KR102108743B1 - 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 쌀 유산균발효물의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물 및 상기 쌀 유산균발효물을 포함하는 식품조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 쌀 유산균발효물은 쌀의 결핍 아미노산인 라이신 함량이 증가되어, 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하지 않고 제조한 유산균발효물에 비하여 품질특성이 우수하므로, 곡류만을 포함하는 요구르트의 제조 및 이를 포함하는 식품의 개발에 적극 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 쌀 유산균발효물은 쌀의 결핍 아미노산인 라이신 함량이 증가되어, 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하지 않고 제조한 유산균발효물에 비하여 품질특성이 우수하므로, 곡류만을 포함하는 요구르트의 제조 및 이를 포함하는 식품의 개발에 적극 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는 쌀 유산균발효물의 제조방법, 상기 제조방법에 의해 제조된 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물 및 상기 쌀 유산균발효물을 포함하는 식품조성물에 관한 것이다.
일반적인 요구르트는 발효유의 일종이며, 우유류에 젖산균을 접종 및 발효시켜 제조된다. 요구르트에 포함된 젖산균이 장내에서 각종 비타민B를 만들고, 장내에서 독소를 생성하는 유해균을 억압하여 장 건강에 도움이 될 수 있다는 것이 알려짐에 따라, 발효유 소비량은 2010년 502천 톤에서 2013년 573천 톤으로, 3년 동안 약 26%가 증가하는 등 그 소비량이 급성장하고 있다.
이에 따라, 우유를 이용한 요구르트의 제조에 관한 연구는 무수히 진행되어 왔으며 그 제조기술 역시 잘 정립되어 있다. 현재까지 국내에는 많은 요구르트 관련 특허가 공개 또는 등록되었고, 대표적인 공개 특허는 아래와 같다. 대한민국 등록특허공보 제10-1754233호는 요구르트의 커드 형성을 단단히 하고 체지방 개선 효과가 있는 요구르트 제조용 조성물에 관한 것이고, 대한민국 공개특허공보 제10-2016-0082305호는 점도가 향상된 요구르트의 제조방법에 관한 것이다. 그러나, 곡류를 이용한 요구르트의 제조에 관한 연구는 매우 제한적으로 수행되어, 유산균 발효식품 시장에서는 우유를 주원료로 하는 요구르트가 대부분을 차지하는 실정이다.
이와 관련하여, 쌀을 사용하여 요구르트를 제조하는 경우 쌀과 우유가 완전히 호화되지 못하여 쌀과 우유가 이질감이 느껴지는 등의 문제점이 있었다. 아울러, 최근 채식에 대한 관심이 높아지면서 고기는 물론 우유, 달걀도 먹지 않는 엄격한 채식주의자의 수가 증가하고 있는바, 곡류로만 구성되어 있으며 그 맛뿐만 아니라 기능성까지 증대된 요구르트의 개발이 필요한 실정이었다.
또한, 필수 아미노산인 라이신(lysine)은 연골과 인대 등의 조직형성에 필요하며, 호르몬, 항체, 효소 등의 생성에 반드시 필요하지만, 쌀의 결핍 아미노산으로서, 그 함량이 매우 적거나 거의 없다.
