CN112675081A - 一种二裂酵母发酵组合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种二裂酵母发酵组合物及其制备方法，所述发酵组合物由二裂酵母溶胞物母液和滤液按照一定比例混合而成。所述制备方法包括S1：厌氧培养活化，制成一级发酵种子液；S2：将一级发酵种子液接种至微氧发酵固体培养基中，得到二级发酵种子液；S3：二级种子液转接至发酵培养基内进行微氧发酵；S4：通过离心发酵液分离二裂酵母滤液及双歧杆菌菌体；S5：将双歧杆菌菌体重悬、破碎后，得到二裂酵母溶胞物母液；S6：将二裂酵母滤液及溶胞物母液按比例混合，得到二裂酵母发酵产物。通过使用长双歧杆菌多级无氧/微氧发酵，限制了微生物污染影响的问题，并进一步提高了安全性；通过在逐级发酵过程中控制含氧量等指标使最终产物的各项理化指标更加稳定；通过复合蛋白酶消化工艺，有效的提高了同规模双歧杆菌发酵下的多肽含量。

Description

一种二裂酵母发酵组合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种二裂酵母发酵组合物的制备方法。

背景技术

二裂酵母发酵产物（Bifida Ferment Lysate），是经双歧杆菌发酵后处理得到的生理溶胞产物，主要成分为细胞代谢产物、胞质片段、多糖、蛋白质与多肽等。大量的体外实验证实了二裂酵母发酵产物中的多种氨基酸、蛋白质和各类分子介质具有调节平衡肌肤、调节免疫机能的功效，也同样是人类皮肤细胞的重要组成成分及营养分子；多糖、维生素等分子及双歧杆菌胞质代谢物具有一定的保释、抗氧化、抗衰老作用，并能够防止紫外线等外源刺激的损害，促进损伤DNA的修复，这些优势使得二裂酵母发酵产物广泛应用于护肤产品中以改善肤质，具有极大的市场前景。但目前用于食品及化妆品原料的二裂酵母发酵产物制备工艺往往存在微生物污染、理化性质不稳定、蛋白和易于皮肤吸收的小分子多肽含量较少等问题，常需要额外补充非双歧杆菌发酵的组分，影响发酵产出的同时提高了生产成本。

本发明公开的一种基于长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）多级厌氧/微氧发酵制备二裂酵母发酵产物的工艺，通过多级扩增目的菌种、调控发酵环境因子、应用多种蛋白酶消化产物中的大分子蛋白组分，有效改进了二裂酵母发酵产物生产工艺的不足，提升产品的品质。

发明内容

为了克服常规二裂酵母发酵产物制备工艺中杂菌造成的微生物污染、双歧杆菌微氧发酵水平限制引起的产品理化性质不稳定、蛋白和易于皮肤吸收的小分子多肽含量较少等问题。本发明的第一发明目的是提供一种二裂酵母发酵组合物，该组合物是由二裂酵母溶胞物和滤液按照一定比例混合而成，溶胞物和滤液全部为发酵过程中的产物。

本发明的第二目的是提供一种长双歧杆菌的发酵生产工艺，包括如下步骤：

S1，制备一级种子液：将长双歧杆菌接种于无菌培养试管中，厌氧培养活化，制成一级发酵种子液；

S2，制备二级种子液：将一级发酵种子液接种至微氧发酵固体培养基中，扩增培养后提取菌群并重悬为二级发酵种子液；

S3，发酵：二级种子液转接至发酵培养基内进行微氧发酵，调整温度为及含氧量；

S4，菌液分离：通过离心发酵液分离二裂酵母滤液及双歧杆菌菌体；

S5，制备二裂酵母母液：将长双歧杆菌菌体重悬、破碎后，按比例使用蛋白酶温水浴消化后离心抽滤，得到二裂酵母溶胞物母液；

S6，制备二裂酵母发酵液：将二裂酵母滤液及溶胞物母液按照一定比例混合，同时加入防腐剂及保护剂，最终得到二裂酵母发酵产物溶胞物和滤液组合物。

进一步的，所述发酵用固体/液体培养基为MRS培养基。

通过所述技术方案的步骤S1和S2，长双歧杆菌发酵的一级种子液及二级种子液制备需控制含氧量在0~5%，二级种子液需使用200mL~500mL的固体MRS培养基进行筛选培养，二级种子液转接后微氧发酵应控制含氧量在5%~15%。

