CN113481244A - 一种复合菌种二裂酵母发酵产物及其在制备化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本方案公开了复合菌种二裂酵母发酵产物，该产物由下述方法制备得到：筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种；配置第一培养基，将筛选的个歧杆菌菌种中的一个菌种分别在第一培养基中进行接种，发酵，获得多个双歧杆菌菌种的种子液；配置第二培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种的种子液在第二培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵液向一次发酵液中加入营养物质及另一菌种的种子液后进行二次发酵，再经过裂解处理获得产物。该产物中维生素、氨基酸、小分子肽等活性成分含量是现有同类产品的2倍，发酵液中益生菌细胞数达到了每毫升10亿个细胞的水平，比传统发酵技术获得的发酵产物中的益生菌细胞含量提高了40％。

Description

一种复合菌种二裂酵母发酵产物及其在制备化妆品中的应用

技术领域

本发明涉及益生菌发酵技术领域，特别涉及一种复合菌种二裂酵母发酵产物及其在制备化妆品中的应用。

背景技术

正如人们的肠道一样，人们的皮肤上也生活着数以亿计的微生物。这些种类繁多的微生物之间，以及与人们的皮肤之间，彼此相互作用，相互影响，共同构成了皮肤的微生态系统。包括P&G，J&J，L’Oreal和Estee Lauder等在内的国际巨头，很早就开始布局微生态护肤，如：SKII的神仙水和兰蔻的小黑瓶、雅施兰黛小棕瓶等产品，就是基于“益生菌”和“皮肤微生态”理念的产品。目前，皮肤微生态理念的产品开发思路主要通过添加益生菌发酵产物，为皮肤建立益生态环境提供营养物质条件，从而在一定程度上实现皮肤益生态维护的作用。因此，近年来二裂酵母发酵产物、乳酸杆菌发酵产物、酵母发酵产物等，逐渐成为热点化妆品原料。

已公开的二裂酵母发酵产物工艺存在不足主要表现在：一次发酵，产物酸性强；单菌种发酵，抗氧化效果不突出；培养基成份复杂，产物气味腥臭，安全风险高；商品化的二裂酵母发酵产物防腐剂多用苯甲酸钠、苯氧乙醇等，对皮肤微生态菌群有很大影响，不利于二裂酵母发酵产物维护皮肤微生态作用的发挥。

发明内容

本方案的一个目的在于提供一种复合菌种二裂酵母发酵产物，该产物中维生素、氨基酸、小分子肽等活性成分含量是现有同类产品的2倍，发酵液中益生菌细胞数达到了每毫升10亿个细胞的水平，比传统发酵技术获得的发酵产物中的益生菌细胞含量提高了40％。

本方案的另一个目的在于提供复合菌种二裂酵母发酵产物在制备化妆品中的应用。

为达到上述目的，本方案如下：

一种复合菌种二裂酵母发酵产物，所述复合菌种二裂酵母发酵产物由下述方法制备得到：

筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种；

配置第一培养基，将筛选的所述多个歧杆菌菌种中的一个菌种分别在第一培养基中进行接种，发酵，获得多个双歧杆菌菌种的种子液；

配置第二培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种的种子液在第二培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵液；

向一次发酵液中加入营养物质及另一菌种的种子液后进行二次发酵，获得二次发酵液；

将二次发酵液离心，过滤，高压均质裂解获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物。

优选的，所述将二次发酵液离心，过滤，高压均质裂解获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物包括：

将二次发酵液离心，获得第一上清液和第一滤出物；

对第一滤出物离心处理，得第二上清液和第二滤出物；

对第二滤出物离心处理，得第三上清液和第三滤出物；

对第三滤出物进行高压均质处理，至第三滤出物中的细胞裂解度达到95％以上后与第一上清液，第二上清液和第三上清液混合获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物。

优选的，所述双歧杆菌菌种包括青春双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种或两种。

优选的，所述第一培养基包括番茄粉，尿素，酵母粉和水。

优选的，所述第二培养基包括琼脂，葡萄糖，酵母粉，吐温和水。

优选的，所述营养物质包括葡萄糖，复合维生素，海藻糖和酵母粉。

优选的，所述一次发酵液中总糖含量为0.5％以下，pH值在4.5以下。

优选的，所述二次发酵液中pH值在5以上。

优选的，所述对第一滤出物离心处理，得第二上清液和第二滤出物包括：

按第一滤出物与蒸馏水的质量比为1:10的比例向第一滤出物中加入蒸馏水，搅拌至滤出物中的细胞内间质溶出，再进行离心处理。

第二方面，提供一种将任一所述复合菌种二裂酵母发酵产物在制备化妆品中的应用。

本方案的有益效果如下：

本方案通过筛选不同种类的双歧杆菌菌种，选出抗氧化性能好，安全性高的菌种，保障了发酵产物的功效性和安全性；通过采用营养流加与双菌分级发酵两个阶段，提升了抗氧化性能；培养基较现在公布的技术进行了优化，杂质少，安全性更高。

