JP5413760B2 - 乳酸菌、乳酸菌を含有する組成物および乳酸菌の培養方法 - Google Patents
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Description
本発明は、乳酸菌、乳酸菌を含有する組成物および乳酸菌の培養方法に関する。
これまで、各種の乳酸菌は免疫を向上させる効果を有することが明らかとなっている。この中で、アルコールを含む食品の中でワイン醪、漬け物、日本酒の生もとから分離された乳酸菌は免疫調整作用を有していることが知られている。特許文献1には、アルコール発酵にて副生の残渣に生育するラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)に属する乳酸菌が免疫増強作用を有することが記載されている。
上記のように、アルコール耐性を有する乳酸菌は免疫増強作用を有することが知られている。発明者は、さらに優れた免疫増強作用を有する乳酸菌が得られないか鋭意検討した結果、アルコール耐性を有する乳酸菌を、アルコールを含有する培地で培養することによって、IL−12の産生誘導能を有する乳酸菌が得られることに想到した。
すなわち、本発明は、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物および乳酸菌の培養方法を提供することを目的とする。
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス(Lactobacillus fructivorans)に属する乳酸菌、NITE P−1300もしくはNITE P−1301であって、アルコール含有培地にて培養され、IL−12の産生誘導能、IFN−γの産生誘導能、およびTNF−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
この構成によれば、アルコール耐性を有する乳酸菌をアルコール含有培地で培養して得られた、IL−12の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌である。
この構成によれば、アルコール耐性を有する乳酸菌をアルコール含有培地で培養して得られた、IL−12の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌である。
本発明の組成物は、前記アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を含有し、免疫増強作用を有する。これによれば、優れた免疫増強作用を持つ乳酸菌を利用した組成物である。
また、本発明の組成物は食品であることが好ましい。これによれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌を食品に含有させることができ、摂取して免疫を増強させることができる。
また、本発明の組成物は医薬品であることが好ましい。これによれば、乳酸菌の優れた免疫増強作用を利用した医薬品である。
また、本発明の組成物は飼料であることが好ましい。これによれば、飼育動物の餌に利用して、飼育動物の免疫を増強させることができる。
また、本発明の組成物は医薬品であることが好ましい。これによれば、乳酸菌の優れた免疫増強作用を利用した医薬品である。
また、本発明の組成物は飼料であることが好ましい。これによれば、飼育動物の餌に利用して、飼育動物の免疫を増強させることができる。
上記目的を達成するため、本発明の乳酸菌の培養方法は次の構成を備える。すなわち本発明は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス(Lactobacillus fructivorans)に属する乳酸菌、NITE P−1300もしくはNITE P−1301を、アルコールを5〜10vol%含有する培地にて培養することによって、IL−12の産生誘導能、IFN−γの産生誘導能およびTNF−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする。
本発明によれば、優れた免疫増強作用を有する乳酸菌、その組成物、およびその乳酸菌の培養方法を提供することができる。
以下、本発明の好適な実施形態を詳細に説明する。
本実施形態に係る乳酸菌は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であって、アルコール含有培地にて培養され、IL−12の産生誘導能を有することを特徴とする。さらに、IFN−γの産生誘導能、TNF−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
