CN103655749A

CN103655749A - 一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法

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Publication number: CN103655749A
Application number: CN201310539843.4A
Authority: CN
Inventors: 曹君; 胡帅帅; 代菡镔; 刘晓娟; 达建华; 曹婉
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2013-11-04
Filing date: 2013-11-04
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-11-04
Also published as: CN103655749B

Abstract

本发明公开了一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法：大黄药材或大黄固体制剂按照药典进行提取，制得大黄提取液，大黄提取液与介孔四氧化三铁纳米颗粒、离子液体加水配成富集混合液，每1230μL富集混合液中包括以下组分：大黄提取液20μL、纳米介孔四氧化三铁8～20mg、离子液体0.2～0.6mg，余量为水，pH值9～13；所述富集混合液装入离心管，置于涡旋仪上涡旋10～30s，静置后用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液，得富集后的介孔四氧化三铁纳米颗粒，用含有质量分数1～4%乙酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，制得富集的大黄浸膏；所述离子液体为溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐，优选为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。本发明方法富集速度快，富集效果好，重复性和再现性高。

Description

一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法

技术领域

本发明属于天然药物提取制备领域。它涉及一种中药提取富集方法，具体地说，它涉及由离子液包裹介孔四氧化三铁纳米材料作为吸附剂，提取、富集中药大黄中有效成分的新方法。

背景技术

大黄是传统泻下类中药的代表，为历版《中国药典》和历代医家本草收载的常用中药，来源于蓼科植物药用大黄、掌叶大黄或唐古特大黄的干燥根及根茎，具有泻下攻积、逐瘀通经、利湿退黄、清热泻火、凉血解毒之功效。大黄中含有多种有效成分，其中以蒽醌类、二蒽酮类、茋类、鞣质和多糖研究最多，以芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等有效成分作为代表。其药理作用主要有调节胃肠功能、保护心脑血管、抗炎、抗病原微生物、抗肿瘤、保肝及抗衰老等。

在分析化学中，样品预处理的好坏直接影响分析结果的灵敏度和准确度。目前，样品分离富集最常用的方法仍是溶剂萃取法，而且多以甲醇或含卤溶剂（诸如二氯甲烷、三氯甲烷）为主，这类传统的分离富集方法存在费时、溶剂毒性大、用量多、环境污染严重等缺点。为提高分离富集效率，人们一直在探索新的分离富集技术。

目前较为先进的中药分离富集方法包括蒸馏法、顶空萃取法、固相微萃取法、超临界流体萃取法、分子印迹技术、膜富集技术、分子蒸馏及其耦合技术以及磁性富集技术等。

磁性介孔材料，兼具磁性材料和介孔材料的双重优势。如高吸附性、可磁分离性、高比表面积和孔径均一，具有重大的研究意义和广泛的应用前景，深受广大化学和材料工作者的青睐。因磁性介孔材料其优越的性能，故而在污水处理、催化反应、药物控释、生物分子的分离提纯领域有广泛的应用。目前，磁性介孔材料在中药及天然产物的分离富集领域尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于寻求一种相比以往富集方法更加快速高效的富集方法，用于提取富集天然产物中的活性成分。发明要点在于将磁性富集和离子液提取两者巧妙结合，充分发挥了这两种提取富集方式的优点，用这一组合技术提取富集天然产物中的有效成分，可以取得显著的效果。

本发明具体提供了一种以离子液包裹磁性纳米材料作为吸附剂的磁性富集技术，用于富集大黄中有效成分。

本发明采用的技术方案是：

一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法，其特征在于所述方法为：大黄药材或大黄固体制剂按照药典进行提取，制得大黄提取液，大黄提取液与介孔四氧化三铁纳米颗粒、离子液体加水配成富集混合液，每1230μL富集混合液中包括以下组分：大黄提取液20μL、纳米介孔四氧化三铁8～20mg、离子液体0.2～0.6mg，余量为水，pH值9～13；所述富集混合液装入离心管，置于涡旋仪上涡旋10～30s，静置（通常静置5～10min）后用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液，得富集后的介孔四氧化三铁纳米颗粒，用含有质量分数1～4%乙酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，制得富集的大黄浸膏；所述离子液体为溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐，优选为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。

