CN1896095A - 灵芝糖肽产品及其生产方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种灵芝糖肽产品及其生产方法和用途。本发明属于真菌功能产品开发领域，特别是涉及灵芝糖肽产品及其生产方法。本发明的灵芝糖肽产品中糖肽含量占20－40％，其余部分为灵芝多糖。本发明产品可以做成胶囊或片剂形式。灵芝糖肽产品生产方包括：发酵液的培养，外加酶酶解，灭酶，均质处理，浓缩，醇沉，沉淀物溶解，膜过滤，喷雾干燥。本发明产品在防治肿瘤方面具有良好的用途。
Description
技术领域
本发明属于真菌功能产品开发领域，特别是涉及灵芝糖肽产品及其生产方法。
背景技术
灵芝[Ganoderema lucidum(Leyss ex Fr.)karst]，又称灵芝草，属担子菌亚门、多孔菌目、灵芝科、灵芝属。历代的医典把灵芝归位于“上上药”，其排位在人参之前。《神农本草经》、《本草纲目》记载，灵芝可明目、补肝气、安神、益精、益心气、益脾气、益肺气、益肾气、通九窍、耳聪、目明、利关节、利尿、养颜美容，是上好的滋补佳品。
灵芝糖肽是一类以灵芝多糖结构为主连接有多肽、氨基酸的大分子物质，灵芝糖肽主要存在于灵芝菌子实体、菌丝体和发酵液中。灵芝糖肽是灵芝菌生长过程中代谢形成的生物活性物质。灵芝糖肽能促进蛋白质、核酸的合成，对血清、肝脏及骨髓细胞蛋白质或核酸的更新、合成有促进作用，它是灵芝扶正固本的主要有效成分之一。灵芝糖肽的功能性与其分子量有一定的关系。灵芝糖肽结构中的多糖分子为分支结构，糖苷键以β-1，4键为主，β-1，6键为辅。
发明内容：
本发明的目的是提供一种灵芝糖肽产品及其生产方法和用途。
本发明的灵芝糖肽产品组成为：分子量分布在2000DA以上。糖肽含量占20-40％，其余部分为灵芝多糖。
本发明产品可以做成胶囊或片剂形式。
本发明灵芝糖肽产品生产方法概述如下：
(1)发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝真菌液体深层发酵液；
(2)外加酶酶解：将步骤(2)中得到的发酵液分别调整温度和pH，使温度为45～65℃，pH为5～7，发酵液中加入混合酶，混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，混合酶按重量百分比组成为：纤维素酶30～60％、其余为β-葡聚糖酶，酶解时间0.3～3小时，酶解过程中不断搅拌；
(3)灭酶：酶控制反应结束后，将发酵液升温到90～95℃，保持10～30分钟，进行灭酶；
(4)均质处理：将发酵液输送给胶体磨，调整胶体磨定子与转子的间隙为10～50微米，对发酵液中菌丝体进行破碎，胶体磨流量为1～5吨/小时；再经高压均质机处理，调整高压均质机压力为20～60Mpa，高压均质流量为0.5～3吨/小时，显微镜镜检菌丝体破壁率为100％；
(5)浓缩：将发酵液浓缩至原体积的1/5～1/10，浓缩所用方法可以是单效、多效真空浓缩和冷冻浓缩；
(6)醇沉：向浓缩滤液中加入70～100％的乙醇进行醇沉，其体积比为1∶3～4，处理时间14小时；
(7)沉淀物溶解：沉淀物加热水溶解。
(8)膜过滤：采用2000DA膜进行过滤，收集2000DA以上的组分。
(9)喷雾干燥：将上述收集的滤液通过喷雾干燥得到干粉。
本发明中灵芝真菌液体深层发酵液的培养见徐锦堂编《中国药用真菌学》。
本发明中灵芝真菌保藏于中国工业微生物菌种保藏中心，菌种分别为cicc14025，cicc14028，cicc14029.