また、本実施形態に係る乳酸菌の培養方法は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を、アルコールを5〜10vol%含有する培地にて培養することによって、IL−12の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらに、IFN−γの産生誘導能、TNF−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
本実施形態に係る乳酸菌は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であって、アルコール含有培地にて培養され、IL−12の産生誘導能を有することを特徴とする。さらに、IFN−γの産生誘導能、TNF−αの産生誘導能を有することを特徴とする。
また、本実施形態に係る乳酸菌の培養方法は、アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌を、アルコールを5〜10vol%含有する培地にて培養することによって、IL−12の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらに、IFN−γの産生誘導能、TNF−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
アルコール耐性を有する乳酸菌としては、酒類の製造や漬け物製造等のアルコールを含む食品の製造に関連する乳酸菌が挙げられる。
本実施形態で用いるアルコール耐性を有する乳酸菌は、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌であり、アルコールを含む食品から分離されたものである。本実施形態の乳酸菌は、アルコールを含む食品から分離された乳酸菌を、アルコールを含む培地を用いて培養して免疫増強作用を向上させたものである。
培養ではアルコール濃度5〜10vol%の培地を用いて菌を増殖させることが好ましい。培地のアルコール濃度が5vol%より高くなると、アルコールを添加しないで単に培養したものと比べてIL−12の産生誘導能は向上して、免疫増強作用は高まる。また、培地のアルコール濃度が10vol%よりも高いと、乳酸菌の増殖速度が低下し始めて得られる菌体量が少なくなる。さらに、培地のアルコール濃度が15vol%よりも高いと乳酸菌が増殖し難くなり、効率的に菌体を得ることが困難となる。
培養用の培地は特に限定されないが、後記するみりん粕抽出液を用いて調製した培地を好適に用いることができる。培養温度は25〜30℃程度が好ましく、培養時間は、菌株や培地のアルコール濃度によっても相違するが、60〜100時間程度が好ましい。
これら乳酸菌を、上記のように、アルコールを5〜10vol%含有する培地を用いて培養することによって、IL−12の産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。さらにIL−12に加えて、IFN−γ、TNF−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することができる。
特に発明者等は、みりん製造時の醪中から次の乳酸菌を分離し、この乳酸菌をアルコール含有培地にて培養した結果、優れた免疫増強作用を有することがわかった。すなわち、この乳酸菌は、真性火落菌であるラクトバチルス・フルクチボランスに属するNITE P−1300、NITE P−1301であり、IL−12の産生誘導能を有し、優れた免疫増強作用を有する。
これらみりん醪中から分離されたアルコール耐性を有する乳酸菌は、酒類製造時に常在する乳酸菌で、これら乳酸菌の増殖によって酒類としては風味を損なうことから、「火入れ」と呼ばれる低温殺菌工程を経て流通されることが多い。しかし、「火入れ」法が用いられる以前は、これら乳酸菌およびその代謝物を含有した酒類を飲用していたと考えられることから、人に対して安全性は問題ない。
これらみりん醪中から分離されたアルコール耐性を有する乳酸菌は、酒類製造時に常在する乳酸菌で、これら乳酸菌の増殖によって酒類としては風味を損なうことから、「火入れ」と呼ばれる低温殺菌工程を経て流通されることが多い。しかし、「火入れ」法が用いられる以前は、これら乳酸菌およびその代謝物を含有した酒類を飲用していたと考えられることから、人に対して安全性は問題ない。