进一步，优选每1230μL富集混合液中包括以下组分：大黄提取液20μL、纳米介孔四氧化三铁8mg、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.4mg，余量为水，pH值11。

所述洗脱优选用含有质量分数2%乙酸的甲醇溶液洗脱。更优选用含有质量分数2%乙酸的甲醇溶液洗脱三次，每次200μL。

本发明所述大黄药材或大黄固体制剂按照药典2010版进行提取，所述提取方法为：将大黄药材或大黄固体制剂粉碎，取粉末（过四号筛）0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得大黄提取液。

所述离子液体优选先加水配成10～60mg/mL的离子液体水溶液，用于配制富集混合液。配制时按照离子液体水溶液的浓度和富集混合液中离子液体的质量，计算并量取所需离子液体水溶液的体积即可。

所述介孔四氧化三铁纳米颗粒可以先加水、分散均匀配成50～100mg/mL的介孔四氧化三铁纳米分散液，用于配制富集混合液。配制时按照介孔四氧化三铁纳米分散液的浓度和富集混合液中介孔四氧化三铁纳米颗粒的质量，计算并量取介孔四氧化三铁纳米分散液的体积即可。

本发明富集混合液的pH值为9～13，优选pH值为11。pH值可利用氢氧化钠、盐酸来进行调节。

本发明所述介孔四氧化三铁纳米颗粒可按以下方法制得：

将氯化亚铁四水合物和氯化铁按照三价铁离子与二价铁离子的物质的量之比为3：2，加入100mL水中溶解，氮气保护下搅拌，制得铁的物质的量浓度为0.015mol/L的铁酸盐水溶液，并加入1g的聚乙二醇4000乳化剂，所得混合溶液中缓慢加入浓度为0.3mol/L的氨水直至pH=11.0，再经氮气保护，水浴50℃下超声30分钟，再加热至80℃，反应1小时后，过滤，滤饼依次用乙醇、二次蒸馏水洗涤，直至洗涤液pH=7.0，最后在60℃真空干燥4小时即得介孔四氧化三铁纳米颗粒。

这是本领域技术人员公知的方法。

所述洗脱液优选于80℃水浴锅中挥发除去溶剂，制得富集的大黄浸膏。

制得的富集的大黄浸膏可用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，超高效液相色谱（UPLC）进样分析。

所述的富集效果，通过Waters Acquity Uplc H-Class测定大黄中有效成分的含量来表征该富集方法的有效性。

本发明的优点在于：

1.首次采用了离子液包裹磁性介孔材料这一项新技术，用离子液对介孔四氧化三铁纳米粒子进行修饰，使其具备优越的分离富集性能，并且应用在天然产物提取富集领域。所采用的新型绿色提取体系——离子液表面活性剂体系，尤其是采用长链离子液——氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑作为提取剂用于分离富集大黄有效成分时，与单一采用介孔四氧化三铁纳米材料相比，富集效果提高10～60多倍。与未采用离子液包裹的介孔材料相比，灵敏度提高20～60倍左右。

2.本方法富集速度快。本方法的富集环节用到磁铁，在靠近磁铁附近时，强大的磁场作用能使磁性纳米颗粒迅速聚集，这样就使得本发明所述的富集环节几乎是瞬间即可完成，具有其他分离富集技术所无法比拟的高效和迅捷，远远胜过常规方法的富集效率。

3.本方法应用范围广泛，无论是大黄的原料药材还是大黄的药物制剂，均能用本发明方法进行分离富集。且本发明所述的测定大黄药材和大黄制剂这两个应用亦属首例。

4.无论是采用的离子液，还是四氧化三铁介孔材料，它们的理化性质均具备一系列优异突出的特性：对人体无毒、不污染环境，热稳定性和化学稳定性良好，不易燃。

5.本发明提供的实验操作步骤简洁明了，操作简单，操作环境安全，且富集效果高效显著。

即本发明提供了一种新方法，该方法将离子液技术与磁性纳米材料技术巧妙结合起来，能快速有效地富集天然产物中的有效成分。

附图说明

图1本发明磁性提取富集方法的工艺流程图。

图2为考察不同pH下的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图3为考察不同离子液种类的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。字母A、B、C、D分别代表不同的离子液，分别为：A：溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑；B：氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑；C：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐；D：1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐。

