CN104177509A - 一种基于环氧基磁性微球的多糖提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物活性物质的分离技术领域，提供了一种磁性微球制备方法以及利用该微球从水性基质中提取水溶性多糖的方法。首先将柠檬酸修饰的磁性纳米粒与水玻璃混合，超声分散于含乳化剂的二氯甲烷中形成油包水型乳液，将乳液倒入缓冲液中，水玻璃固化形成二氧化硅基质的磁性微球。用环氧基硅烷进行表面修饰后，将微球加入多糖粗提液中，加入1~2倍乙醇，多糖形成絮状沉淀将磁性微球包裹，继而用磁铁实现固液分离。该方法的多糖回收率与传统离心方法相当，但蛋白类杂质含量显著降低，且步骤简化，耗时只有传统方法的十分之一，磁性微球可重复利用。在生物分离领域，尤其是动植物及真菌多糖的提取、分离以及分析样品的前处理领域具有广阔的应用前景。

Description

一种基于环氧基磁性微球的多糖提取方法

技术领域

本发明涉及生物活性物质分离技术领域，特别涉及一种利用表面修饰的磁性微球从含有多糖的水性基质中提取多糖类物质的方法。

背景技术

多糖是由单糖连接而成的多聚物，广泛存在于动物、植物、真菌及微生物中。多糖类物质在免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、延缓衰老、保肝等多方面具有显著的药用或保健价值，且对人体几乎无毒副作用，因此引起了药物研发及保健食品领域的广泛关注，这也使得多糖提取纯化方法的研究受到重视。

多糖的提取方法传统上采用水提醇沉法，这主要是基于多糖溶于水而不溶于有机溶剂的特性。即先用水或含酸、碱的水作为溶剂将多糖提取出来，离心除去固体杂质后再加入乙醇，使多糖沉淀出来，离心收集沉淀即为多糖。由于蛋白质的溶解性与多糖相似，因此所得沉淀中通常含大量蛋白质，需要通过后续步骤除去蛋白。这种方法的缺点是步骤繁琐，耗时较长，离心收集沉淀的步骤不适合大规模制备；后续除蛋白过程中需要用到氯仿、正丁醇、三氯乙酸等蛋白变性剂，可能存在残留且对环境极不友好。

磁性微球在化学分离领域已经有了广泛的应用，用磁性微球分离DNA、RNA、蛋白质和多肽等均有应用实例，其主要优势是操作简单，速度极快，且不需要特殊的设备，仅需一块磁铁；更重要的是磁性微球的表面可以进行不同的化学修饰，可以选择性的吸附目标物。但目前未见用磁性微球提取多糖的专利或文献。

综上，本专利提出，在水提醇沉法过程中，利用经过环氧基硅烷试剂修饰的磁性微球来辅助多糖提取，其原理并非多糖被磁性微球的表面吸附，而是多糖所形成的絮状沉淀将磁性微球包裹起来，外磁场在吸引微球的同时便实现了多糖的固液分离。与传统的离心方法相比，这种基于磁性微球的方法可以简化步骤，节约时间，并且其所得产物中蛋白含量远低于传统方法，减轻了后续纯化步骤的压力；这一方法也适合从极复杂的基质中大规模提取多糖。

发明内容

本发明的内容在于提供一种从水性基质中提取水溶性多糖的方法。该方法基于环氧基修饰的磁性微球，在水提醇沉法提取多糖的过程中，可以简化操作步骤，节约时间，提高多糖纯度。 

本发明的另一目的是提供一种能适应上述多糖提取方法的磁性微球制备方法。

本发明的技术方案是：

（1）磁性微球的制备及表面修饰

将柠檬酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒子分散到3号水玻璃中，再将此混合物加入含OP乳化剂和司盘-80的二氯甲烷中，超声乳化得到油包水型乳液；在磁粒搅拌下将此乳液倒入硫酸铵水溶液中，搅拌过程中，水玻璃乳滴逐渐从二氯甲烷中转移至硫酸铵溶液中，水玻璃固化为二氧化硅微球，并将磁性纳米粒包埋在其中。用磁铁吸出固体物质，蒸馏水洗涤两次。上述步骤中的二氯甲烷也可换为石油醚或氯仿，硫酸铵也可以是氯化铵或碳酸氢钠。

称取1g干燥后的磁性微球，超声分散于浓度为60%~80%的乙醇中，加入氨水作催化剂及硅烷试剂KH560（γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷），密封后置于摇床中，25℃振摇5h。硅烷试剂水解后覆盖在磁性微球表面，使其表面为环氧基。磁铁吸出固体物质，弃去液体后再用乙醇洗涤两次，得到表面为环氧基的磁性微球。

上述步骤中的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷也可换为四乙氧基硅烷或γ-氨基丙基三乙氧基硅烷，则对应的磁性微球表面官能团则为硅羟基或氨基。

（2）磁性微球辅助的多糖提取方法

含有蛋白质等杂质的多糖粗提液，加入一定量磁性微球，振摇1min使磁性微球分散均匀，加入一定量乙醇，振摇1min使多糖沉淀析出，用磁铁吸附固体物质，弃去上清液，加入适量蒸馏水，振摇1min后再次吸出磁性微球，上清液即为提取出的多糖溶液。