이러한 배경하에, 본 발명자들은 유제품을 포함하지 않고 주재료로서 오로지 곡류만 포함하며, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물을 제조하고자 예의 노력 연구한 결과, 쌀배아를 사용하는 경우 유제품 없이도 쌀의 발효를 수행할 수 있을 뿐만 아니라, 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용한 발효를 통해 라이신 함량이 증가됨을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 쌀 유산균발효물 제조에 있어, 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼을 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 쌀 유산균 발효물 내 라이신 함량 증가 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 제조방법에 의해 제조되는 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 쌀 유산균발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 하나의 양태는 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 용어, "쌀"은 벼를 도정하여 정제한 백미를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 쌀은 도정을 통하여 배아와 쌀겨층을 완전히 제거한 것일 수 있다. 상기 쌀의 품종은 특별히 이에 제한되지 않으나, 삼광, 한가루, 하이아미, 청품, 일품, 도담, 고아미2호, 고아미4호, 홍진주, 적진주, 조은흑미, 수원542, 밀양317일 수 있으며, 구체적으로는 삼광, 일품, 고아미4호, 하이아미, 한가루, 수원542, 밀양371, 조은흑미일 수 있고, 보다 구체적으로는 조은흑미일 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 락토바실러스 플란타럼을 발효균주로 사용하여 제조된 쌀 유산균발효물의 라이신 함량을 측정한 결과, 다른 품종의 경우에는 라이신 함량이 1.5배 내지 3배 정도 증가하였으나, 조은흑미 품종의 경우에는 발효 전에 비하여 약 6배 이상 라이신 함량이 증가한 것을 확인하였으며, 이는 양성 대조군에 비하여 약 18배의 증가된 수치임을 확인함으로써, 조은흑미 품종을 사용할 경우에는 라이신 함량 증가가 보다 현저함을 알 수 있었다(도 1 및 도 2).
본 발명의 용어, "유산균발효물"은 유산균(젖산균)을 이용하여 발효된 물질을 총칭하여 이르는 것으로서, 본 발명에서 "요구르트"와 혼용되어 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 목적상, 상기 요구르트는 유제품을 포함하지 않는 것일 수 있다. 상기 유제품은 가축의 젖을 가공하여 만든 식품을 통틀어 이르는 것으로서, 우유, 버터, 치즈, 연유, 분유 등이 이에 속하며, 본 발명에서는 우유를 포함하는 유제품 없이 요구르트를 제조한 데에 특징이 있다.
본 발명에서는, 유제품을 사용하지 않고, 쌀을 사용하였으며, 발효 균주로서 락토바실러스 플란타럼을 이용하여 제조한 요구르트가, 다른 종의 유산균을 이용하여 제조한 요구르트에 비하여 라이신 함량이 현저하게 증가됨을 확인하였다. 즉, 본 발명은 락토바실러스 플란타럼에 의해 발효를 수행하는 경우, 다른 종의 유산균에 의한 발효와 달리, 쌀 유산균발효물의 라이신 함량이 결핍되었던 종래의 문제점을 해결한 것이다.
본 발명의 목적상, 상기 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법은 발효 균주로서 락토바실러스 플란타럼을 사용하는 것을 특징으로 한다. 즉, 종래에 라이신은 쌀의 결핍 아미노산이었으나, 본 발명에서 락토바실러스 플란타럼을 발효균주로 사용함으로써, 라이신 함량을 현저히 증가시킴을 특징으로 한다.
또한, 상기 락토바실러스 플란타럼은 0.05 내지 0.15%(v/v), 구체적으로 0.07 내지 0.13%(v/v), 가장 구체적으로 0.1%(v/v)로 혼합물에 접종될 수 있으나, 발효를 수행할 수 있는 한 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 락토바실러스 플란타럼은 본 발명자의 선행특허인 한국 등록특허공보 제10-1634270호에 기재된 락토바실러스 플란타럼 JSA22, 즉 기탁번호 KACC91973P를 갖는 락토바실러스 플란타럼일 수 있다. 상기 균주는 전통 장류에서 분리 및 선발된 유산균으로서, 항균활성, 인공소화액 생존율 및 부착성이 우수한 것이 특징이다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 다양한 쌀 품종에 대하여 락토바실러스 플란타럼을 발효균주로 사용하여 제조된 쌀 유산균발효물의 아미노산 함량을 측정한 결과, 사용된 모든 쌀 품종에서 발효 전과 발효 후의 총 아미노산의 함량에는 변화가 미미하였으나, 라이신 함량에 있어서는 발효 전 대비 발효 후의 라이신 함량이 최소 1.5배 이상으로 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 아울러, 이는 양성 대조군에 비해서는 최소 4배 이상 높은 수치로서, 락토바실러스 플란타럼을 발효균주로 사용하여 제조된 요구르트에서 라이신의 함량이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 우유 기반의 발효유에 비하여, 쌀을 포함하는 요구르트는 락토바실러스 플란타럼을 이용하여 제조함으로써 라이신 함량을 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다(표 1).