また、これら乳酸菌の少なくとも1種類を食品、飼料、医薬品、医薬部外品等に混入させることによって、免疫増強作用を有する組成物を提供することができる。例えば、ヨーグルト、パンなどの食品や乳酸菌飲料、アルコール飲料などの飲料、飼料には、乳酸菌をそのまま、あるいはカプセルなどに封入して所要量混入させるようにすればよい。また、医薬品、医薬部外品に用いる場合には、賦形剤、結合剤、崩壊剤、溶解補助剤、コーティング剤等の製剤に用いる公知の補助剤を用いて製剤する。剤形としては、錠剤、カプセル剤、加硫剤等、任意である。さらに、食品製造過程で積極的に本件乳酸菌を培養してそのまま利用する方法もある。免疫増強作用を有する組成物を提供するためにこれら乳酸菌の少なくとも1種類を混入させる場合、これら乳酸菌は生菌、死菌、さらには磨砕や破砕等により処理物としてもかまわない。
[実施例1]
みりん醪中に生息する乳酸菌を分離し、アルコール含有培地で培養して得られた乳酸菌の免疫増強作用を調査した。
みりん醪中に生息する乳酸菌を分離し、アルコール含有培地で培養して得られた乳酸菌の免疫増強作用を調査した。
1.分離方法
みりん醪の希釈懸濁液を火落菌検出培地(日本醸造協会製、SI培地、アルコール濃度5〜10vol%、pH5.0)に添加して25〜30℃で混釈培養し、生育してきたコロニーを釣菌した。さらにこれを寒天平板培地で培養を繰り返して純粋分離を行い、アルコール耐性を有する乳酸菌224株を得た。
みりん醪の希釈懸濁液を火落菌検出培地(日本醸造協会製、SI培地、アルコール濃度5〜10vol%、pH5.0)に添加して25〜30℃で混釈培養し、生育してきたコロニーを釣菌した。さらにこれを寒天平板培地で培養を繰り返して純粋分離を行い、アルコール耐性を有する乳酸菌224株を得た。
2.同定試験
得られた菌株は生理的手法と分子生物学的手法によって火落性乳酸菌と真性火落菌の2タイプに類別した。さらに、同じ性状を持つ株が複数分離されていたことから、それぞれのタイプに特徴的な菌株を選定した。すなわち、真性火落菌の中から2株(AP−1300株、AP−1301株)、火落性乳酸菌の中から5株(YM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株)を選定し、同定試験を行った。
得られた菌株は生理的手法と分子生物学的手法によって火落性乳酸菌と真性火落菌の2タイプに類別した。さらに、同じ性状を持つ株が複数分離されていたことから、それぞれのタイプに特徴的な菌株を選定した。すなわち、真性火落菌の中から2株(AP−1300株、AP−1301株)、火落性乳酸菌の中から5株(YM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株)を選定し、同定試験を行った。
(1)生理的諸性質
乳酸菌実験マニュアルに従って、生理的諸性質を調べた結果を表1、表2に示す。AP−1300株、AP−1301株ついて、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陽性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産が認められ、ヘテロ発酵型であることが確認された。
YM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株について、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陰性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産は認められず、ホモ発酵型であることが確認された。
乳酸菌実験マニュアルに従って、生理的諸性質を調べた結果を表1、表2に示す。AP−1300株、AP−1301株ついて、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陽性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産が認められ、ヘテロ発酵型であることが確認された。
YM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株について、いずれもグラム染色は陽性、カタラーゼ反応は陰性、乳酸の生成は陽性であり、メバロン酸要求性は陰性であった。また、発酵形式を調べた結果、ガスの生産は認められず、ホモ発酵型であることが確認された。
(2)16S rDNAの塩基配列の解析
アルコール耐性を有する上記の菌株のうち、真性火落菌であるAP−1300株、AP−1301株の16S rDNA塩基配列は、基準株のLactobacillus fructivorans NBRC14747株と相同率99.8%であった。これらのことから、2菌株はラクトバチルス・フルクチボランスと同定された。この2菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託し、受託番号はそれぞれNITE P−1300、NITE P−1301である。
