303B的吸附量最大，其次为AB-8和HPD826；树脂HPD400的解吸率最高，其次为LS-303B、HPD826和HPD100。综合考虑树脂的吸附量及解吸率，选用LS-303B型树脂用以分离、纯化忍冬叶中绿原酸成分。

7LS-303B型大孔吸附树脂纯化工艺研究

7.1忍冬叶样品溶液制备

称取忍冬叶200g，照前述最佳醇提工艺提取，浓缩至密度约为1.15g/cm³（75℃），水稀释定容至1000ml（生药浓度0.25g/ml），静置，滤过，即得忍冬叶样品液。

7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定

色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-水-冰醋酸（13:87:0.2）为流动相；紫外检测器；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：327nm；理论板数按绿原酸峰计算应不低于3000。在选定条件下，绿原酸和样品中其他组分可基线分离，绿原酸与其相邻色谱峰的分离度大于1.5。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸、异绿原酸A对照品适量，加50%的甲醇制成每1ml约含绿原酸50ug和、异绿原酸A20ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备精密量取适量的洗脱液，浓缩至干，50%的甲醇转移制成每1ml约含50ug绿原酸的溶液，测定成分含量并进行统计分析。

测定法精密吸取对照品溶液10ul，供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。

7.3总酚酸的测定方法

测定方法紫外分光光度法

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加50%的甲醇制成每1ml约含500ug的溶液，即得。

供试品溶液的制备同绿原酸含量测定项

测定法精密称取绿原酸标准品20.45mg，甲醇定容至100ml；从中准确量取0.5，1，1.5，2，2.5，3，3.5，4ml，分别定容至50ml，测其吸光度值。取100ug/ml的绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200～500nm扫描，得绿原酸最大吸收峰为327nm，以327nm分别测定不同浓度标准溶液的吸光值，以绿原酸标准品浓度（ug/ml）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线，得其回归方程为：y=0.0518x-0.0068，相关系数R²=0.9995。

7.4上样浓度的优选

取已处理好的LS-303B型大孔树脂30ml，平行五份，湿法装柱，分别将按最佳醇提工艺提取的药液以25mg/ml、50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml、300mg/ml和400mg/ml的浓度进行动态吸附，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水洗至洗脱液澄清，合并流过液和洗脱液，定容于500ml量瓶中，作为残留液；再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，定容于250ml量瓶中。

指标选择以总酚酸吸附率为试验指标

含量测定参考【2.4总酚酸的测定方法】

结果列于表4。

表4忍冬叶上样浓度的优选结果

由上表可知，当药液浓度为300mg/ml（生药浓度）时，指标成分的吸附率最大，结合大生产的情况，确定忍冬叶的上样浓度为300mg/ml。

7.5吸附流速的优选

取处理好的LS-303B型大孔树脂30ml，平行三份，湿法装柱，将按最佳醇提工艺提取的药液（300mg/ml）上样，分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h和4BV/h的吸附流速进行动态吸附，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水洗至洗脱液澄清，合并流过液和洗脱液，定容于500ml量瓶中，作为残留液；再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，定容于250ml量瓶中。计算各条件下对绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率进行统计分析。

指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

含量测定参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

结果列于表5。

表5忍冬叶吸附流速的优选结果

由上表可知，当吸附流速为3BV/h时，其绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率均较大，因此，确定忍冬叶的吸附流速为3BV/h，以进一步考察最佳纯化条件。

7.6径高比考察

树脂柱的径高比在一定程度上影响吸附效果，通常适用于工业生产的树脂柱径高比为1:3—1:10，因此我们在这个范围附近选择1:3、1:5和1:10三个比例对LS-303树脂柱进行考察，将忍冬叶样品液（生药浓度300mg/ml）以1BV/h的上样流速分别上径高比为1:3、1:5和1:10的树脂柱，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水洗至洗脱液澄清，合并流过液和洗脱液，定容于500ml量瓶中，作为残留液；再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，定容于250ml量瓶中。计算各条件下总酚酸的吸附率进行统计分析。

指标选择以总酚酸吸附率为试验指标

含量测定参考【2.4总酚酸的测定方法】

结果列于表6。

表6LS-303树脂柱径高比的优选结果

由上表可知，当树脂柱的径高比为1:5时，其吸附率较大，因此，确定LS-30B树脂柱的径高比为1:5，以进一步考察最佳纯化条件。

7.7上样液pH值考察

在酸性条件下，具有酚羟基结构的绿原酸类以分子状态存在，可以凭借范德华力与树脂发生物理吸附作用，因此随着样液酸度的增加，树脂的吸附容量逐渐增加。但酸度过高不仅不利于绿原酸的热稳定性，而且对生产设备损害较大；故取处理好的LS-303B型大孔树脂30ml，平行三份，湿法装柱，将按最佳醇提工艺提取的药液（300mg/ml）分别调pH值为1、2、3、4、5和6后上样，均以1BV/h吸附流速进行动态吸附，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水洗至洗脱液澄清，合并流过液和洗脱液，定容于500ml量瓶中，作为残留液；再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，定容于250ml量瓶中。计算各条件下绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率进行统计分析。