특히, 락토바실러스 플란타럼 JSA22 균주를 발효균주로 사용하여 제조한 요구르트가 다른 종의 유산균인 락토바실러스 람노서스 GG 균주에 비하여, 라이신 함량을 현저히 증가시킴을 확인하였다(도 3).
즉, 이는 락토바실러스 플란타럼을 발효 균주로 사용하여 유산균발효물을 제조하는 본 발명의 제조방법을 통해 라이신 함량의 현저히 증가된 유산균발효물을 제조할 수 있음을 시사하는 것이다.
또한, 본 발명에서 제조된 쌀 유산균발효물의 제조시에 유제품을 사용하지 않는 것을 특징으로 한다. 즉, 종래에는 유산균에 의한 발효를 수행하기 위하여 유제품을 사용하였으나, 본 발명에서는 유제품을 사용하지 않고, 유제품 대신에 쌀배아를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 “쌀 추출물”은 쌀로부터 추출한 산물을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 쌀 추출물이란 쌀 자체를 의미하거나, 쌀을 추출 처리하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.
상기 쌀을 추출하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 일례로, 본 발명에서 쌀 추출물은 (a) 쌀 및 물을 혼합하여 쌀페이스트를 제조하고, 쌀배아 및 물을 혼합하여 쌀배아유를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 쌀페이스트 및 쌀배아유를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계에 의해 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 용어, "쌀배아"는 쌀의 배아를 의미한다. 본 발명의 목적상, 상기 쌀배아는 도정을 통하여 쌀로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 단계 (a)는, 쌀 및 물을 혼합하여 쌀페이스트를 얻는 단계를 포함하며, 상기 쌀 및 물의 혼합비는 요구르트의 품질특성 및 관능특성을 최대화시키고, 유산균에 의한 발효를 저해하지 않는 정도가 적당하다. 이때, 상기 "쌀페이스트"는 쌀 및 물의 혼합물을 의미하며, 상기 혼합물이 분쇄된 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 쌀페이스트는 5 내지 35%(w/w)의 쌀 및 65 내지 95%(w/w)의 물을 혼합하여 제조될 수 있고, 더욱 구체적으로 15 내지 35%(w/w)의 쌀 및 65 내지 85%(w/w)의 물을 혼합하여 제조될 수 있고, 가장 구체적으로 20 내지 30%(w/w)의 쌀 및 70 내지 80%(w/w)의 물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 범위 이외의 혼합비로 쌀페이스트를 제조하는 경우, 요구르트의 품질 및 기호도가 저하되는 문제점이 있다.
또한, 상기 단계 (a)는, 쌀배아 및 물을 혼합하여 쌀배아유를 얻는 단계를 포함하며, 상기 쌀배아 및 물의 혼합비는 요구르트의 품질특성 및 관능특성을 최대화시키고, 유산균에 의한 발효를 저해하지 않는 정도가 적당하다. 이때, 상기 "쌀배아유"는 쌀배아 및 물의 혼합물을 의미하며, 상기 혼합물이 분쇄된 것 또는 상기 혼합물이 분쇄되어 여과된 것을 의미할 수 있다.
구체적으로, 상기 쌀배아유는 5 내지 15%(w/w)의 쌀배아 및 85 내지 95%(w/w)의 물을 혼합하여 제조될 수 있고, 더욱 구체적으로 8 내지 12%(w/w)의 쌀배아 및 88 내지 92%(w/w)의 물을 혼합하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 범위 이외의 혼합비로 쌀배아유를 제조하는 경우, 요구르트의 품질 및 기호도가 저하되는 문제점이 있다.