本发明具有以下特点：①步骤简单，节约时间；②磁性微球可重复利用；③产物中蛋白质含量较低；④得到的产物为溶液状态，不需复溶即可直接进行后续的含量检测或其它操作。 

具体实施方式

实施例1： 磁性微球的制备及其用于茯苓多糖的提取

取1g柠檬酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒子，加入2 mL水超声分散，与10mL 3号水玻璃混合均匀，称为水相。取0.5g OP乳化剂和3g司盘-80，用20 mL二氯甲烷溶解，称为油相。将水相与油相混合并用超声波细胞破碎仪处理5 min，得到油包水型乳液；取2mol/L的硫酸铵水溶液75mL安置于磁力搅拌器上，转速800rpm，将乳液缓缓加入，继续搅拌1h，用磁铁吸出固体物质，并用蒸馏水洗涤两次，得到平均粒径5μm的磁性微球，球形较为圆整。将微球分散到100倍体积的水中静置30min，再弃去上层液体可以去除其中粒径过小的部分粒子，使粒径更均一。

将上述磁性微球在100℃烘箱中干燥5h，取1g磁性微球，超声分散于50mL浓度为75%的乙醇中，加入氨水0.5mL及γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷0.5mL，密封后置于摇床中，25℃振摇5h。磁铁吸出固体物质，弃去液体后再用30mL乙醇洗涤两次，得到表面为环氧基的磁性微球。

干燥的茯苓饮片100g粉碎成粗粉，加400mL水浸泡30min，回流提取2h，用纱布过滤，得到上层浑浊液体即为多糖粗提液。取多糖粗提液2mL，加入一定量磁性微球（0.02g~0.1g），再加入2mL乙醇，振摇1min，磁铁吸附固体物，弃去上清，加入2mL蒸馏水洗脱多糖，吸出磁性微球，上清液便为提取出的多糖溶液。从多糖粗提液中提取纯化多糖的过程耗时约3min。用苯酚-硫酸法对提取出的多糖含量进行测定（加入苯酚、硫酸后在485nm下测定吸光度），结果见表1。当磁性微球用量达到0.08g时，多糖含量达到最大值。

另用传统离心法提取多糖：干燥的茯苓饮片100g粉碎成粗粉，加400mL水浸泡30min，回流提取2h，用纱布过滤，得到上层浑浊液体即为多糖粗提液，将多糖粗提液4000rpm离心20min以除去固体杂质，取上清液2mL，加入2mL乙醇，振摇1min放入离心机4000rpm离心20min，弃去上清液，固体沉淀为提取出的多糖，由于2次离心均需较长时间，因此从粗提液中纯化多糖整个过程耗时需50min。加入2mL水复溶，用苯酚硫酸法测定其多糖含量，结果吸光度为1.836。说明磁性微球与传统的离心法相比多糖的提取效率几乎相当，但本发明省掉了传统方法中两次离心过程，步骤简化，耗时不到传统方法的十分之一。

实施例2： 不同表面性质磁性微球对茯苓多糖提取纯度的影响

取1g柠檬酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒子，加入1 mL水超声分散，与5mL 3号水玻璃混合均匀，称为水相。取0.3g OP乳化剂和2g司盘-80，用20 mL氯仿溶解，称为油相。将水相与油相混合并用高速剪切乳化仪处理5 min，得到油包水型乳液；取饱和碳酸氢钠水溶液75mL安置于磁粒搅拌器上，转速800rpm，将乳液缓缓加入，继续搅拌1h，用磁铁吸出固体物质，并用蒸馏水洗涤两次，得到磁性微球。

将上述磁性微球在100℃烘箱中干燥5h，取三份磁性微球，每份1g，分别超声分散于50mL浓度为65%的乙醇中，加入氨水0.5mL，在三份样品中分别加入四乙氧基硅烷、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷及氨丙基三甲氧基硅烷0.8mL，密封后置于摇床中，25℃振摇5h。磁铁吸出固体物质，弃去液体后再用30mL乙醇洗涤两次，分别得到得到表面为硅羟基、环氧基、氨基的磁性微球。

干燥的茯苓饮片100g粉碎成粗粉，加400mL水浸泡30min，回流提取2h，静置后取上层浑浊液体，为多糖粗提液。取三份多糖粗提液，每份2mL，分别加入硅羟基、环氧基、氨基修饰的磁性微球各0.08g，再加入2mL乙醇，振摇1min，磁铁吸附固体物，弃去上清，加入2mL蒸馏水洗脱多糖，吸出磁性微球。多糖洗脱液直接在280nm出测定吸光度可以反映蛋白类杂质的含量，三种磁性微球所提多糖以及用实施例1中传统离心法所得产物的吸光度见表2。上述四个样品进行多糖含量的测定（苯酚-硫酸法），485nm下测定的吸光度见表2。表2结果说明，氨基修饰的磁性微球与传统方法所得样品中蛋白质含量相当，而硅羟基和环氧基修饰的微球提取出的多糖样品中蛋白含量明显较少。氨基修饰及环氧基修饰的磁性微球多糖提取率较高，与传统离心法相当。综上可认为，环氧基修饰的磁性微球是较为理想的多糖提取材料。由于环氧基在碱性条件（氨水）下会水解开环，因此我们推测所谓“环氧基”磁性微球，其表面除了环氧基之外，也可能有开环反应形成的二醇基或其它基团。