图4为考察不同离子液加入量的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图5为考察洗脱液中乙酸含量的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图6为考察介孔四氧化三铁加入量的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图7为大黄中五种有效成分的对照品混合液的液相色谱图。图中1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图8为大黄药材提取液的稀释液的液相色谱图。图中1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图9为大黄药材提取液富集后的液相色谱图。图中1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图10为大黄通便颗粒提取液的稀释液的液相色谱图。图中1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

图11为大黄通便颗粒富集后的液相色谱图。图中1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

具体实施方式

通过以下实例来对本发明所提供的离子液（购于上海成捷化学有限公司）包裹磁性纳米材料富集技术进行更为详细的描述。由于其应用范围广，故具体实施方案也多，下面将结合几个实例的讨论对本发明的内容作进一步的阐述。

实施例中介孔四氧化三铁纳米颗粒可按以下方法制得：

按比例将氯化亚铁四水合物和氯化铁溶解于100mL去离子水中，三价铁离子与二价铁离子的物质的量之比为3：2，氮气保护下搅拌，从而制得浓度为0.015mol/L的铁酸盐水溶液，并加入1g的聚乙二醇4000乳化剂。混合溶液中缓慢加入浓度为0.3mol/L的氨水直至pH=11.0。再经氮气保护，水浴50℃，持续超声30分钟。混合物再加热至80℃，反应1小时后，过滤，滤饼加入乙醇洗涤。再用二次蒸馏水洗涤，直至pH=7.0。最后在60℃真空干燥4小时即得介孔四氧化三铁纳米颗粒。加水配成80mg/mL的介孔四氧化三铁纳米分散液

实施例1.考察离子液种类对富集效果的影响

1.1 取4个干净的1.5mL规格离心管，编号为1、2、3、4。1-4均加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、pH=11的水1100μL、大黄药材提取液20μL。

1.2 在1号离心管中加入溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL，2号离心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL，3号离心管中加入1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐水溶液（40mg/mL）10μL，4号离心管中加入1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐水溶液（40mg/mL）10μL。

1.3 将4个离心管一同置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

1.4 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

1.5 用含有2%乙酸的甲醇溶液对4个离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒均洗脱三次，每次200μL。另取干净的4个离心管编号a，b，c，d，对应1、2、3、4离心管，合并装入洗脱液。将a，b，c，d离心管置于80℃水浴锅中挥干。

1.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用超高效液相色谱（UPLC）进样分析。

UPLC色谱条件为：

色谱柱：ACQUITY UPLC

BEH C18，1.7μm，2.1×50mm（Waters）。流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B），0～1min，B为25%～30%；1～3min，B为30%～45%；3～5min，B为45%～60%；5～7min，B为60%～80%；7～8min，B为80%～100%；8～8.5min，B为100%～100%；8.5～10min，B为100%～25%。流速0.5mL/min，进样量1.0μL，检测波长254nm，柱温30℃。

实验结果如下表1，表1中的数据为峰面积。

表1

A：溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑

B：氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑

C：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐

D：1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐

图3也显示了不同离子液种类的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。字母A、B、C、D分别代表不同的离子液，分别为：A：溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑；B：氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑；C：1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐；D：1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐。

通过比较峰面积可以发现，比较长链离子液A、B和短链离子液C、D，可以发现长链离子液的富集效果更好，而在长链离子液中，使用氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液是最佳条件，而且4种离子液的色谱峰形最优者为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液富集，而且富集后的溶液呈黄色，用氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液富集之后的颜色最深。

实施例2.考察不同离子液加入体积对富集效果的影响

2.1 取4个干净的1.5mL规格离心管，编号为1、2、3、4。1-4均加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、大黄药材提取液20μL。