さらに、上記菌株のうち、火落性乳酸菌であるYM−201株など5株の16S rDNA塩基配列は、基準株のLactobacillus paracasei subsp.paracasei NBRC15889株と相同率99.9%であった。このことから、YM−201株など5株は、ラクトバチルス・パラカゼイと同定された。
アルコール耐性を有する上記の菌株のうち、真性火落菌であるAP−1300株、AP−1301株の16S rDNA塩基配列は、基準株のLactobacillus fructivorans NBRC14747株と相同率99.8%であった。これらのことから、2菌株はラクトバチルス・フルクチボランスと同定された。この2菌株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センターに寄託し、受託番号はそれぞれNITE P−1300、NITE P−1301である。
さらに、上記菌株のうち、火落性乳酸菌であるYM−201株など5株の16S rDNA塩基配列は、基準株のLactobacillus paracasei subsp.paracasei NBRC15889株と相同率99.9%であった。このことから、YM−201株など5株は、ラクトバチルス・パラカゼイと同定された。
3.菌体の調製方法
(1)菌
みりん醪から分離・同定した上記菌株を用いた。
(2)乳酸菌の調製
[培地]
みりん粕4kgに5倍量の水を加え、60℃で1時間加熱・溶解した後に放冷し、濾過してみりん粕抽出液15Lを得た。このみりん粕抽出液850mLに、酵母エキス20g(オリエンタル酵母工業製)、メバロン酸0.005g(シグマ製)を加え、6N塩酸を用いてpH5.0に調製した後、オートクレーブ殺菌した。アルコールとしてエタノールを用いた。オートクレーブ殺菌後のみりん粕抽出液に、培地中の最終エタノール濃度が0(エタノール無添加)、5、10vol%、加えてAP−1300株、AP−1301株用については7、15vol%となるようにエタノールを加えて1Lとしたものを培地(以下MKY培地と記す)として用いた。
[培養]
各菌株をエタノール濃度0、5、7、10、15vol%の火落菌検出培地(日本醸造協会製、SI培地)に植菌し、30℃で5〜7日間前培養を行った。次いで各エタノール濃度の火落菌検出培地で前培養した菌株の培養液を、火落菌検出培地と同じエタノール濃度となるエタノール濃度0、5、7、10、15vol%の各MKY培地1Lに、OD660nm=0.01となるように添加した。30℃で培養し、定常期初期の増殖段階まで培養した。なお、AP−1300株、AP−1301株の各条件での増殖状況は図1、図2に示した通りである。
[集菌、洗浄、殺菌、凍結乾燥]
MKY培地で培養後の各培養液を4℃、8000rpmで10分間遠心分離を行い、上清を捨て集菌した。さらに、蒸留水を用いて2回洗浄し、最後に10mLの蒸留水に菌体を懸濁した後、常法通りオートクレーブ殺菌し、室温まで放冷後、凍結乾燥した。なお、得られた乾燥菌体重量は表3、表4に示した通りである。
(1)菌
みりん醪から分離・同定した上記菌株を用いた。
(2)乳酸菌の調製
[培地]
みりん粕4kgに5倍量の水を加え、60℃で1時間加熱・溶解した後に放冷し、濾過してみりん粕抽出液15Lを得た。このみりん粕抽出液850mLに、酵母エキス20g(オリエンタル酵母工業製)、メバロン酸0.005g(シグマ製)を加え、6N塩酸を用いてpH5.0に調製した後、オートクレーブ殺菌した。アルコールとしてエタノールを用いた。オートクレーブ殺菌後のみりん粕抽出液に、培地中の最終エタノール濃度が0(エタノール無添加)、5、10vol%、加えてAP−1300株、AP−1301株用については7、15vol%となるようにエタノールを加えて1Lとしたものを培地(以下MKY培地と記す)として用いた。
[培養]
各菌株をエタノール濃度0、5、7、10、15vol%の火落菌検出培地(日本醸造協会製、SI培地)に植菌し、30℃で5〜7日間前培養を行った。次いで各エタノール濃度の火落菌検出培地で前培養した菌株の培養液を、火落菌検出培地と同じエタノール濃度となるエタノール濃度0、5、7、10、15vol%の各MKY培地1Lに、OD660nm=0.01となるように添加した。30℃で培養し、定常期初期の増殖段階まで培養した。なお、AP−1300株、AP−1301株の各条件での増殖状況は図1、図2に示した通りである。
[集菌、洗浄、殺菌、凍結乾燥]
MKY培地で培養後の各培養液を4℃、8000rpmで10分間遠心分離を行い、上清を捨て集菌した。さらに、蒸留水を用いて2回洗浄し、最後に10mLの蒸留水に菌体を懸濁した後、常法通りオートクレーブ殺菌し、室温まで放冷後、凍結乾燥した。なお、得られた乾燥菌体重量は表3、表4に示した通りである。