7.7.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.7.2含量测定

参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.7.3结果列于表7。

表7上样液pH值的优选结果

由上表可知，随着样液酸度的增加，树脂的吸附容量逐渐增加，当pH=5时，绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率均较大，因此，确定上样液pH值为5，以进一步考察最佳纯化条件。

7.8水洗流速的考察

样液上样后，其中的有效成分被树脂吸附，用水可将糖等水溶性杂质除去，但水洗流速过快，杂质将洗脱不完全，影响最终产物的纯度；若流速过慢。绿原酸也有一定水溶性，将被水洗脱从而影响绿原酸转移率，且流速过慢会影响大生产效率，因此对最佳水洗脱流速进行考察。取处理好的LS-303B型大孔树脂30ml，平行三份，湿法装柱，将按最佳醇提工艺提取的药液（300mg/ml）调pH值为5上样，以3BV/h吸附流速进行动态吸附，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水分别以3BV/h、4BV/h和5BV/h洗至洗脱液澄清，合并流过液和洗脱液，定容于500ml量瓶中，作为残留液；再用70%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，定容于250ml量瓶中。计算各条件下绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率进行统计分析。

7.8.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.8.2含量测定

参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.8.3结果列于表8。

表8水洗脱流速考察的优选结果

由上表可知，随着水洗流速的减小，绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率逐渐升高，但相对其他纯化条件对其影响较小，结合实际情况最终确定水洗流速为3BV/h，以进一步考察最佳纯化条件。

7.9水洗液pH值考察

取处理好的LS-303B型大孔树脂55ml，平行三份，湿法装柱，将按最佳醇提工艺提取的药液（300mg/ml）调pH值为5后上样，均以3BV/h吸附流速进行动态吸附，用薄层法检测流过液，待反应呈阳性时，停止上样，记录上样量。用纯水分别调pH值为2、3、4、5后进行洗脱，洗至洗脱液澄清，合并水洗脱液，定容于250ml量瓶中。计算水洗液中总酚酸的转移率进行统计分析。

7.9.1指标选择以总酚酸转移率为试验指标

7.9.2含量测定

参考【2.4总酚酸的测定方法】

7.9.3结果列于表9。

表9水洗液pH值的优选结果

由上表可知，当水洗液pH为酸性时，有利于减少水洗液洗脱造成的总酚酸类的损失，因此，结合设备对酸度要求，确定水洗液调至同上样液相同pH值进行洗脱除杂，以进一步考察最佳纯化条件。

7.10洗脱剂的考察

取已处理好的LS-303B型大孔树脂55ml，湿法装柱。量取按最佳醇提工艺提取的药液60ml（300mg/ml），以1BV/h流速进行吸附。先用纯水洗至洗脱液澄清，依次用水、10%、30%、60%乙醇各4倍床体积洗脱，收集洗脱液，每一段洗脱部位为一份，共4份。

7.10.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.10.2含量测定

参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.10.3结果列于表10。

表10洗脱剂的优选试验结果

由测定结果可知，用醇度为60%以上的乙醇就可将有效成分洗脱下来，为最大程度地保留有效成分，得到纯度较大的制剂，因此我们对洗脱剂进行进一步的优选。

进一步优选洗脱剂

取已处理好的LS-303B型大孔树脂55ml，平行三份，湿法装柱。量取按最佳醇提工艺提取的药液60ml（300mg/ml），以1BV/h流速进行吸附。先用纯水洗至洗脱液澄清，分别用50%、60%、70%乙醇以2BV/h流速各洗4倍床体积，收集洗脱液220ml。

7.10.4指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.10.5含量测定参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.10.6结果列于表11。

表11洗脱剂的优选试验结果

根据试验结果，以60%乙醇洗脱所得绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率均较高。综合考虑上述因素及生产的周期、成本，选定60%的乙醇为洗脱剂。

7.11洗脱流速的考察

取已处理好的LS-303B型大孔树脂55ml，湿法装柱。量取按最佳醇提工艺提取的药液60ml（300mg/ml），以1BV/h流速进行吸附。先用纯水洗至洗脱液澄清，然后用60%乙醇分别以1BV/h、2BV/h、3BV/h的洗脱流速进行洗脱4倍床体积，收集洗脱液各220ml。

7.11.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.11.2含量测定

参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.11.3结果列于表12。

表12洗脱流速的优选试验结果

根据试验结果，采用60%乙醇作洗脱剂，以2BV/h流速洗脱4倍柱体积，所得绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率均较高。综合考虑上述因素及生产的周期、成本，最终选定2BV/h作为洗脱剂的洗脱流速。

7.12洗脱用量的考察

按上述所确定的吸附和洗脱条件，取忍冬叶样品液（200mg/ml）上柱，吸附和洗脱，分段收集洗脱液。每个床体积收集一份，共收集10份。

7.12.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.12.2含量测定参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.12.3结果列于表13。