本发明中采用酶解处理工艺有效的实现了灵芝糖肽中大分子糖链的切割，有效提高了产物中高活性糖肽的含量。
本发明中得到的灵芝糖肽干粉可以原料、胶囊或片剂形式存在。
本发明在培养得到的灵芝真菌发酵液的基础上，巧妙地利用外加的混合酶在适宜的条件下对真菌发酵液进行酶解，酶解后经过提取分离得到含量在20-40％的灵芝糖肽粗产品，其余部分为灵芝多糖。
本发明中采用高压均质工艺实现了菌丝体功能因子的高效溶出和完全利用。
本发明中灵芝糖肽的检测主要采用电泳和苯酚硫酸测定法，具体测定方法见举例
本发明产品在抑制肿瘤细胞繁殖方面效果显著。实验结果见具体举例。
具体实施方式：
下面的实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
10吨发酵液生产灵芝糖肽方法
(1)采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝液体深层发酵液：将灵芝斜面菌种接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行一级种子培养，培养条件：旋转式摇床150转/分，28℃培养50小时。然后将一级摇瓶种子以10％接种量接入装有100毫升培养基的500毫升摇瓶中进行二级种子培养，按照与一级摇瓶相同的条件进行培养。然后再以10％的接种量将二级种子转接入装有1000毫升培养基的5000毫升摇瓶中进行三级种子培养，培养条件：旋转式摇床180转/分，28℃培养50小时。然后再以10％的接种量把三级种子接入装有0.1吨发酵培养基的总容积为0.15吨的一级种子罐。培养条件为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养48小时。同样将一级种子罐的菌液以10％的接种量转接入装有1吨发酵培养基的总容积为1.5吨二级种子罐中，二级种子罐与一级种子罐的培养条件相同。最后以10％的接种量将二级种子罐种子接入装有10吨发酵培养基的总容积为15吨的发酵罐中。发酵罐培养温度28℃，搅拌速度100转/分，通风量(V/V)1∶0.5，罐压0.05Mpa，培养120小时。
(2)外加酶酶解：在55℃，pH为6的条件下，向经步骤(1)得到的10吨发酵液中加入纤维素酶1.5公斤，β-葡聚糖酶1.5公斤。酶解时间3小时，酶解过程中开启搅拌；
(3)灭酶：外加酶酶解结束后，将发酵液升温到95℃，30分钟，进行灭酶；
(4)均质处理：将发酵液输送给胶体磨，调整胶体磨定子与转子的间隙为30微米，对发酵液中菌丝体进行破碎，胶体磨流量为3吨/小时；再经高压均质机处理，调整高压均质机压力为40Mpa，高压均质流量为2吨/小时，显微镜镜检菌丝体破壁率为100％；
(5)浓缩：减压浓缩滤液体积到1吨；
(7)醇沉：加入3.8吨95％的乙醇，醇析14小时；
(8)沉淀物溶解：沉淀物加热水溶解。
(9)膜过滤：采用2000DA的膜进行过滤，收集2000DA以上的组分。
(10)喷雾干燥：将上述收集的滤液通过喷雾干燥得到干粉。
本产品中灵芝糖肽含量在30％，其余部分为灵芝多糖。
本发明中灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌号：CICC 14025。
本例中斜面培养基组成：马铃薯(煮汁)20％，葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.10％，琼脂2.0％。
本例中各级种子和发酵生产所用培养基组成为：蔗糖4％，葡萄糖2％，蛋白胨0.5％，脱脂大豆蛋白粉2.0％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.1％，维生素B12PPm，PH6.0。
实施例2(发酵液10吨)
10吨发酵液生产灵芝糖肽方法
(1)发酵液的制备方法同例1。
(2)外加酶酶解：在55℃，pH为6的条件下，向经步骤(1)得到的10吨发酵液中加入纤维素酶2公斤，β-葡聚糖酶1.5公斤。酶解时间3小时，酶解过程中开启搅拌；
(3)灭酶：外加酶酶解结束后，将发酵液升温到95℃，30分钟，进行灭酶；
(4)均质处理：采用均质机和胶体磨依次处理发酵液，对菌丝体细胞壁进行破壁处理；调整胶体磨定子与转子的间隙为0.5微米，利用其剪切力作用对发酵液中的菌丝体进行一级破壁处理，胶体磨流量为0.3吨/小时，使破壁后的菌丝体颗粒度为0.4微米的占70％；然后采用破碎粒度在0.3微米的高压均质机，利用其高压释放力、空穴效应、剪切等力的作用，对发酵液中的菌丝体进行超微破壁，调整高压均质机压力为80Mpa，高压均质流量为0.4吨/小时，使处理后物料粒度为60纳米的占80％；
(5)浓缩：减压浓缩滤液体积到1吨；
(7)醇沉：加入3.8吨95％的乙醇，醇析14小时；
(8)沉淀物溶解：沉淀物加热水溶解。
(9)膜过滤：采用5000DA和70000DA的膜进行过滤，收集5000DA和70000DA之间的组分。
(10)喷雾干燥：将上述收集的滤液通过喷雾干燥得到干粉。
产品经检测其中灵芝糖肽含量占30％。
本发明中灵芝菌种购于中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌号：CICC 14028。
实施例3。
灵芝糖肽检测方法
1.1仪器设备………………………………………………………..
