JP7109783B2 - 優れた免疫賦活能を有する新規の乳酸菌 - Google Patents
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Description
(項目1)
Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)。
(項目2)
Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、IL-12産生誘導活性を有する、変異株。
(項目3)
Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、IgE抑制活性を有する、変異株。
(項目4)
Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、抗がん活性を有する、変異株。
(項目5)
項目1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
(項目6)
項目1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を用いて製造された、乳酸菌加熱菌体。
(項目7)
項目1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を、葛由来デキストリンを含む培地で培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
(項目8)
項目7に記載の方法で製造された、乳酸菌加熱菌体。
(項目9)
項目6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、IL-12産生を誘導するための組成物。
(項目10)
項目6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、IgEを抑制するための組成物。
(項目11)
項目6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、癌を処置または予防するための組成物。
本発明のLeuconostoc mesenteroidesに属する新規のつる5株(受託番号 NITE P-02751)は、Leuconostoc mesenteroidesに特徴的な以下の菌学的特徴を有し、ザワークラウトなどの発酵食品に用いられる。この菌は、以下の菌学的特徴を備えていた。
・グラム陽性の球菌で連鎖状ないし双球菌の形態である。
・糖を分解して乳酸菌と乳酸菌以外の短鎖脂肪酸の酢酸、エタノール、CO2などを生成するヘテロ乳酸菌に分類される。
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
「つる5」株の代表的な培養条件は、MRS培地にて静置培養25~37℃で24~48時間であるが、これに限定されない。
前記変異株は、例えば、一般的な突然変異処理を施すこと、又は経代培養による適応若しくは自然変異により作製される。
葛由来デキストリンの製造には、植物からデキストリンを調製する任意の方法を使用することができる。代表的な好ましい葛由来デキストリンの製造工程は、以下のとおりである。
・葛根を粉砕→もみだし→さらし布で濾す→不純物除去→沈殿→乾燥→0.1%~0.3%酵素を添加し炊き上げと同時に液化(液化条件:pH5.0~7.0、50~75℃)→滅菌(90~112℃、10~60分)→乾燥を行う。
Leuconostoc mesenteroidesに属する「つる5」株を、以下の手順で単離した。
・クズの蔓を、抗生物質を添加した乳酸菌用の液体培地にて25℃~37℃で24~48時間集積培養
・得られた培養液をBCP加プレートカウントアガール培地に塗抹培養して、Leuconostoc mesenteroidesに属する新規のつる5株を選択した。
単離した「つる5」株の16S rDNA遺伝子の塩基配列を決定した。その結果を図1に示す(配列番号1)。図2は、「つる5」株の16S rDNA遺伝子(上段のSIID23149-01、配列番号1)と比較対象であるLeuconostoc mesenteroidesに属するRIB.9186株(酒類総合研究所より入手、下段のSIID23149-02、配列番号2)とを比較したアラインメントである。
BALB/cマウスより脾臓細胞を調製し、2.5×106/mlの濃度の細胞培養液に被験乳酸菌の重量濃度が1μg/mlおよび10μg/mlになるように乾燥した乳酸菌を加え、96穴培養プレートに200μL/well分注し、5% CO2、37℃下で2日間培養後、サンドイッチELISA法により培養液中のIL-12濃度を測定した。なお、使用したBALB/cマウスの週齢は11週齢であり、脾臓細胞培養液は10%FBS(ウシ胎児血清)-RPMI1640+100μg/mlストレプトマイシン+100U/mlペニシリン+50μM 2-メルカプトエタノールを用いた。1サンプルおよび1濃度について6wellを使用した。統計学的解析は一元配置の分散分析を行い、陽性対照との比較はDunnettの検定を行い、各サンプル間の対比較はTukeyの検定を行い、有意差の有無を検定した。また、個々のサンプルの1μg/mlと10μg/mlの比較はWelchのt-testにより検定した。
本発明の「つる5」株の培養培地(MRS培地)中のグルコースを葛由来デキストリンに代えて、「つる5」株を培養し、脾臓細胞におけるIL-12産生誘導活性を試験した。
・葛根を粉砕→もみだし→さらし布で濾す→不純物除去→沈殿→乾燥→0.1%~0.3%酵素を添加し炊き上げと同時に液化(液化条件:pH5.0~7.0、50~75℃)→滅菌(90~112℃、10~60分)→乾燥。
『レビス(登録商標)IgE-ELISAキット(マウス)』((株)シバヤギ)を用い測定検体中のIgEを測定した。マイクロプレート分光光度計はBio-rad社製品を用い、標準曲線は3次多項式を用い測定値を算出した。なお、測定は1検体あたり2点測定し平均値を採用した。統計処理は、F検定により分散の検定を行ない、等分散の場合はStudent’s t-test、不等分散の場合はWelch’s t-testにより比較を行なった。
マウス乳がん4T1細胞株を皮下に移植した担癌マウスモデルに、被験物質を移植の7日前から28日間経口投与した場合の抗腫瘍効果を、腫瘍体積及び腫瘍重量を指標にして検討した。本試験は、株式会社ケー・エー・シーの動物実験規程、動物実験委員会規定及び動物実験承認規定を遵守して適正に実施した(承認番号:17-1107)。
加熱菌体の作製は、代表的には、図8のスキームに従う。具体的には、20~40℃で10~40時間培養した後に、70~121℃で10~60分間加熱殺菌した。本発明の加熱菌体は、免疫賦活能を有する組成物、癌を処置および/または予防するための組成物の有効成分として利用可能である。
配列番号2:Leuconostoc mesenteroidesに属するRIB.9186株の16S rDNA遺伝子の核酸配列
Claims (11)
- Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)。
- Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、IL-12産生誘導活性を有する、変異株。
- Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、IgE抑制活性を有する、変異株。
- Leuconostoc mesenteroidesに属するつる5株(受託番号 NITE P-02751)の変異株であって、該変異株は、配列番号1に示される核酸配列からなる16S rDNA遺伝子を有し、かつ、抗がん活性を有する、変異株。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を用いて製造された、乳酸菌加熱菌体。
- 請求項1~4のいずれか一項に記載のつる5株(受託番号 NITE P-02751)またはその変異株を、葛由来デキストリンを含む培地で培養する工程を包含する、乳酸菌加熱菌体を生産する方法。
- 請求項7に記載の方法で製造された、乳酸菌加熱菌体。
- 請求項6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、IL-12産生を誘導するための組成物。
- 請求項6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、IgEを抑制するための組成物。
- 請求項6または8に記載の乳酸菌加熱菌体を含む、癌を処置または予防するための組成物。
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