表3より、火落性乳酸菌のラクトバチルス・パラカゼイであるYM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株については、アルコール濃度0vol%で培養した方が5vol%で培養したものよりも乾燥菌体重量は多かった。また、アルコール濃度10vol%では十分な菌体量を得ることができなかった。
火落性乳酸菌よりもアルコール耐性の強い真性火落菌のラクトバチルス・フルクチボランスであるAP−1300株、AP−1301株は、アルコール濃度10vol%で培養して得られた菌体量が他のアルコール濃度で得られたものよりも多かった。また、図1、図2から明らかなように、培地のアルコール濃度が15vol%では増殖し難いため、培養時間をアルコール濃度10vol%の2〜3倍(200〜300時間)に延長して試験に供するための菌体を確保した。
火落性乳酸菌よりもアルコール耐性の強い真性火落菌のラクトバチルス・フルクチボランスであるAP−1300株、AP−1301株は、アルコール濃度10vol%で培養して得られた菌体量が他のアルコール濃度で得られたものよりも多かった。また、図1、図2から明らかなように、培地のアルコール濃度が15vol%では増殖し難いため、培養時間をアルコール濃度10vol%の2〜3倍(200〜300時間)に延長して試験に供するための菌体を確保した。
なお、MKY培地はpHなどの影響により多少の沈殿物が生じる。この培地成分由来沈殿物の免疫活性への影響を確認するため、菌体を接種しない培地を同条件に置いて生じる沈殿物を、同様に洗浄して培地成分由来沈殿物(以下MPと記す)として調製した。
4.In vitro試験方法
(1)マウス脾臓細胞による各種サイトカイン遺伝子発現に及ぼす影響
C3H/HeNマウス(6週齢、メス)より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓は、常法に従い脾臓細胞浮遊液とした。この脾臓細胞浮遊液に上記の凍結乾燥した乳酸菌を終濃度100μg/mLになるように添加し、37℃で6時間培養した。IL−12、IFN−γ、TNF−αのmRNA発現量はリアルタイムPCR法により測定し、コントロールを1とした場合の相対発現量として活性の比較を行った。ここで、コントロールとは、凍結乾燥した乳酸菌を添加しないで、乳酸菌を添加した場合と同様に、脾臓細胞浮遊液を37℃、6時間で処理したもののmRNA発現量である。
(1)マウス脾臓細胞による各種サイトカイン遺伝子発現に及ぼす影響
C3H/HeNマウス(6週齢、メス)より無菌的に脾臓を採取した。採取した脾臓は、常法に従い脾臓細胞浮遊液とした。この脾臓細胞浮遊液に上記の凍結乾燥した乳酸菌を終濃度100μg/mLになるように添加し、37℃で6時間培養した。IL−12、IFN−γ、TNF−αのmRNA発現量はリアルタイムPCR法により測定し、コントロールを1とした場合の相対発現量として活性の比較を行った。ここで、コントロールとは、凍結乾燥した乳酸菌を添加しないで、乳酸菌を添加した場合と同様に、脾臓細胞浮遊液を37℃、6時間で処理したもののmRNA発現量である。
[IL−12のmRNA発現量]
図3より、ラクトバチルス・フルクチボランスに属するAP−1300株、AP−1301株に関して、アルコール濃度0vol%、5vol%の培地よりアルコール濃度10vol%の培地で培養して得られた菌体の方が、IL−12のmRNA発現量は増大した。さらに、AP−1300株、AP−1301株のIL−12のmRNA発現量は、いずれのアルコール濃度に対するラクトバチルス・パラカゼイに属するYM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株の発現量より多かった。
なお、培地成分由来沈殿物では、mRNA発現量の増大は認められなかった。
図4から明らかなように、AP−1300株、AP−1301株については、IL−12のmRNA発現量はアルコール濃度による違いが認められた。アルコール濃度5〜10vol%で培養して得られた菌体によるIL−12のmRNA発現量はコントロールに対して1.7倍〜3.0倍と有意に増加した。しかし、アルコール濃度0vol%および15vol%で培養して得られたものはコントロールとの違いは認められなかった。
図3より、ラクトバチルス・フルクチボランスに属するAP−1300株、AP−1301株に関して、アルコール濃度0vol%、5vol%の培地よりアルコール濃度10vol%の培地で培養して得られた菌体の方が、IL−12のmRNA発現量は増大した。さらに、AP−1300株、AP−1301株のIL−12のmRNA発現量は、いずれのアルコール濃度に対するラクトバチルス・パラカゼイに属するYM−201株、YM−203株、YM−204株、YM−207株、YM−208株の発現量より多かった。
なお、培地成分由来沈殿物では、mRNA発現量の増大は認められなかった。