进一步的，长双歧杆菌一级种子液厌氧发酵制备的条件为：pH范围6.0~6.5，培养温度25~40℃，摇床速度180rpm，活化时间10~30小时。

进一步的，长双歧杆菌二级种子液微氧发酵制备的条件为：固体培养基内接种量为体积百分比的1%~2%，pH范围6.0~6.5，培养温度25~40℃，扩增时间5~7天。

进一步的，长双歧杆菌二级种子液微氧发酵扩增的条件为接种量体积百分比2~5%，初始600nm吸光度0.1~0.2，温度25~40℃，pH范围6.0～6.5，培养时间48～72小时。

通过上述技术方案中的步骤S3和S4，长双歧杆菌经多级扩增及发酵后所得发酵液其菌体成分经多级筛选后可保证极高的长双歧杆菌含量，可用于二裂酵母发酵产物的纯化与制备。

进一步的，发酵液离心回收滤液转速为8000~12000rpm，所得菌体经洗涤后，重悬比例为1：100~1:50，,机械破碎法破碎菌液时间为30~60分钟，离心所得滤液使用0.22μm滤膜抽滤除杂，并控制环境温度在4~25℃之间。

通过上述技术方案的步骤S5，离心分离所得上清经抽滤除杂后为发酵产物滤液，沉淀即长双歧杆菌菌体经洗涤重悬后，使用机械破碎法破碎菌体后即得发酵产物溶胞物母液，滤液和溶胞物的分别处理减少了后续酶解过程中可溶组分的损失，提高了产品有效成分的稳定性。

进一步的，溶胞物母液酶消化温度为37~55℃，消化时间16~24小时，加热可选用水浴或金属浴等方法。

进一步的，制备中使用的蛋白酶为：3wU木瓜蛋白酶0.01~0.04%、3wU菠萝蛋白酶0.01~0.04%、3wUβ-葡聚糖酶0.01~0.04%、3wU甘露聚糖酶0.01~0.04%、3wU胰蛋白酶0.005~0.02%（占母液质量百分比），可根据需要在所述基础上增加1~2种蛋白酶种类， 但总用量不宜超过溶胞物母液质量的0.2~0.3%，不同种类的蛋白酶组合影响最终产物的小分子多肽构成，一定程度上影响产品的最终功效。

复合蛋白酶水解后溶胞物母液中大部分大分子蛋白被水解为短肽，增加了可溶性益生菌活性物质的含量。

进一步的，发酵产物溶胞物母液经酶消化后离心回收滤液转速为8000~12000rpm，离心所得上清使用0.22μm滤膜抽滤除杂。

通过上述技术方案的步骤S6，溶胞物母液经分离纯化并除杂后即为二裂酵母发酵产物溶胞物，减少了成分中的杂质含量，提高了产品的稳定性。

进一步的，溶胞物母液与滤液按体积配比为1:10~1:1进行合并，并根据需要添加防腐剂及保护剂等。

进一步的，防腐剂选用苯甲酸钠，用量为最终发酵产物质量的0.2%~1%，保护剂为海藻糖，添加量为最终发酵产物质量的0.5%~5%。

通过上述技术方案，所得二裂酵母发酵产物基本由长双歧杆菌微氧发酵所得，为天然生物活性原料，具有与天然益生菌相当的成分构成。

与传统的发酵工艺相比，本发明优势在于：

（1）溶胞物和滤液的组合物能够最大限度降低可溶性小分子在产品生产过程中的损失，作为化妆品原料这种配比方式保证多糖、多肽的浓度适于用于皮肤保湿，甚至可以直接涂抹于皮肤表面使用；

（2）通过使用长双歧杆菌多级无氧/微氧发酵，限制了环境杂菌的共生，解决了二裂酵母发酵生产工艺中微生物污染影响菌体成分的问题，逐级扩增筛选提高了二裂酵母发酵产物的安全性；

（3）通过在逐级发酵过程中控制含氧量等指标使长双歧杆菌生长，从而稳定发酵进程，使最终产物的各项理化指标更加稳定；

（4）通过复合蛋白酶消化工艺，对二裂酵母发酵产物中不易吸收的大分子蛋白进行了水解，生成大量易于吸收的可溶性小分子多肽，解决了现有二裂酵母发酵产品中蛋白质成分不易于皮肤吸收等问题，提高了产品的品质。

附图说明

图1是长双歧杆菌多级厌氧/微氧发酵制备二裂酵母发酵产物溶胞物和滤液组合物的工艺流程图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例，也不用来限定本发明。

实施例1：

一种基于长双歧杆菌厌氧发酵的二裂酵母发酵组合物及其制备方法，包括如下步骤：

(1)将长双歧杆菌接种于含2mL MRS培养基的无菌培养试管中，在37℃条件下厌氧活化24h，培养基初始pH为6.0，添加50%甘油至终浓度为20%，冷冻保藏备用；