实施例3：磁性微球辅助丹参多糖的提取

取1g柠檬酸钠修饰的四氧化三铁纳米粒子，加入1mL水超声分散，与10mL 3号水玻璃混合均匀，称为水相。取0.5g OP乳化剂和3g司盘-80，用20 mL石油醚溶解，称为油相。将水相与油相混合并用超声波细胞破碎仪处理5 min，得到油包水型乳液；取2mol/L的氯化铵水溶液75mL安置于磁粒搅拌器上，转速800rpm，将乳液缓缓加入，继续搅拌1h，用磁铁吸出固体物质，并用蒸馏水洗涤两次，得到磁性微球。

将上述磁性微球在100℃烘箱中干燥5h，取1g磁性微球，超声分散于50mL浓度为75%的乙醇中，加入氨水0.5mL及γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷0.5mL，密封后置于摇床中，25℃振摇5h。磁铁吸出固体物质，弃去液体后再用30mL乙醇洗涤两次，得到表面为环氧基的磁性微球。

干燥的丹参饮片100g粉碎成粗粉，加400mL水浸泡30min，回流提取2h，静置后用纱布过滤取滤液，为多糖粗提液。取多糖粗提液2mL，加入0.1g磁性微球，再加入4mL乙醇，振摇1min，磁铁吸附固体物，弃去上清，加入2mL蒸馏水洗脱多糖，吸出磁性微球，上清液为提取出的多糖溶液，从粗提液中提取（纯化）多糖耗时约3min。用苯酚-硫酸法对提取出的多糖含量进行测定，即加入苯酚、硫酸后在485nm下测定其吸光度为0.744。

另外用传统离心法提取多糖：干燥的丹参饮片100g粉碎成粗粉，加400mL水浸泡30min，回流提取2h，静置后用纱布过滤取滤液，4000rpm离心20min以除去固体残渣，得到多糖粗提液。取上述多糖粗提液2mL，加入4mL乙醇，振摇1min放入离心机4000rpm离心20min，弃去上清液，固体沉淀为提取出的多糖，用2mL蒸馏水将多糖沉淀复溶，用苯酚-硫酸法测得其吸光度为0.765。说明本发明中的新方法具有与传统方法相当的多糖回收率。而新方法与传统离心法所得样品在280nm出吸光度分别为1.34和2.13，说明新方法所得产品中蛋白类杂质含量明显少于传统方法。

以上3例中可以看出，传统方法需要两次离心过程，目的分别是除去固体杂质和得到多糖沉淀，因此耗时较长且不适合大规模制备，但本发明中的方法不需预先除去固体杂质且直接用磁铁即可快速回收多糖，因此步骤明显简化，耗时只需传统方法的十分之一，优势十分明显。

表1. 磁性微球用量与多糖提取量之间的关系

磁性微球的用量（g）	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1
						吸光度	1.230	1.514	1.682	1.834	1.834

表2. 不同方法所提多糖样品中蛋白质和多糖含量测定结果

微球种类	硅羟基修饰	环氧基修饰	氨基修饰	传统离心法
					蛋白含量（280nm吸光度）	0.625	0.902	1.984	1.955
多糖含量（苯酚-硫酸法）	1.625	1.802	1.901	1.912

Claims (6)

1.一种多糖提取方法，可以将水溶性多糖从粗提物水溶液中快速提取出来，且能同时除去部分蛋白。

2.如权利要求1所述的多糖提取方法，其步骤是在多糖粗提物水溶液中加入磁性微球，摇匀后再加入一定量乙醇使多糖析出，磁性微球被多糖的絮状沉淀缠绕，在外加磁场作用下实现固液分离，这与已有的磁性分离方法使目标分子吸附到磁性微球表面而分离的原理具有显著的不同。

3.如权利要求2所述磁性微球，其表面为环氧基或兼有环氧基开环生成的其它基团，该表面性质可以去除粗提物中的部分蛋白质，提高产物的纯度。

4.如权利要求2所述磁性微球，其基制可以是无机物或有机物，结构可以是包埋型或核-壳型，内部含有磁性粒子，外部为二氧化硅层，以便进行环氧基修饰。

5.如权利要求2所述乙醇也可用异丙醇或甲醇代替；加入有机溶剂的量为原粗提液体积的1~3倍。

6.一种适用于多糖提取的磁性微球制备方法，该方法以廉价的水玻璃为基质原料，将其与磁性纳米粒子混合后，先分散到二氯甲烷或石油醚或氯仿中形成油包水型乳液，再将此乳液混悬至盐溶液中，当水玻璃形成的乳滴进入盐溶液中时，会固化形成二氧化硅基质的磁性微球，该方法步骤简便、成本较低，适合大量生产。