表13忍冬叶洗脱剂用量的考察

由表结果看，洗脱至第7份样品时，洗脱液中绿原酸及异绿原酸A含量已较低，可认为树脂柱上吸附的绿原酸及异绿原酸A已基本洗脱下来，故确定洗脱剂用量为7倍床体积。

7.13验证实验

按上述各项试验所确定的工艺参数，进行3次验证试验，分别对所得洗脱液的绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率进行统计分析。

7.13.1指标选择以绿原酸及异绿原酸A的含量及转移率为试验指标

7.13.2含量测定

参考【7.2绿原酸及异绿原酸A的含量测定】

7.13.3结果列于表14。

表14验证实验结果

结果表明，在本文所确定的工艺条件下，提取物中绿原酸含量能达到19%以上，转移率能达到80%以上。

上述试验证明，忍冬叶的最佳纯化条件为：按最佳回流条件提取的忍冬叶药液，浓缩至300mg/ml（pH=5），滤过，以3BV/h加于预处理好的LS-303B型树脂柱上（径高比1:5），先用pH=5的纯水以3BV/h洗至洗脱液澄清，然后用7倍床体积的60%乙醇以2BV/h流速洗脱，收集洗脱液，浓缩，备用。

实施例2忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用30%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.5小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至1.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的AB-8型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=6.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物46.1g。

4）忍冬叶有效提取物中总黄酮含量的测定

对照品溶液的制备：精密称取芦丁对照品5.07mg用95%乙醇溶解，定容于100mL容量瓶中，加95%乙醇至刻度。

标准曲线的绘制：分别吸取芦丁对照溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于10mL容量瓶中，用95%乙醇稀释至刻度，摇匀，以95%乙醇为空百，在516nm处测定吸光度，得回归方程为Y=0.0165X+0.032，相关系数r=0.9998。

总黄酮含量测定：取忍冬叶有效提取物样品0.1g，以95%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，在516nm处测定总黄酮的含量，测得有效提取物总黄酮的含量为15.2%。

5）总酚酸含量的测定

参照本发明【2.4总酚酸的测定方法】测定有效提取物中的总酚酸，测得忍冬叶有效提取物中总酚酸的含量为61.6%。

实施例3忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用90%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至6.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的XAD-8型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=1.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物48.5g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为16.5%和59.7%。

实施例4忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用80%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至5.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的HPD826型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=4.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物52.4g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为17.8%和62.6%。

实施例5忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用50%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至2.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的HPD400型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=3.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物49.0g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为17.7%和68.0%。

实施例6忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用60%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至4.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS—300B型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=5.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物52.8g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为15.2%和59.3%。

实施例7忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用60%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至5.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS-303B型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=5.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物50.2g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为19.6%和73.7%。

实施例8忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用70%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至6.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的HPD100型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=2.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物54.6g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为18.1%和61.5%。

实施例9忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用50%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至4.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS-303B型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=6.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物48.9g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为18.5%和72.1%。

实施例10忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用40%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至2.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的AB-8型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=2.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物51.2g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为16.1%和58.2%。

实施例11忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用40%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至1.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS-303型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=3.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物53.7g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为18.2%和64.7%。

实施例12忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用80%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至4.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的HPD826型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=5.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物50.6g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为15.6%和70.2%。

实施例13忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用70%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至3.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的HPD400型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=3.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物52.1g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为16.0%和69.3%。

实施例14忍冬叶有效提取物的制备

1）取干燥的忍冬叶750g，用60%乙醇回流提取3次，第一次加12倍量，第二次加10倍量，第三次加8倍量，每次1.0小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至生药量为0.3g/mL的浓缩液，放冷，待用；

2）浓缩液调pH值至4.0，过滤至澄清，待用；

3）滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS-303B型大孔树脂柱上，用盐酸将纯水调成pH=2.0，以3BV/h的流速洗至洗脱液澄清，再用7倍床体积的60%的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩至相对密度为1.15～1.30（70℃）的清膏，微波真空干燥，粉碎，即得忍冬叶有效提取物49.7g。

按实施例2所述总黄酮和总酚酸的测定方法，测得总黄酮和总酚酸的含量分别为19.1%和70.6%。

Claims (3)

1.一种忍冬叶有效提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)取忍冬叶，用乙醇溶液回流提取，滤过，合并滤液，减压浓缩，待用；

2)步骤1)浓缩液调pH值至5.0，过滤，待用；

3)步骤2)滤液以3BV/h的速度加于预处理好的径高比为1:5的LS-300B型大孔树脂柱上，调节纯水pH至5.0，洗至洗脱液澄清，再用7倍柱床体积的60％的乙醇以2BV/h的流速洗脱，收集醇洗脱液，减压浓缩，干燥，粉碎，得忍冬叶有效提取物。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)的干燥方法为真空干燥或微波真空干燥中的一种。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的干燥方法为微波真空干燥。