(2)在无菌烧杯中加入60mL左右培养基，使培养基厚度至少有2cm以上，加入300μL菌液，混匀，倒入烧杯中。待培养基凝固后，转移至37℃培养箱，培养6天，所得菌群用适量液体培养基重悬，作为二级发酵种子液；

(3)将二级种子接种到1L厌氧液体发酵培养基中，密封后静置进行厌氧发酵，接种量：体积百分比为4%，初始600nm吸光度0.18温度37℃，pH控制在6.37，含氧量不超过15%，密封发酵容器厌氧培养72小时，发酵结束后收集发酵液；

(4)将发酵液在5000rpm离心收集菌体及上清液，在常温条件下使用真空泵，通过0.22um微孔滤膜抽滤上清液，得到二裂酵母发酵产物滤液约0.6L，并使用无菌水约200mL对菌体进行洗涤重悬，压力均质机800~1000ba对重悬液进行菌体破碎处理；

(5)使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶各0.02%、胰蛋白酶0.01%对重悬液进行55℃温水浴消化处理22小时，所得裂解液在10000rpm离心收集上清液，经0.22um微孔滤膜抽滤除杂后得到二裂酵母发酵产物溶胞物母液；

（6）溶胞物母液与滤液按体积配比为1:2进行合并，加入0.2%苯甲酸钠、2%海藻糖，混匀后即为所得产品。

实施例2：

一种基于长双歧杆菌厌氧发酵的二裂酵母发酵组合物及其制备方法，包括如下步骤：

(1)将长双歧杆菌接种于含10mL MRS培养基的无菌培养试管中，在37℃，条件下厌氧活化48h，培养基初始pH为6.0，添加50%甘油至终浓度为20%，冷冻保藏备用；

(2)在无菌烧杯中加入75mL培养基，加入2.5mL菌液，混匀，倒入烧杯中。待含有菌的琼脂层凝固后，再继续倒入220mL左右培养基，使其厚度至少达到5cm。待培养基凝固后，转移至37℃培养箱，培养7天，所得菌群用适量液体培养基重悬，作为二级发酵种子液；

(3)将二级种子接种到5L厌氧液体发酵培养基中，密封后静置进行厌氧发酵，接种量：体积百分比为5%，初始600nm吸光度0.18温度37℃，pH控制在6.5，含氧量12%，密封发酵容器厌氧培养48小时。发酵结束后收集发酵液；

(4)将发酵液在8000rpm离心收集菌体及上清液，在常温条件下使用真空泵，通过0.22um微孔滤膜抽滤上清液，得到二裂酵母发酵产物滤液约4L，并使用2%海藻糖溶液约1L对菌体进行重悬，压力均质机1000ba对重悬液进行菌体破碎处理；

(5)使用木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶各0.02%，胰蛋白酶0.01%对重悬液进行55℃温水浴消化处理24小时，所得裂解液在14000rpm离心收集上清液，经0.22um微孔滤膜抽滤除杂后得到二裂酵母发酵产物溶胞物母液；

（6）溶胞物母液与滤液按体积配比为1:1进行合并，加入0.5%苯甲酸钠，混匀后即为所得产品。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

效果实施例：

（一）杂菌生长测试

实验方法：将普通长双歧杆菌发酵方式及多级厌氧/微氧发酵方式所得发酵液取样进行10倍、100倍、1000倍稀释后取300μL涂布氨苄西林抗性平板，因双歧杆菌受氨苄西林影响生长受到抑制，经37℃无菌培养箱培养3天后，观察平板杂菌生成情况。

材料：LB固体培养平板（含有氨苄西林溶液50 ug/mL）；

菌落测试结果如表1所示，测试结果证明普通二裂酵母发酵工艺除了双歧杆菌扩增外，生成了其他共生杂菌；而采用多级发酵则避免了微生物污染，无杂菌生成。

表1

（二）理化性质检测

实验方法：分别对5批次长双歧杆菌普通发酵及5批次长双歧杆菌多级厌氧/微氧发酵方式的最终发酵产物进行pH、电导率、还原糖含量、固含量等方面进行对比。pH及电导率测定采用pH电导测定计检测；还原糖含量使用DNS比色法测定（DNS 即二硝基水杨酸法是利用碱性条件下，二硝基水杨酸与还原糖发生氧化还原反应,生3-氨基-5-硝基水杨酸,该产物在煮沸条件下显棕红色，540nm处有吸收，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理）；固含量使用1mL样品105℃烘干3小时后检测残余固体质量占比的方法来检测。pH初始为6.5，终点pH一定程度反映双歧杆菌发酵的程度，电导与还原糖表示了发酵体系中无机盐及糖代谢的程度，固含量一定程度反映最终发酵产物中多肽、生长因子等可溶性活性物质的含量。测试结果如表2所示，结果表明采用调控含氧量等环境因子的多级发酵工艺，产品的pH、电导率、还原糖均比普通发酵工艺更加稳定，反映出产品稳定性方面的优势。