상기 단계 (b)는, 상기 (a) 단계에서 수득한 쌀페이스트 및 쌀배아유를 혼합하여 혼합물을 얻는 단계로서, 상기 쌀페이스트, 쌀배아유의 혼합비는 요구르트의 품질특성 및 관능특성을 최대화시키고, 유산균에 의한 발효를 저해하지 않는 정도가 적당하다.
구체적으로, 상기 혼합물은 상기 쌀페이스트, 쌀배아유를 동량의 부피비로 혼합하여 제조될 수 있다. 상기 범위 이외의 혼합비로 혼합물을 제조하는 경우, 요구르트의 품질 및 기호도가 저하되는 문제점이 있다.
본 발명의 목적상, 발효 효율을 증진시키기 위하여, 상기 혼합물에 2 내지 6%(w/v)의 설탕을 포함시켜 발효할 수 있고, 구체적으로 3%(w/v)의 설탕을 포함시켜 발효할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 범위 이외의 혼합비로 설탕을 첨가하는 경우, 요구르트의 품질 및 기호도가 저하되는 문제점이 있다.
본 발명의 제조방법은, 상기 단계 (b) 이후에 상기 혼합물을 멸균하고 균질화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 단계는 상기 (b) 단계에서 수득한 쌀페이스트 및 쌀배아유의 혼합물을 멸균하는 단계로서, 다른 균에 의해 목적하는 발효가 진행되지 않는 것을 막기 위한 것이다.
더욱 구체적으로, 상기 멸균은 90 내지 110℃, 더욱 구체적으로 95 내지 105℃, 가장 구체적으로 100℃에서 수행될 수 있고, 또한 50 내지 70분, 구체적으로 55 내지 65분, 가장 구체적으로 60분 동안 수행될 수 있으나, 멸균을 수행할 수 있는 한 이에 제한되지 않는다. 상기 멸균은 당업계에 알려진 방법으로 수행할 수 있으며, 구체적으로 건열살균, 고압살균 등의 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계는 상기 (b) 단계에서 수득한 쌀페이스트 및 쌀배아유의 혼합물을 균질화하는 단계로서, 발효의 효율을 증진시키기 위한 것이다. 균질화를 통해 입자의 표면적이 증가되고 점도가 균일하게 되며 질감이 부드럽게 되고 조직이 안정하게 된다.
더욱 구체적으로, 상기 균질화는 20 내지 40℃, 더욱 구체적으로 25 내지 35℃, 가장 구체적으로 30℃에서 수행될 수 있고, 또한 35 내지 45시간, 구체적으로 37 내지 43시간, 가장 구체적으로 40시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 균질화는 당업계에 알려진 방법으로 수행할 수 있으며, 구체적으로 고속균질화, 고압균질기, 콜로이드밀, 초음파기 등을 이용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 쌀 유산균발효물 제조에 있어, 쌀 추출물을 락토바실러스 플란타럼을 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 쌀 유산균 발효물 내 라이신 함량 증가 방법을 제공한다.
이때, 상기 용어 “쌀”, “유산균발효물(요구르트)”, “락토바실러스 플란타럼”, “쌀 추출물” 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법에 의해 제조되는, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물을 제공한다.
이때, 상기 용어 "쌀", "유산균발효물(요구르트)" 등에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 라이신 함량이 증가된 유산균발효물은, 락토바실러스 플란타럼 균주를 발효 균주로 사용하는 것을 특징으로 하며, 유산균의 다른 종을 사용하여 제조한 유산균발효물에 비하여 라이신 함량이 현저히 증가된다.
