CN106259893B - 乳酸复合菌及制备具辅助降压功能的番茄红素骆驼乳含片 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种乳酸复合菌及制备具辅助降压功能的番茄红素骆驼乳含片。选用由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌按照体积比2∶1:4：2:1:4:2:1:0.5混合发酵制备而成益生菌酸乳，通过分别发酵制备骆驼乳颗粒和番茄红素颗粒按照重量比1:1的比例制备获得双层片，将制备的薄膜包衣液对双层片进行包衣，吹热风温度30‑40℃，使双层片增重2‑3％，干燥固化即可制备获得番茄红素骆驼乳含片。制备的番茄红素骆驼乳含片含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，同时具有护肝的功能，具有广泛而适用的价值。

Description

乳酸复合菌及制备具辅助降压功能的番茄红素骆驼乳含片

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，具体地说，本发明涉及一种自行复配的乳酸菌群及在骆驼乳含片中应用的技术领域。

背景技术

在荒漠和半荒漠地区，驼乳占总乳源的37％，绵羊乳占35％，山羊乳占23％，牛乳仅占10％，因此驼乳成为这些地区的主要乳源之一。骆驼的乳汁中含有丰富的营养物质，它们的含量和结构优于其他动物乳类。驼乳中蛋白质含量约为2-5.5％，总蛋白含量与牛乳相似，酪蛋白的组成也和牛乳相差不大，但各组分所占比例不同于牛乳；大多数酪蛋白粒子的分布范围明显宽于牛乳酪蛋白粒子，且直径较大，驼乳的乳清蛋白含量较高，其中不含乳球蛋白或者含量很少。所以驼乳更适于人体代谢。

近年来，发酵乳制品的保健功能日益受到重视，对发酵乳中生物活性因子的研究较为活跃。目前已从乳蛋白中获得了多种生物活性肽，其中对具有降血压活性的血管紧张素转化酶(Angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽的研究得最多、最系统、最深入、潜在应用价值最高。

血管紧张素转化酶抑制肽(Angiotensin convertingenzyme inhibitory，ACEI)是血管紧张素转换酶的抑制剂，对降低血压有积极的作用，因而研究开发具有ACEI活性的药物和功能食品引起人们的关注，而血管紧张素转化酶(Angiotensin convertingenzyme，ACE)。ACE抑制肽对降低血压有积极的作用，因而研究开发具有ACE抑制活性的药物和功能食品引起人们的关注。研究表明，从牛乳蛋白质和发酵乳制品中可以提取获得乳源降血压肽。目前发酵乳制品的降血压作用已经成为国内外的研究热点，乳酸菌的降血压作用在于其能够代谢产生蛋白酶，从而降解蛋白质，产生ACEI活性肽。而抑制肽活性与所使用的乳酸菌的种类密切相关。不同乳酸菌发酵过程中的代谢产物具有多样性，蛋白水解产物也不相同，发酵乳制品的ACEI活性亦有区别。因此，筛选高产ACE1活性的益生菌是开发降血益生菌发酵乳的基础。将降血压肽和益生菌结合生产功能性发酵乳是乳酸菌制品发展的方向之一，具有较广阔的前景。

食源性的降压活性物质对正常血压不起作用，而对高血压病人其降压效果也较温和，能起到很好的预防和治疗效果。发酵乳品含有丰富的乳酸菌群，千百年来的消费习惯证实了这些菌群的安全性和可靠性。国外大量的科研工作发现了益生乳酸菌具有ACE抑制作用，并且在大量的体内和体外实验中都证实了这一益生功能。欧美和日本市场上已经有了类似的具有降低高血压的益生乳酸菌制品。但在国内在这方面的研究很少，相关的益生菌制品更少。

新疆地域辽阔，自然环境和气候差异很大，而且各少数民族制备传统发酵乳制品所采用的原料、工艺等方面的也各不相同，使得新疆乳酸菌资源的生物多样性和基因多样性是其他国家与地区所没有的。

自古以来，骆驼是沙漠地区游牧民族的重要交通运输工具，而驼乳是生活在荒漠和半荒漠地区牧民的重要奶食品来源。据报道驼乳含有丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素和人体必需的矿物质元素，其营养价值仅次于人乳，高于马奶、山羊奶、绵羊奶和牛奶。人们在长期饮用驼乳的实践中发现，发酵驼乳对肺结核病、胃肠道疾病、肾病和心血管疾病等有一定辅助治疗作用。

驼乳除了含有与牛乳相似的营养成分外，还含有较高的生物活性成分，如驼乳中含有大量的诸如溶菌酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等抗微生物因子，在机体抗病机制方面起着重要作用。自然发酵驼乳的营养成分更高，其蛋白质和脂肪含量均高于鲜驼乳，是人体补充蛋白和必需脂肪酸的良好食品。它不但保留鲜乳的一切营养素，而且发酵生成的乳酸使蛋白质结成微细的凝乳，从而提高消化吸收率。而且在某些乳酸菌的发酵过程中能合成维生素C，因此自然发酵驼乳的维生素C含量也高于鲜驼乳。

驼乳不仅含有很高的营养成分，还有许多生理活性物质(溶菌酶、过氧化物酶、乳铁蛋白和免疫球蛋白等)，他们存在于乳清蛋白当中，这些保护性蛋白可以用来解释驼乳为什么在炎热的夏天可以保存几天不腐败；如果能适当激活这些活性成分将非常利于乳的贮藏，还能起到杀菌和预防各种疾病的作用。