図4から明らかなように、AP−1300株、AP−1301株については、IL−12のmRNA発現量はアルコール濃度による違いが認められた。アルコール濃度5〜10vol%で培養して得られた菌体によるIL−12のmRNA発現量はコントロールに対して1.7倍〜3.0倍と有意に増加した。しかし、アルコール濃度0vol%および15vol%で培養して得られたものはコントロールとの違いは認められなかった。
[IFN−γ、TNF−αのmRNA発現量]
図5、図6より、アルコール濃度0〜15vol%で培養して得られた菌体によるIFN−γ、TNF−αのmRNA発現量を検討した結果、IFN−γのmRNA発現量はアルコール濃度による違いは認められず、コントロールに対して40倍〜140倍と著しく増加した。同様にTNF−αのmRNA発現量も10倍〜20倍と著しく増加した。
図5、図6より、アルコール濃度0〜15vol%で培養して得られた菌体によるIFN−γ、TNF−αのmRNA発現量を検討した結果、IFN−γのmRNA発現量はアルコール濃度による違いは認められず、コントロールに対して40倍〜140倍と著しく増加した。同様にTNF−αのmRNA発現量も10倍〜20倍と著しく増加した。
この結果、ラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌(AP−1300株、AP−1301株)は、アルコール含有培地にて培養されることによって、免疫作用が増強された乳酸菌となった。
5.In vivo試験方法
(1)動物試験方法
Balb/c マウス(5週令,オス)を粉末飼料MF(オリエンタル酵母工業製)で
1週間の予備飼育後、AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与える群、粉末飼料にアルコール濃度0vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群、および粉末飼料にアルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群の3群に分け、それぞれ2週間飼育した。なお、AP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える2群については、菌体摂取量が1.0×109cfu/マウス/日となるようにそれぞれ菌体を配合した。各群のマウスは5匹とし、飼料と飲料水は自由摂取とした。また、飼育環境の条件は、室温23℃、12時間の明暗周期とした。
(1)動物試験方法
Balb/c マウス(5週令,オス)を粉末飼料MF(オリエンタル酵母工業製)で
1週間の予備飼育後、AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与える群、粉末飼料にアルコール濃度0vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群、および粉末飼料にアルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える群の3群に分け、それぞれ2週間飼育した。なお、AP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与える2群については、菌体摂取量が1.0×109cfu/マウス/日となるようにそれぞれ菌体を配合した。各群のマウスは5匹とし、飼料と飲料水は自由摂取とした。また、飼育環境の条件は、室温23℃、12時間の明暗周期とした。
(2)AP−1300株凍結乾燥菌体の経口摂取が脾臓細胞に及ぼす影響
AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物およびAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与えた動物よりそれぞれ無菌的に脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞は、ビオチン標識抗マウスCD49bモノクローナル抗体(clone DX5,Bio Legend)、ビオチン標識抗マウスCD11bモノクローナル抗体(clone M1/70,Bio Legend)、およびストレプトアビジン−PE/Cy5 (Bio Legend)を用いて標識した。細胞をビオチン標識した後、PE標識抗マウスIL−12モノクローナル抗体(clone C15.6、Bio Legend)、PE標識抗マウスIFN−γモノクローナル抗体(clone XMG1.2,Bio Legend)、PE標識抗マウスTNF−αモノクローナル抗体(clone MP6−XT22,Bio Legend)を用いて脾臓細胞内に産生されたサイトカインを標識した。ビオチン標識された細胞数およびPE標識されたサイトカインを含む細胞数は、フローサイトメーターGuava PCA(Guava Technologies)を用いて測定し、脾臓細胞に占めるサイトカイン生産細胞割合を算出した。
AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物およびAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を与えた動物よりそれぞれ無菌的に脾臓細胞を採取した。採取した脾臓細胞は、ビオチン標識抗マウスCD49bモノクローナル抗体(clone DX5,Bio Legend)、ビオチン標識抗マウスCD11bモノクローナル抗体(clone M1/70,Bio Legend)、およびストレプトアビジン−PE/Cy5 (Bio Legend)を用いて標識した。細胞をビオチン標識した後、PE標識抗マウスIL−12モノクローナル抗体(clone C15.6、Bio Legend)、PE標識抗マウスIFN−γモノクローナル抗体(clone XMG1.2,Bio Legend)、PE標識抗マウスTNF−αモノクローナル抗体(clone MP6−XT22,Bio Legend)を用いて脾臓細胞内に産生されたサイトカインを標識した。ビオチン標識された細胞数およびPE標識されたサイトカインを含む細胞数は、フローサイトメーターGuava PCA(Guava Technologies)を用いて測定し、脾臓細胞に占めるサイトカイン生産細胞割合を算出した。
(3)Yac−1細胞に対する傷害試験(NK活性試験)
東北大学加齢医学研究所より譲渡されたYac−1細胞(2×107cell)を、PKH−26 Red Fluorescent Cell Linker Kit(Sigma)用いて標識した。遠心分離により標識されたYac−1細胞を回収し、標識したYac−1浮遊液(5×104cell/mL)と脾臓細胞浮遊液を、脾臓細胞:Yac−1細胞=2:1になるよう24穴プレートに入れ、6時間培養した。細胞を回収し、7−aminoactinomycin D溶液を加えて死細胞を標識した。標識されたYac−1細胞数および二重染色されたYac−1死細胞数を、フローサイトメーターGuava PCA(Guava Technologies)を用いて測定し、標的細胞に占める死細胞の割合を算出した。
東北大学加齢医学研究所より譲渡されたYac−1細胞(2×107cell)を、PKH−26 Red Fluorescent Cell Linker Kit(Sigma)用いて標識した。遠心分離により標識されたYac−1細胞を回収し、標識したYac−1浮遊液(5×104cell/mL)と脾臓細胞浮遊液を、脾臓細胞:Yac−1細胞=2:1になるよう24穴プレートに入れ、6時間培養した。細胞を回収し、7−aminoactinomycin D溶液を加えて死細胞を標識した。標識されたYac−1細胞数および二重染色されたYac−1死細胞数を、フローサイトメーターGuava PCA(Guava Technologies)を用いて測定し、標的細胞に占める死細胞の割合を算出した。
(4)In vivo試験結果
(a)脾臓細胞に占めるサイトカイン産生細胞割合
図7、8、9より、アルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を投与した動物より採取したCD11b+細胞のIL−12産生細胞割合は、AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物より採取したCD11b+細胞のIL−12産生細胞割合よりも有意に増加した。同様にCD49b+細胞のIFN−γ産生細胞割合は増加傾向を示し、TNF−α産生細胞割合は有意に増加した。
(a)脾臓細胞に占めるサイトカイン産生細胞割合
図7、8、9より、アルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を投与した動物より採取したCD11b+細胞のIL−12産生細胞割合は、AP−1300株凍結乾燥菌体を含まない飼料を与えた動物より採取したCD11b+細胞のIL−12産生細胞割合よりも有意に増加した。同様にCD49b+細胞のIFN−γ産生細胞割合は増加傾向を示し、TNF−α産生細胞割合は有意に増加した。
(b)NK細胞活性
Yac−1死細胞割合は、マウス脾臓細胞のYac−1に対する細胞傷害性を表している。図10より、アルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を投与した動物より採取した脾臓細胞のNK活性は有意に上昇した。
Yac−1死細胞割合は、マウス脾臓細胞のYac−1に対する細胞傷害性を表している。図10より、アルコール濃度10vol%で培養したAP−1300株凍結乾燥菌体を添加した飼料を投与した動物より採取した脾臓細胞のNK活性は有意に上昇した。