2.2 在1号离心管中加入纯水10μL和pH=11的水1100μL，2号离心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）5μL和pH=11的水1105μL，3号离心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL和pH=11的水1100μL，4号离心管中加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）15μL和pH=11的水1095μL。

2.3 将4个离心管一同置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

2.4 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

2.5 用含有2%乙酸的甲醇溶液对4个离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒均洗脱三次，每次200μL。另取干净的4个离心管编号a，b，c，d，对应1、2、3、4离心管，合并装入洗脱液。将a，b，c，d离心管置于80℃水浴锅中挥干。

2.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

实验结果如下表2，表2中的数据为峰面积。

表2

图4显示了不同离子液加入量的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

通过比较峰面积可以发现，随着离子液体加入量的变大，富集效果呈现上升趋势，并在10μL（即0.4mg）处富集效果达到最大值，随后富集效果随着离子液加入量的增大而降低，所以加入氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液体积为10μL（即0.4mg）是最佳条件，而且4种情况的色谱峰形最优者为10μL。而且富集后的溶液呈黄色，用氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液10μL富集之后的颜色最深。

实施例3.考察不同pH值对富集效果的影响

3.1 取4个干净的1.5mL规格离心管，编号为1，2，3，4。1-4均加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL、大黄药材提取液20μL。

3.2 在1号离心管中加入pH=5的水1100μL，2号离心管中加入pH=7的水1100μL，3号离心管中加入pH=9的水1100μL，4号离心管中加入pH=11的水1100μL，5号离心管中加入pH=13的水1100μL。

3.3 将4个离心管一同置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

3.4 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

3.5 用含有2%乙酸的甲醇溶液对4个离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒均洗脱三次，每次200μL。另取干净的4个离心管编号a，b，c，d，对应1，2，3，4离心管合并装入洗脱液。将a，b，c，d离心管置于80℃水浴锅中挥干。

3.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

实验结果如下表3，表3中的数据为峰面积。

表3

图2也显示了不同pH下的富集效果柱状图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

通过比较峰面积可以发现，富集环境从酸性的pH=5一直增大到碱性的pH=11，富集效果递增十分明显，并且在pH=11处达到富集效果的最优值，但随后随着pH的加大，富集效果降低，所以水的pH=11是最佳条件，而且4种情况的色谱峰形最优者为pH=11。而且富集后的溶液呈黄色，用pH=11的水富集之后的颜色最深。

实施例4.考察洗脱液中的乙酸含量对富集效果的影响

4.1 取6个干净的1.5mL规格离心管，编号为1、2、3、4、5、6。1-6均加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、pH=11的水1100μL、大黄药材提取液20μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL。

4.2 将6个离心管一同置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

4.3 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

4.4 用纯甲醇、含有1%乙酸的甲醇溶液、含有2%乙酸的甲醇溶液、含有3%乙酸的甲醇溶液、含有4%乙酸的甲醇溶液、含有5%乙酸的甲醇溶液，分别对1、2、3、4、5、6号离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒洗脱三次，每次200μL。

4.5 另取干净的6个离心管编号a、b、c、d、e、f，对应1、2、3、4、5、6离心管，合并装入洗脱液。将a、b、c、d、e、f离心管置于80℃水浴锅中挥干。

4.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

实验结果如下表4，表4中的数据为峰面积。

表4

通过比较峰面积可以发现，随着甲醇洗脱液中乙酸含量的增加，富集效果逐项成上升趋势，并且在2%处达到最佳值，随后用3%、4%和5%，尽管在4%实验数据较大，但仍然存在下降趋势，而且6种情况的色谱峰形最优者为含2%乙酸的甲醇洗脱。而且富集后的溶液呈黄色，用含2%乙酸的甲醇洗脱的水富集之后的颜色最深。

实施例5.考察介孔四氧化三铁纳米分散液加入量对富集效果的影响

5.1 取5个干净的1.5mL规格离心管，编号为1、2、3、4，5。1加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）50μL和pH=11的水1150μL，2加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL和pH=11的水1100μL，3加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）150μL和pH=11的水1050μL，4加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）200μL和pH=11的水1000μL，5加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）250μL和pH=11的水950μL。