구체적으로, 상기 유산균발효물은 본 발명의 일 실시예에 사용된 락토바실러스 플란타럼 JSA22를 발효균주로 사용하는 요구르트의 제조방법으로 제조된 것일 수 있으나, 락토바실러스 플란타럼 균주가 라이신 함량을 증가시키는 효과를 갖는 한 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 유산균발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
이때, 상기 용어 "유산균발효물(요구르트)"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 용어, "식품"은 스낵류, 과자류, 빵, 피자, 라면, 기타 면류, 밥류, 즉석밥류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 건강식품 등 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함하며, 상기 유산균발효물이 포함될 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 쌀 유산균발효물은 쌀의 결핍 아미노산인 라이신 함량이 증가되어, 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하지 않고 제조한 유산균발효물에 비하여 품질특성이 우수하므로, 라이신 함량이 증가되고 곡류만을 포함하는 요구르트의 제조 및 이를 포함하는 식품의 개발에 적극 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 유산균 발효물을 제조하는 경우, 라이신 함량의 변화를 보여주는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 유산균 발효물을 제조하는 경우, 아미노산 분석 크로마토그램을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 유산균 발효물을 제조하는 경우, 발효 균주에 따른 라이신 함량 변화를 보여주는 도이다.
도 4는 라이신 생합성 경로 및 락토바실러스 플란타럼의 라이신 합성에 관여하는 유전자를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
도 2는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 유산균 발효물을 제조하는 경우, 아미노산 분석 크로마토그램을 보여주는 도이다.
도 3은 본 발명에 따른 제조방법에 의해 유산균 발효물을 제조하는 경우, 발효 균주에 따른 라이신 함량 변화를 보여주는 도이다.
도 4는 라이신 생합성 경로 및 락토바실러스 플란타럼의 라이신 합성에 관여하는 유전자를 확인한 결과를 보여주는 도이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 쌀 유산균발효물의 제조
다음과 같은 방법으로, 쌀 및 쌀배아를 포함하는 요구르트를 제조하였다.
먼저, 정선한 쌀을 시험용 분쇄기로 분쇄한 후, 50 메쉬(mesh) 체를 사용하여 통과한 쌀가루를 사용하였다. 상기 쌀가루와 물을 1:9 내지 3:7의 중량비로 혼합하고, 이를 분쇄하여 쌀페이스트를 제조하였다.
또한, 쌀배아와 물을 1:10의 중량비로 혼합하고, 이를 분쇄한 후 cheese cloth로 조여과하여 쌀배아유를 제조하였다.
이후, 상기 쌀페이스트 및 쌀배아유를 동량의 부피비로 혼합하여 쌀페이스트 및 쌀배아유의 혼합물을 제조하였고, 상기 혼합물에 3%(w/v)의 설탕을 가한 후, 멸균(호화, autoclaving, 100℃, 60분)하였다. 이를 상온에서 방냉하고, 균질화 과정을 거친 후, 유산균을 일정농도(0.1%(v/v), OD(600nm))로 접종하였고, 30℃에서 40시간 동안 발효시켜 쌀 및 쌀배아가 포함된 쌀요구르트를 제조하였다.
상기 유산균는 락토바실러스 플란타럼 JSA22이며, 대조 균주는 락토바실러스 람노서스 GG를 사용하였다. 유산균주는 MRS broth에 2회 계대배양하여 사용하였다.
한편, 본 발명의 쌀배아는 발효보조제, 즉 유산균의 단백질원으로써, 요구르트의 발효 효율을 증가시키기 위한 목적으로 사용한바, 당업계에서 발효보조제로 사용되는 우유를 포함하는 요구르트(한국야구르트, 메치니코프)를 양성 대조군으로 사용하였다.
실시예 2-1: 다양한 쌀 품종을 이용하여 제조한 쌀 유산균발효물의 아미노산 함량의 측정
상기 실시예 1에서 제조한, 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용하여 제조된 요구르트의 라이신 함량을 확인하기 위하여, 유리아미노산의 함량을 측정하였다.
이때, 쌀 품종으로는 삼광, 일품, 고아미4호, 하이아미, 한가루, 수원542, 밀양317, 조은흑미를 이용하였다.