(5)まとめ
動物試験に於けるサイトカイン産生細胞割合とNK活性の結果は、in vitro試験で認められた結果を裏付けるように、アルコール含有培地で培養したラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌において優れた免疫増強作用が認められた。
動物試験に於けるサイトカイン産生細胞割合とNK活性の結果は、in vitro試験で認められた結果を裏付けるように、アルコール含有培地で培養したラクトバチルス・フルクチボランスに属する乳酸菌において優れた免疫増強作用が認められた。
[実施例2]乳酸菌含有組成物の製造
以下に示す製造例に基づいて乳酸菌含有組成物を製造した。
以下に示す製造例に基づいて乳酸菌含有組成物を製造した。
製造例1:乳酸菌を含有する医薬品
錠剤:
以下に示す方法により、乳酸菌を含有する医薬品(錠剤)を製造した。
AP−1300株菌体末100gを、乳糖200gおよびステアリン酸マグネシウム2gと共に混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径10mm、重量300mgの錠剤を製造した。
顆粒剤:
AP−1300株菌体末100gに、ステアリン酸マグネシウム2gを加え、圧縮、粉砕、製粒し、篩分して20〜50メッシュの顆粒剤を得た。
錠剤:
以下に示す方法により、乳酸菌を含有する医薬品(錠剤)を製造した。
AP−1300株菌体末100gを、乳糖200gおよびステアリン酸マグネシウム2gと共に混合し、単発式打錠機にて打錠することにより、直径10mm、重量300mgの錠剤を製造した。
顆粒剤:
AP−1300株菌体末100gに、ステアリン酸マグネシウム2gを加え、圧縮、粉砕、製粒し、篩分して20〜50メッシュの顆粒剤を得た。
製造例2:乳酸菌を含有する各種飲食物
表5に示す組成にて、乳酸菌入りの、各種飲食品を製造した。なお、乾燥菌体を配合するものについては、「乳酸菌菌体末」と表記した。
表5に示す組成にて、乳酸菌入りの、各種飲食品を製造した。なお、乾燥菌体を配合するものについては、「乳酸菌菌体末」と表記した。
製造例3:乳酸菌を含有する飲食物
表6に示す組成で蒸米に米麹、温水を加え、60℃で5時間保温して甘酒を造り、これに15容量%エタノールを加え、さらに、酸にてpH5.5に調整した後、AP−1300株をアルコール濃度10vol%のMKY培地で30℃、5日間培養した乳酸菌培養物を加え、他の微生物汚染を受けないように5日間熟成することにより、すっきりとした酸味を有するマッコリ風アルコール飲料を製造した。
表6に示す組成で蒸米に米麹、温水を加え、60℃で5時間保温して甘酒を造り、これに15容量%エタノールを加え、さらに、酸にてpH5.5に調整した後、AP−1300株をアルコール濃度10vol%のMKY培地で30℃、5日間培養した乳酸菌培養物を加え、他の微生物汚染を受けないように5日間熟成することにより、すっきりとした酸味を有するマッコリ風アルコール飲料を製造した。
製造例4:乳酸菌を含有する飼料
表7に示す組成にて、乳酸菌入りの飼料を製造した。
表7に示す組成にて、乳酸菌入りの飼料を製造した。
なお、いずれの製造例においても、AP−1300株の代わりにAP−1301株を用いてもよく、乳酸菌含有組成物の製造が可能である。
Claims (6)
- アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス(Lactobacillus fructivorans)に属する乳酸菌、NITE P−1300もしくはNITE P−1301であって、アルコール含有培地にて培養され、IL−12の産生誘導能、IFN−γの産生誘導能、およびTNF−αの産生誘導能を有することを特徴とする乳酸菌。
- 請求項1記載の乳酸菌を含有することを特徴とする免疫増強作用を有する組成物。
- 食品であることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 医薬品であることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- 飼料であることを特徴とする請求項2記載の組成物。
- アルコール耐性を有するラクトバチルス・フルクチボランス(Lactobacillus fructivorans)に属する乳酸菌、NITE P−1300もしくはNITE P−1301を、アルコールを5〜10vol%含有する培地にて培養することによって、IL−12の産生誘導能、IFN−γの産生誘導能およびTNF−αの産生誘導能を有する乳酸菌を製造することを特徴とする乳酸菌の培養方法。
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