5.2 在1-4号离心管中均加入大黄药材提取液20μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL。

5.3 将4个离心管一同置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

5.4 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

5.5 用含有2%乙酸的甲醇溶液对4个离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒均洗脱三次，每次200μL。另取干净的4个离心管编号A、B、C、D、E，对应1、2、3、4、5离心管，合并装入洗脱液。将A、B、C、D、E离心管置于80℃水浴锅中挥干。

5.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

实验结果如下表5，表5中的数据为峰面积。

表5

图6也显示了介孔四氧化三铁加入量的富集效果折线图。图中，1、2、3、4、5分别代表大黄中不同的有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

通过比较峰面积可以发现，随着介孔四氧化三铁用量的增加，富集效果递增，而且在100μL（即8mg）处达到最大值，之后随着介孔四氧化三铁用量的增加，富集效果反而呈现降低趋势，所以用100μL（即8mg）介孔四氧化三铁纳米分散液富集是最佳条件，而且5种情况的色谱峰形最好看的是用100μL（即8mg）介孔四氧化三铁纳米分散液富集的那一图，而且富集后的溶液呈黄色，用100μL介孔四氧化三铁纳米分散液富集之后的颜色最深。

实施例6.测定大黄药材和大黄通便颗粒中的有效成分含量。

6.1 参照药典，分别制备出大黄药材提取液和大黄通便颗粒制剂提取液。

6.2 取1个干净的1.5mL规格离心管，加入介孔四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、pH=11的水1100μL、大黄药材提取液（或大黄通便颗粒制剂提取液）20μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）10μL。

6.3 将离心管置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

6.4 用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

6.5 用含有2%乙酸的甲醇溶液对离心管中的介孔四氧化三铁纳米颗粒洗脱三次，每次200μL。另取1个干净的离心管，装入合并的洗脱液。将离心管置于80℃水浴锅中挥干。

6.6 挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

图7为大黄中五种有效成分的对照品混合液的液相色谱图，图8为大黄药材提取液20μL加水稀释到1230μL所得的稀释液的液相色谱图，图9为大黄药材提取液富集后的液相色谱图，图10为大黄通便颗粒提取液20μL加水稀释到1230μL所得的稀释液的液相色谱图，图11为大黄通便颗粒提取液富集后的液相色谱图，其中色谱峰附近的数字1、2、3、4、5代表着大黄中的5种有效成分，分别为：1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。

UPLC的色谱条件为：

色谱柱：ACQUITY UPLC

图7中大黄对照品混合液的组分为1：芦荟大黄素；2：大黄酸；3：大黄素；4：大黄酚；5：大黄素甲醚。配制不同浓度的对照品混合液，分别以对照品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制不同成分的标准曲线。大黄药材提取液、大黄通便颗粒提取液经富集提取后，测定液相色谱，根据不同成分的峰面积，对照标准曲线，计算得到富集后的浸膏中有效成分含量。

经测定，大黄药材富集后的浸膏中芦荟大黄素含量为34.0509mg/g，大黄酸为29.2430mg/g，大黄素为44.4274mg/g，大黄酚为45.5848mg/g，大黄素甲醚为11.0515mg/g。

经测定，大黄通便颗粒富集后的浸膏中芦荟大黄素含量为13.1308mg/g，大黄酸为15.1600mg/g，大黄素为16.5124mg/g，大黄酚为20.8407mg/g，大黄素甲醚为5.8622mg/g。

本方法的富集效果（用检测限表示）见下表6。

表6

未经过富集提取是指大黄药材提取液20μL加水稀释到1230μL所得的稀释液进行色谱检测的检测限。可明显看出，经过富集后检测限降低，灵敏度显著提高。

本发明中的大黄稀释液浓度：97.56μg/mL；

为了进一步验证本方法的可行性，进行了方法学的考察包括日内精密度、日间精密度、重复性以及加样回收率。

精密度

日内精密度：精密吸取50μg/mL对照品溶液，重复进样6次，按本发明方法所述色谱条件进行测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积的RSD均小于0.3%；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的保留时间的RSD均小于0.4%，表明仪器日内精密度良好。