유리아미노산은 동결건조된 시료 0.1 g에 80 % 에탄올 800 uL을 가하여 음파처리(sonication)로 추출, 80 % 에탄올 500 uL을 추가 2회 반복하여 추출하였다. 추출액은 원심분리(13,500 rpm, 10분)하여 상등액을 취하고 3회 추출한 상층액을 모두 합하여 CentriVap DNA Concentrator(LABCONCO CORPORATION, KANSAS CITY, USA)로 감압농축하였다. 추출 용매를 완전히 제거한 튜브에 3% TCA 1mL로 용해하여 1시간 음파처리, 1시간 200rpm으로 진탕(shaking)시켰다. 이 추출액을 원심분리(13,500 rpm, 20분)하여 상등액을 0.45 ㎛의 실린지 필터(syringe filter)로 여과하였다. Amino Acid Analyzer (L-8900, HITACHI, Japan)에 주입하여, 이온 교환 컬럼(#2622PF Column, 4D3846), 컬럼 온도는 38 내지 70 ℃, reactor heater 온도는 135 ℃를 유지하며 분석하였고, 주입 부피는 20.0 uL, 유속 0.35 mL/분, 이동상은 PF1, PF2, PF3, PF4, PF-RG, R3, 닌히드린 용액, 닌히드린 완충액(Wako, Japan)을 사용하였으며, Detector UV 570 nm, 440 nm에서 검출하였다. 유리아미노산 표준물질은 Type AN-II와 Type B(Wako, Japan)를 1:1(v/v)로 혼합하여, 20배 희석한 후 분석에 사용하였다.
발효 전 유리아미노산의 함량(0 hour) 및 40시간 발효 후 유리아미노산의 함량(40 hour)을 각각 측정하였고, 양성 대조군인 우유기반 발효유(한국야구르트, 메치니코프)의 유리아미노산의 함량을 측정하였다.
그 결과, 상기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 사용된 모든 쌀 품종에서 발효 전과 발효 후의 총 아미노산의 함량에는 변화가 미미하였으나, 라이신 함량에 있어서는 발효 전 대비 발효 후의 라이신 함량이 최소 1.5배 이상으로 현저하게 증가한 것을 확인하였다. 아울러, 이는 양성 대조군에 비해서는 최소 4배 이상 높은 수치로서, 상기 방법에 의해 제조된 요구르트에서 라이신의 함량이 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통해, 우유 기반의 발효유에 비하여, 쌀을 포함하는 요구르트는 락토바실러스 플란타럼을 이용하여 제조함으로써 라이신 함량이 현저히 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
특히, 도 1 및 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 다른 품종의 경우에는 라이신 함량이 1.5배 내지 3배 정도 증가하였으나, 조은흑미 품종의 경우에는 발효 전에 비하여 약 6배 이상 라이신 함량이 증가한 것을 확인하였으며, 이는 양성 대조군에 비하여 약 18배의 증가된 수치임을 확인함으로써, 조은흑미 품종을 사용할 경우에는 라이신 함량 증가가 보다 현저함을 알 수 있었다.
실시예
2-2:
락토바실러스
람노서스
균주를 이용한 쌀
유산균발효물과의
비교
상기 실시예 2-1에서 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 균주를 이용한 쌀 유산균발효물이 우수한 라이신 증가 효과가 있음을 확인하였는바, 락토바실러스 람노서스 균주를 이용한 쌀 유산균발효물과의 비교를 수행하였다.
구체적으로는, 쌀 품종으로는 삼광 및 조은흑미를 사용하였으며, 발효 균주로서 락토바실러스 플란타럼 JSA22 균주 및 락토바실러스 람노서스 GG 균주를 이용하였다. 발효 전 라이신 및 아스파르트산의 함량(0 hour) 및 40시간 발효 후 라이신 및 아스파르트산의 함량(40 hour)을 각각 측정하였다.
그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼 JSA22로 제조된 쌀발효물의 경우에는 발효 전(조은흑미: 5.26mg%, 삼광: 4.27mg%)에 비하여 발효 후(조은흑미: 49.52mg%, 삼광: 39.08)에 약 10배 정도 라이신 함량이 증가하였고, 반면에 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)로 제조된 쌀발효물의 경우에는 발효 전(조은흑미: 5.53 mg%, 삼광:3.96mg%)에 비하여 발효 후(조은흑미: 4.81mg%, 삼광 3.59mg%)에 라이신 함량의 변화가 미미하였다.