垂直板电泳槽(北京六一仪器厂)
直流稳压电源(北京六一仪器厂)
1.2实验材料………………………………………………………..
Tris、甘氨酸、过硫酸铵、盐酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺
1.3试剂配置：
1)电极缓冲液：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml。
2)10％过硫酸铵：称取1.0克过硫酸铵，加入10毫升蒸馏水溶解。
3)1.5mol/LPh8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用浓盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
4)1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用浓盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml。
5)30％丙烯酰胺(Acr)：称Acr30g，甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，加蒸馏水至100ml，过滤后置棕色瓶中，4℃贮存可用1-2月。
6)5％苯酚溶液：称取(分析纯)重蒸苯酚5.000克，溶解于蒸馏水中，并定容到100ml.
7)葡萄糖标准溶液：称取分析纯葡萄糖粉3.0克左右，105度干燥30分钟，至恒重；在干燥的条件下称取0.100克溶于蒸馏水中，并定容到100ml.
8)考马斯亮蓝G-250显色液：精确称取考马斯亮蓝G-250 75mg，溶于12.5ml 95％乙醇中，同时加入120ml 85％磷酸，最后定容到250ml.
9)蛋白标准溶液：精确称取牛血清白蛋白0.100克溶于蒸馏水中并定容到100ml.
2灵芝糖肽检测方法………………………………………
2.1测定方法的选择
2.1.1多糖测定方法：
1)苯酚硫酸法：多糖在硫酸和苯酚的作用下显色；显色时间短，且颜色稳定。
2.1.2蛋白测定方法
考马斯亮蓝：受特异性氨基酸影响，简便迅速，灵敏度高，最低可达1ug/ml，受其他物质干扰小。
为了保证测定的准确性，选择考马斯亮蓝法作为蛋白质含量的测定方法。
2.2测定原理：根据蛋白质分子本身带有氨基和羧基，在一定的ph值溶液中，分子表现一定强度的极性，有电场存在的情况下，会发生位置迁移，从而达到分离的目的
2.3准确度：测定方法是在page电泳分离的基础上，分别测定多糖(苯酚硫酸法)与蛋白(考马斯亮蓝法)的含量，然后计算结合物的含量。测定精度与多糖和蛋白的测定精度直接相关。苯酚硫酸法测定多糖与考马斯亮蓝法测定蛋白的准确度为10ug/ml。
2.4适用范围：适用于测定分子量在10万以下，经过分离纯化的真菌糖肽含量的测定。
2.5样品处理：
1)多糖溶液加入无水乙醇汁混合液中乙醇浓度达到75％，4℃2小时醇沉，然后离心得多糖。
2)丙酮洗涤：称取适量多糖固体，加入5倍量的丙酮搅拌2-3分钟，离心分离；重复洗涤两次，然后将多糖固体低温吹干备用。
3)溶解：将多糖固体溶于适量热水中，搅拌至固体不再溶解为止，滤纸过滤，滤液备用。
4)透析：用截流分子量小于500的透析袋进行逆向流水透析脱盐。
5)纯化：向多糖溶液中加入2倍体积的脱蛋白试剂，剧烈振摇后，离心分层，用分液漏斗分离；重复两次，分离后的多糖溶液加热蒸发掉残余的有机溶剂，浓缩定容，使溶液中多糖浓度大于50mg/ml。
2.6糖肽的分离
2.6.1分离方法：糖肽类物质含有蛋白质，选择非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳作为分离手段。
2.6.2胶板制作：
1)将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，准备2个干净的锥形瓶。
2)把玻璃板在灌胶支架上固定好。
3)按比例配好10％分离胶，用移液管快速加入，大约5厘米左右，之后加少许蒸馏水，静置聚合.