附图说明

为了更清楚地说明本方案的实施，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本方案的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例中制备富含菌种二裂酵母发酵产物的流程图；

图2为实施例制得的二裂酵母发酵产物溶胞物；

图3为对比样品1的显微镜照片；

图4为实施例产物的显微镜照片；

图5为对比样品2的显微镜照片。

具体实施方式

下面将结合附图对本方案的实施方式作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本方案的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本方案中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等(如果存在)是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的实施例能够以除了在这里图示或描述的内容以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备，不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

二裂酵母发酵产物(Bifida Ferment Lysate)滤液和溶胞物就是将双歧杆菌在一定条件下进行发酵，通过分离、细胞裂解而得到的不同化妆品原料。虽然二裂酵母发酵产物(滤液、溶胞物)在化妆品中应用已经非常普遍和成熟，但，二裂酵母发酵产物的制备工艺还有较大的改进、提升空间。

在本方案中二裂酵母发酵产物中的溶胞物中固形物的主要来源为发酵产物细胞壁、细胞质等，因此，可通过固含量来衡量细胞含量。

本申请的发明人通过独特的二次厌氧发酵和葡萄糖流加技术，使得发酵液中益生菌细胞数达到了每毫升10亿个细胞的极高水平，比传统发酵技术提高了40％；以及采用多菌共生发酵技术，同时使用两种益生菌进行发酵，发酵液中的维生素、氨基酸、小分子肽等活性成分含量是现有同类产品的2倍。

一种复合菌种二裂酵母发酵产物，由下述步骤制得：

1.菌种筛选：

将基于16S rDNA测序技术得到的不同种的双歧杆菌(包括青春双歧杆菌、角双歧杆菌、动物双歧杆菌、星状双歧杆菌、两歧双歧杆菌、牛双歧杆菌、短双歧杆菌、齿双歧杆菌、长双歧杆菌婴儿亚种、动物双歧乳脂亚种、长双歧杆菌、假小链双歧杆菌以及嗜热双歧杆菌和嗜酸热双歧杆菌)，经过发酵后安全性筛选，选出安全性高的菌种：青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、短双歧杆菌、及长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌；再经过抗氧化筛选，筛选出两种抗氧化活性强的双歧杆菌：青春双歧杆菌、短双歧杆菌。

2.发酵步骤：

2.1制备种子活化培养基

按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将5％番茄粉、0.5％尿素，1.5％葡萄糖、1.5％酵母粉溶于91.5％的水中，灭菌，冷却至室温，备用；

2.2获得短双歧杆菌种子液或青春双歧杆菌种子液

将短型双歧杆菌按2.1中制得的种子活化培养基质量的3％～10％接种，于36～38℃发酵2天(约48小时)，通过镜检，确保短双歧杆菌活化，形成短双歧杆菌种子液；

将青春双歧杆菌按种子培养基质量的3％～10％接种，于36～38℃发酵2天(约48小时)，通过镜检，确保青春双歧杆菌活化，形成青春双歧杆菌种子液；

2.3配置发酵培养基

按各物质占培养基的总质量的质量百分比，将0.1～1.0％琼脂、1～3％葡萄糖、1～3％酵母粉、1～0.3％吐温-800、89.7～97.8％的水混合，配制发酵培养基，并经过高温灭菌，冷却室温，备用；

2.4获得一次发酵液

将短双歧杆菌种子液接种在已灭菌处理的发酵培养基中，厌氧发酵培养；接种时，短双歧杆菌种子液的质量与发酵培养基的质量比为3～10:100；

厌氧发酵的条件为在36～38℃，发酵20～24h，至发酵终点，总糖含量降至0.5％以下，pH在4.5以下；

2.5获得二次发酵液

在一次发酵液中，按质量比100：(0.1～1)加入青春双歧杆菌种子液；按各物质占一次发酵液的总质量的质量百分比向一次发酵液中加入0.5-2％葡萄糖、0.1～0.2％复合维生素、0.05～0.1％海藻糖，0.1～0.5％酵母粉，进行二次发酵，二次发酵的条件为在36～38℃，发酵6～8h，测试pH值在5以上，可停止发酵。

2.6离心分离

将二次发酵液进行离心分离，转速为2000～3000rmp/min，离心时间15～20min，过滤后，得第一上清液和第一滤出物，将第一上清液与第一滤出物分离，第一滤出物中主要物质为离心分离出的细胞；