상기 결과를 통해, 다른 종의 유산균으로 발효하여 쌀 유산균발효물을 제조한 경우에 비하여, 락토바실러스 플란타럼으로 발효하여 제조한 경우에 라이신 함량을 현저히 증가시키며, 특히 조은흑미를 쌀 품종으로 선택하는 경우 라이신 함량의 증가 효율이 우수함을 확인하였다.
실시예
3:
락토바실러스
플란타럼의
라이신
합성유전자 확인
라이신 합성은 아스파르트산을 전구체로 하여 합성이 되는데, 합성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해, 락토바실러스 플란타럼 균주의 DNA 추출 및 PCR을 수행하였다.
락토바실러스 플란타럼 JSA22 균주의 게놈 DNA 추출은 Qiagenprep spin miniprep kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)을 이용하였다. 13,500 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 조심스럽게 제거하고, 180 uL의 20 mg/mL 라이소자임을 첨가하여 현탁한 후, 37 ℃ 항온수조에서 30분 동안 반응시켰다. 20 uL 프로테인나아제 K 및 200 uL AL 완충액을 첨가하여 56 ℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응 후 200 uL 에탄올을 첨가하여 혼탁하였다. 반응액을 미니 스핀 컬럼(mini spin column)에 옮기고 원심분리하였다. 스핀 컬럼에 AW 완충액을 첨가하였고 컬럼을 통과한 시료는 모두 폐기하였다. 50 uL AE 완충액을 첨가하여 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 DNA를 추출하였다. DNA 농도는 분광광도계를 이용하여 측정하였다.
PCR은 thermal cycler (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, CA, USA)을 사용하여 amfiEco PCR premix kit (GenDEPOT, CA, USA), 2 μl의 정방향 및 역방향 프라이머, DNA 시료 총 25 μl로 구성된 PCR 반응액으로 실시되었다. PCR 반응 조건은 94℃에서 2분간 변성 후, 94℃에서 2분 변성(denaturation), 프라이머의 Tm값에 따라 46∼60℃에서 2분 어닐링(annealing), 72℃에서 1분/kb 신장(elongation) 반응을 30회 주기로 수행한 후, 72℃ 10분간 최종 신장 반응을 수행하였다. 증폭된 산물은 0.8% 아가로스 겔에서 확인하였다.
| 번호 | 유전자 | 프라이머 | 서열번호 |
| 1-1 | ThrA2-5 | (5-ATTGATGACTCTGAACCGTC-3) | 1 |
| ThrA2-6 | (5-TGCTGACGAACGAGTATCCG-3) | 2 | |
| 1-2 | ThrA1-1 | (5-TTCAATAAGGACTACTTCTTG-3) | 3 |
| ThrA1-2 | (5-ATCTAGGTCAACAAAAAAGC-3) | 4 | |
| 1-3 | ThrA2-1 | (5- AATTAAATTCTCGTGAGTGG-3) | 5 |
| ThrA2-2 | (5-AACACGGCCATAAAAAATG-3) | 6 | |
| 2-1 | Asd2-11 | (5-TTGAGTGGCGTATTCAACGG-3) | 7 |
| Asd2-12 | (5-AGGACAAGGATAAAGGACAC-3) | 8 | |
| 2-2 | Asd1-1 | (5-CATAGGAAGAAAAAAGTGCG-3) | 9 |
| Asd1-2 | (5-AGCCTCCTCAATAATTCTCC-3) | 10 | |
| 2-3 | Asd2-1 | (5-ATCTGCGTGTGCAAAACAG-3) | 11 |
| Asd2-2 | (5-GGATCAGCTTTTCATTAC-3) | 12 | |
| 2-4 | asd-F | 5-GCGCACATGTGGGTCAAGAAAATGGTCTTC-3 | 13 |
| asd-R | 5-ATGGTACCTGCCCCCGAATTTTTGAAC-3 | 14 | |
| 3-1 | Hom1-1 | (5-TTAGCAAACGTCGCTGATG-3) | 15 |
| Hom1-2 | (5-TGATATCTACGTTCTCGTG-3) | 16 | |
| 3-2 | Hom2-1 | (5-GGGCCAATTAAATTAGTCTG-3) | 17 |
| Hom2-2 | (5-ACACTTGTAGCGTTAGTTGC-3) | 18 | |
| 4-1 | DapA1-3 | (5-GGTTAGCCGTGATTGTTG-3) | 19 |
| DapA1-4 | (5-AACTGAAGTCCGGAATCAC-3) | 20 | |
| 4-1’ | DapA1-1 | (5-GGTTAGCCGTGATTGTTG-3) | 21 |