4)倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，同时按比例配好浓缩胶溶液，连续平稳的加入浓缩胶至离边缘5mm处，插入样梳，静置聚合.
5)在电泳槽中加入缓冲液后，拔出样梳。
2.6.3点样：
1)用微量进样器在凝胶板左侧点样孔距点样槽底三分之一处点样，中间点样孔点适量溴酚兰溶液作为电泳进度的指示，右侧点样孔作为空白对照。
2)接通电源及冷却水，进行电泳，开始电压恒定在100V；当样品进入分离胶后电压升至200V，溴酚蓝迁移至距凝胶底边缘约5mm时，停止电泳。
2.7溶解与测定
2.7.1凝胶切分：电泳结束后，取下并撬开玻璃板，将多糖溶液所在的点样孔的分离胶条带全部切下，同时在右侧切下等面积的分离胶作为空白对照(中间的溴酚兰条带保留)，用少量蒸馏水轻轻冲洗凝胶表面，然后分别放入三角瓶中。
2.7.2将凝胶分别研磨成泥状，然后洗入三角瓶中，加入100ml水煮沸10分钟，冷却后过滤；滤渣加水重复煮沸两次，合并滤液，真空浓缩并定容至10ml。
2.7.3测定
将分离胶中定容后的多糖及空白溶液分别测定多糖及蛋白质含量。
2.8结果计算：分别计算出电泳后凝胶中多糖及蛋白的含量(扣除空白因素影响)，求和即为糖肽含量，将分离胶中定容后的多糖及空白溶液分别测定多糖及蛋白质含量。
例5.灵芝糖肽功能性试验
在北京市结核病胸部肿瘤研究所，选择60名肿瘤患者，采用灵芝糖肽辅助平消胶囊治疗肿瘤患者，60天一个疗程，每日服用4g，服用2个疗程，试验结果如下表，通过灵芝糖肽的服用复合治疗的效果比对照提高了80％。试验表明灵芝糖肽在配合治疗肿瘤方面具有良好的效果。
表1灵芝糖肽辅助治疗效果表(对照组：单独服用平消胶囊)
| 项目 | 服用人数 | 抑制率 |
| 复合治疗 | 30 | 90％ |
| 对照 | 30 | 50 |
Claims (3)
1.一种灵芝糖肽产品，其特征在于所述灵芝糖肽产品分子量在2000DA以上，其中灵芝糖肽含量占20-40％。
2.一种如权力要求1所述的灵芝糖肽产品制备方法包括如下步骤：
(1)发酵液的获得：采用斜面菌种逐级扩培获得灵芝真菌液体深层发酵液；
(2)外加酶酶解：将步骤(2)中得到的发酵液分别调整温度和pH，使温度为45～65℃，pH为5～7，发酵液中加入混合酶，混合酶与发酵液的重量百分比为0.03～0.05％，混合酶按重量百分比组成为：纤维素酶30～60％、其余为β-葡聚糖酶，酶解时间0.3～3小时，酶解过程中不断搅拌；
(3)灭酶：酶控制反应结束后，将发酵液升温到90～95℃，保持10～30分钟，进行灭酶；
(4)均质处理：采用均质机和胶体磨依次处理发酵液，对菌丝体细胞壁进行破壁处理；
(5)浓缩：将发酵液浓缩至原体积的1/5～1/10，浓缩所用方法可以是单效、多效真空浓缩和冷冻浓缩；
(6)醇沉：向浓缩滤液中加入70～100％的乙醇进行醇沉，其体积比为1∶3～4，处理时间14小时；
(7)沉淀物溶解：沉淀物加热水溶解；
(8)膜过滤：采用5000DA和70000DA的膜进行过滤，收集5000DA和70000DA之间的组分；
(9)喷雾干燥：将上述收集的滤液通过喷雾干燥得到干粉。
3.一种如权力要求1和2所述的灵芝糖肽产品在防治肿瘤方面的应用。
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