2.7细胞裂解

将过滤后的第一滤出物，按质量比为1：10的比例，加入蒸馏水，搅拌10～20min，将第一滤出物中含有的细胞内间质溶出，离心分离，转速为2000～3000rmp/min，离心时间15～20min，过滤后得第二上清液和第二滤出物，将第二上清液与第二滤出物分离，第二滤出物中主要包含离心分离出的细胞；重复此步骤两次；得到第三上清液和第三滤出物，第三滤出物中主要包含离心分离出的细胞；将第三滤出物进行高压均质处理，2～3次，通过镜检，细胞裂解度达到95％以上，将三次分离的溶胞液上清液合并，将裂解细胞加入溶胞液，制备得到双歧杆菌发酵产物溶胞物。

2.8防腐

向2.7步骤双歧杆菌发酵产物中按发酵产物总质量的0.1～2.0％的加入已二醇、戊二醇、甲基丙二醇中的一种或几种，同时加入0.2～0.5％的辛酰羟肟酸。获得复合菌种二裂酵母发酵产物。

将制备得到的二裂酵母发酵产物用于化妆品中。

实施例效果：

1.维生素、氨基酸、小分子肽等活性成分含量是现有同类产品的2倍：

选择市场中已知的两种竞品，分别作为对比样品1和对比样品2，对对比样品1、对比样品2及实施例发酵产物(复合菌种二裂酵母发酵产物)通过凯氏定氮法进行氮含量和总蛋白含量测试，结果如表1所示，

表1

2.实施例获得产物发酵液中益生菌细胞数达到了每毫升10亿个细胞的水平，比传统发酵技术获得的发酵产物中的益生菌细胞含量提高了40％，可通过固含量和镜显细胞数量来综合评判。如图3至5所示的显微镜细胞数量观察，图3为对比样品1的显微镜照片，图4为实施例产物的显微镜照片，图5为对比样品2的显微镜照片。从图3至5可以看出，荧光染色后进行显微镜观察，可以看到，对比样品1视野中未观察到细胞形态，对比样品2中有少量细胞裂解碎片，实施例产物在显微镜下可以观察到较多数量的细胞裂解碎片。

实施例中二裂酵母发酵产物中的溶胞物中固形物的主要来源为发酵产物细胞壁、细胞质等，因此，可通过固含量来衡量细胞含量。

对发酵产物中溶胞物固含量检测：精确称取试样2～3g，置于蒸发皿中；将蒸发皿放置于105℃烘箱中2小时，在干燥器中冷却，称重；重复加热并称至恒重，溶胞物中固含量的计算如式(1)所示，

W₁：试样干燥后的质量；

W：试样的质量；

测试对比样品1和对比样品2中的固含量与本实施例的符合菌种二裂酵母发酵产物中的溶胞物固含量进行比较，结果如表2。表2

综合表2固含量和图3至5的显微镜细胞数量，可推断本技术产物比传统发酵技术获得的发酵产物中的益生菌细胞含量提高了40％。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (10)

1.一种复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述复合菌种二裂酵母发酵产物由下述方法制备得到：

筛选具有抗氧化活性的多个双歧杆菌菌种；

配置第一培养基，将筛选的所述多个歧杆菌菌种中的一个菌种分别在第一培养基中进行接种，发酵，获得多个双歧杆菌菌种的种子液；

配置第二培养基，将获得的多个双歧杆菌菌种的种子液中的某一菌种的种子液在第二培养基中进行接种，经一次发酵，获得一次发酵液；

向一次发酵液中加入营养物质及另一菌种的种子液后进行二次发酵，获得二次发酵液；

将二次发酵液离心，过滤，高压均质裂解获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物。

2.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述将二次发酵液离心，过滤，高压均质裂解获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物包括：

将二次发酵液离心，获得第一上清液和第一滤出物；

对第一滤出物离心处理，得第二上清液和第二滤出物；

对第二滤出物离心处理，得第三上清液和第三滤出物；

对第三滤出物进行高压均质处理，至第三滤出物中的细胞裂解度达到95％以上后与第一上清液，第二上清液和第三上清液混合获得所述复合菌种二裂酵母发酵产物。

3.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述双歧杆菌菌种包括青春双歧杆菌和短双歧杆菌中的一种或两种。

4.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述第一培养基包括番茄粉，尿素，酵母粉和水。

5.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述第二培养基包括琼脂，葡萄糖，酵母粉，吐温和水。

6.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述营养物质包括葡萄糖，复合维生素，海藻糖和酵母粉。

7.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述一次发酵液中总糖含量为0.5％以下，pH值在4.5以下。

8.根据权利要求1所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述二次发酵液中pH值在5以上。

9.根据权利要求2所述的复合菌种二裂酵母发酵产物，其特征在于，所述对第一滤出物离心处理，得第二上清液和第二滤出物包括：

按第一滤出物与蒸馏水的质量比为1:10的比例向第一滤出物中加入蒸馏水，搅拌至滤出物中的细胞内间质溶出，再进行离心处理。

10.如权利要求1至9任一项所述的复合菌种二裂酵母发酵产物在制备化妆品中的应用。

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