日间精密度：精密吸取50μg/mL对照品溶液，连续进样3天，每天进样2次，按本发明方法所述色谱条件进行测定，结果芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积的RSD均小于1.2%；芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的保留时间的RSD均小于0.7%，表明仪器日间精密度良好。

重复性

平行做3次

1.取3个干净的1.5mL规格离心管，加入四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、pH=11的纯水1100μL、大黄药材提取液20μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）5μL。

2.将3个离心管置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

3.分别用磁铁靠近离心管底部，将四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

4.用含有2%乙酸的甲醇溶液分别对3个离心管中的四氧化三铁纳米颗粒洗脱三次，每次200μL。另取3个干净的离心管，装入合并的洗脱液。将3个离心管置于80℃水浴锅中挥干。

5.挥干后的残留固体用纯甲醇50μL溶解，超声2min，置于13000rpm离心仪中离心5min，取上层清液装样，用UPLC进样分析。

加样回收率

平行做3次

1.取3个干净的1.5mL规格离心管，加入四氧化三铁纳米分散液（80mg/mL）100μL、pH=11的纯水1100μL、大黄药材提取液10μL、50μg/mL的大黄混标10μL、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑水溶液（40mg/mL）5μL。

2.将离心管置于涡旋仪上涡旋10s，静置5min。

3.用磁铁靠近离心管底部，将四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液。

4.用含有2%乙酸的甲醇溶液对离心管中的四氧化三铁纳米颗粒洗脱三次，每次200μL。另取3个干净的离心管，装入合并的洗脱液。将离心管置于80℃水浴锅中挥干。

大黄磁性富集的方法学考察数据结果见下表7。

表7

结果表明，本发明方法的重复性良好，回收率高，检测准确性高。

Claims

1.一种大黄中有效成分的磁性提取富集方法，其特征在于所述方法为：大黄药材或大黄固体制剂按照药典进行提取，制得大黄提取液，大黄提取液与介孔四氧化三铁纳米颗粒、离子液体加水配成富集混合液，每1230μL富集混合液中包括以下组分：大黄提取液20μL、纳米介孔四氧化三铁8～20mg、离子液体0.2～0.6mg，余量为水，pH值9～13；所述富集混合液装入离心管，置于涡旋仪上涡旋10～30s，静置后用磁铁靠近离心管底部，将介孔四氧化三铁纳米颗粒聚集于离心管底部，弃去上层水溶液，得富集后的介孔四氧化三铁纳米颗粒，用含有质量分数1～4%乙酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，蒸干，制得富集的大黄浸膏；所述离子液体为溴化1-十二烷基-3-甲基咪唑、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐或1-丁基-3-甲基咪唑聚苯乙烯磺酸盐。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体为氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于每1230μL富集混合液中包括以下组分：大黄提取液20μL、纳米介孔四氧化三铁8mg、氯化1-十二烷基-3-甲基咪唑0.4mg，余量为水，pH值11。

4.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述洗脱用含有质量分数2%乙酸的甲醇溶液洗脱。

5.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述大黄药材或大黄固体制剂按照药典2010版进行提取，所述提取方法为：将大黄药材或大黄固体制剂粉碎，取粉末（过四号筛）0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加人甲醇25mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10mL，超声处理2分钟，再加三氯甲烷10mL，加热回流1小时，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得大黄提取液。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述离子液体先加水配成10～60mg/mL的离子液体水溶液，用于配制富集混合液。

7.如权利要求1～3之一所述的方法，其特征在于所述介孔四氧化三铁纳米颗粒先加水、分散均匀配成50～100mg/mL的介孔四氧化三铁纳米分散液，用于配制富集混合液。

8.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述洗脱用含有质量分数2%乙酸的甲醇溶液洗脱三次，每次200μL。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述洗脱液于80℃水浴锅中挥发除去溶剂，制得富集的大黄浸膏。