| DapA1-2 | (5-AACTGAAGTCCGGAATCAC-3) | 22 | |
| 4-2 | DapA2-1 | (5-ATGGCATCACACAACTGTC-3) | 23 |
| DapA2-2 | (5-CTGATCCCTGATGATGAAAC-3) | 24 | |
| 4-3 | dapA-F | 5-GCGCACATGTGGTTTCATTTGGTCGAATATC-3 | 25 |
| dapA-R | 5-ATGGTACCGGCAGTAAAAACTCCATTGAT-3 | 26 | |
| 5-1 | DapB-1 | (5-AATAGTGTTCGACCGAGCG-3) | 27 |
| DapB-2 | (5-AATATCGACGTCATGTAGGGG-3) | 28 | |
| 10-1 | lysA-F | 5-GCGCACATGTGTATTTTCATGGCACAACA-3 | 29 |
| lysA-R | 5-ATGGTACCGCAGCTTAGTATCTTACTCT-3 | 30 |
그 결과, 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼 균주의 DNA에는 번호 1(ThrA), 2(Asd), 3(Hom), 4(DapA), 5(DapB)에 해당하는 유전자, 즉 라이신 합성에 관여하는 유전자를 가짐을 확인하였다.
이상의 내용을 종합하면, 쌀을 사용하여 제조한 요구르트는 우유 기반의 발효유에 비하여 라이신 함량이 높은데, 그에 더하여 락토바실러스 플란타럼을 발효 균주로 이용할 경우 라이신 함량을 현저히 증가시키므로, 락토바실러스 플란타럼 균주의 발효를 통해 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물을 제조할 수 있음을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (14)
- 쌀 추출물을, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼은 기탁번호 KACC91973P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 JSA22인 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 쌀 추출물은,
(a) 쌀 및 물을 혼합하여 쌀페이스트를 제조하고, 쌀배아 및 물을 혼합하여 쌀배아유를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 쌀페이스트 및 쌀배아유를 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계에 의해 제조된 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 쌀페이스트는 5 내지 35%(w/w)의 쌀 및 65 내지 95%(w/w)의 물을 혼합하여 제조된 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계 (a)의 쌀배아유는 5 내지 15%(w/w)의 쌀배아 및 85 내지 95%(w/w)의 물을 혼합하여 제조된 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계 (b)는 상기 쌀페이스트 및 쌀배아유를 동량의 부피비로 혼합한 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계 (b)의 혼합물은 2 내지 6(w/v)의 설탕을 포함하는 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법
- 제2항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 (b) 단계 이후에 상기 혼합물을 멸균하고 균질화하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 락토바실러스 플란타럼은 0.05 내지 0.15%(v/v)로 접종되는 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서, 상기 단계에 사용된 쌀은 조은흑미인 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 제조방법은 유제품을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는 것인, 라이신 함량이 증가된 쌀 유산균발효물의 제조방법.
- 삭제
- 쌀 유산균발효물 제조에 있어,
쌀 추출물을, 기탁번호 KACC91973P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 JSA22를 이용하여 발효시키는 단계를 포함하는, 쌀 유산균 발효물 내 라이신 함량 증가 방법.
- 삭제
- 삭제
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