表2

（三）多肽含量测试

实验方法：使用凯氏定氮法分析产品总氮含量，将试样放入凯氏烧瓶中，加入浓硫酸及催化剂(硒、汞或铜盐)加热分解消解试样，使试样中的氮转化为铵态氮)；消解好的试样转移入蒸馏器中，加浓苛性钠液，使挥发出的氨气(NH3)用过量的标准酸溶液吸收，剩余的酸用标准碱溶液返滴定；或用硼酸作吸收液，再用标准酸溶液直接滴定。

通过该方法对比使用复合蛋白酶消化产品和未经蛋白酶消化直接配制所得发酵产物的总氮含量，总计检测五个批次，结果如表3所示，实验结果表明普通发酵、多级发酵未作酶消化、多级发酵酶消化处理平均总氮含量分别为0.41%、0.87%、1.38%，采用复合酶消化处理后的多级发酵产物，其可溶组分氮元素含量显著提高，是普通发酵的2.36倍，反映出可溶多肽含量的明显提升。

表3

可以理解，本发明是通过一些实施例进行描述的，本领域技术人员知悉的，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对这些特征和实施例进行各种改变或等效替换。另外，在本发明的教导下，可以对这些特征和实施例进行修改以适应具体的情况及材料而不会脱离本发明的精神和范围。因此，本发明不受此处所公开的具体实施例的限制，所有落入本申请的权利要求范围内的实施例都属于本发明所保护的范围内。

Claims (9)

1.一种二裂酵母发酵组合物，其特征在于：所述组合物由二裂酵母溶胞物母液和滤液按照一定比例混合而成。

2.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵组合物，其特征在于：二裂酵母溶胞物母液与滤液按照体积配比为1:10~1:1进行混合。

3.一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：选用长双歧杆菌进行多级微氧发酵，包括如下步骤，S1：选用长双歧杆菌接种于无菌培养试管中，无氧培养活化，制成一级发酵种子液；S2：将一级发酵种子液接种至微氧发酵固体培养基中，扩增培养后提取菌群并重悬为二级发酵种子液；S3：二级种子液转接至发酵培养基内进行微氧发酵，调整温度及含氧量；S4：通过离心发酵液分离二裂酵母滤液及长双歧杆菌菌体；S5：将长双歧杆菌菌体重悬、破碎后，按比例使用蛋白酶温水浴消化后离心、抽滤除杂得到二裂酵母溶胞物母液；S6：将二裂酵母滤液抽滤后与溶胞物母液合并，加入防腐剂及保护剂，得到最终的二裂酵母发酵产物。

4.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：所述培养基为MRS固/液体培养基。

5.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶包括木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶中的一种或几种。

6.根据权利要求5所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：所述蛋白酶添加比例为：3wU木瓜蛋白酶0.01~0.04%、3wU菠萝蛋白酶0.01~0.04%、3wUβ-葡聚糖酶0.01~0.04%、3wU甘露聚糖酶0.01~0.04%、3wU胰蛋白酶0.005~0.02%，酶消化温度为37~55℃，消化时间为16~24小时。

7.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：

所述长双歧杆菌一级种子液厌氧发酵制备的条件：pH范围6.0~6.5，培养温度25~40℃，摇床速度180rpm，活化时间10~30小时，含氧量0~5%；

所述长双歧杆菌二级种子液微氧发酵制备的条件为：固体培养基内接种量为体积百分比的1%~2%，pH范围6.0~6.5，培养温度25~40℃，扩增时间5~7天，含氧量0~5%，重悬比例1:100~1:50；

所述长双歧杆菌二级种子液微氧发酵扩增的条件为接种量体积百分比2~5%，初始600nm吸光度0.1~0.2，温度25~40℃，pH范围6.0～6.5，培养时间48～72小时，含氧量5%~15%。

8.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：离心分离转速为8000~12000rpm，压力破碎时间为30~60分钟，滤液及溶胞物使用0.22μm滤膜抽滤除杂，并控制环境温度在4~25℃之间。

9.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵组合物的制备方法，其特征在于：所述二裂酵母发酵产物最终产品需添加防腐剂及保护剂，防腐剂为苯甲酸钠，添加量为最终发酵产物质量的0.2%~1%；保护剂为海藻糖，添加量为最终发酵产物质量的0.5%~5%。

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