沙漠地区的牧民们一般会在驼乳新鲜时直接饮用，也有人会在驼乳自然发酵后食用。当新鲜驼乳或自然发酵后的驼乳不能饮用完时，为了保证驼乳不被气候影响而使驼乳品质变坏，就需要对其进行必要的加工。

经过文献查新结果表明，目前对于骆驼乳的加工研究主要是骆驼乳的营养价值、发酵驼乳的加工、驼乳奶油的制作、驼乳干酪的制作水，而对于将番茄红素和发酵驼乳进行加工制备含片的研究在国内外研究报道还不多见。

发明内容

针对现有技术中未见有关将番茄红素和采用具有显著降胆固醇率高的活性复合菌发酵驼乳进行加工制备含片报道，本发明旨在提供乳酸复合菌及制备具辅助降压功能的番茄红素骆驼乳含片，采用复合菌具有高产ACEI活性的益生菌，制备的番茄红素骆驼乳含片含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能，具有广泛而适用的价值。

本发明采用的主要技术方案：

通过选用干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌九种组成的优良益生乳酸菌群，这六种菌种尽管都是多年从新疆不同地区、不同民族的传统发酵酸奶中丰富乳酸菌群为来源，分离、筛选、驯化，从中筛选出具有显著ACE抑制活性菌株，通过不断优选，从新疆传统发酵酸奶及其制品中筛选得到，同时进行了胆固醇降解率、蛋白质水解能力、耐酸和耐胆盐能力的研究，选用的菌株耐酸性好，耐受肠胃环境。具有显著降胆固醇率高的活性菌株，同时进行了胆固醇降解率、蛋白质水解能力、耐酸和耐胆盐能力的研究，具有明显的辅助降压功能得技术效果，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能，具有广泛而适用的价值。

本发明具体提供一种制备番茄红素骆驼乳含片的乳酸复合菌，乳酸复合菌由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌按照体积比2∶1:4：2:1:4:2:1:0.5混合发酵制备而成益生菌酸乳，ACE抑制率为57％，获得质地细腻、口感柔和的益生菌酸奶产品，制备的益生菌酸乳具有显著的辅助降压功能。

进一步，本发明提供发酵骆驼乳颗粒的制备方法，具体方法步骤如下：

(1)原料选择与预处理：采用合格无抗生素的优质鲜骆驼乳为原料，并用四层纱布进行过滤。

(2)杀菌：将步骤(1)预处理的骆驼乳经过超高压物料灭菌。

(3)菌种的活化：选用乳酸复合菌由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌分别进行活化和扩大培养，按照体积比2∶1:4：2:1:4:2:1:0.5混合使得液体培养基中菌种的数目达到10⁵个/ml，制备获得复合发酵剂。

(4)发酵：将步骤(3)制备获得的复合发酵剂接种到步骤(2)中制备的骆驼乳中，并加入1％的CaCl₂进行发酵，使乳的酸度达到0.2％时停止发酵，其中发酵剂的添加量为0.006％，发酵温度30℃，CaCl₂的添加量为0.006％。

(5)添加凝乳酶：添加凝乳酶并搅拌4-5min，静置凝乳，搅拌，制备获得骆发酵驼乳，其中凝乳酶添加量为0.24g/l。

(6)真空冷冻干燥：将步骤(4)制备的发酵骆驼乳进行真空冷冻干燥，并进行粉碎，制备获得发酵骆驼乳冻干粉，其中真空冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度20Pa，真空干燥时间为10小时。

(7)制粒：将步骤(5)制备获得的发酵骆驼乳冻干粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的发酵骆驼乳颗粒。

进一步，本发明提供番茄红素颗粒的制备方法，具体制备方法如下：

(1)原料的预处理：挑选成熟、无虫蚀的番茄，清洗、去蒂，切块、打浆，利用离心的方法去除水分获得番茄酱，其中离心的转速为3000r/min、时间15min。

(2)冷冻干燥：将步骤(1)制备获得的番茄酱在－20℃的冰箱中预冻12h，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为冷冻的温度为-50℃，真空度为0.081Mpa，干燥时间24h，制备获得冻干番茄酱。

(3)冻干番茄粉的制备：将步骤(2)中制备的冻干番茄酱进行超微粉碎，制备获得冻干番茄粉。

(4)番茄红素提取：利用超声辅助法提取番茄红素，超声提取的条件是液料比41:1mL/g、超声温度55℃、超声功率18W/g，超声处理时间15min，其中所选用的溶剂是2％二氯甲烷的石油醚。

(5)粉碎：将步骤(4)提取获得的番茄红素进行真空冷冻干燥，将冷冻干燥后的冻干番茄红素粉碎至150目，获得冻干番茄红素粉。

(6)制粒：将步骤(5)制备获得的番茄红素粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的番茄红素颗粒。

本发明提供番茄红素骆驼乳含片的制备方法，具体制备方法步骤如下：

(1)混合：将上述制备的番茄红素颗粒和骆驼乳干酪颗粒按照1:1的比例分别装入分层压片机的两个不同料斗中进行压片，制备获得双层片。

(2)透明薄膜包衣的制备：按重量份数，取薄膜包衣剂0.5-1份，分散于2-3份无水乙醇中，完全溶解后，加入6.0-7.5份蒸馏水，配制成质量浓度为5-10％的薄膜包衣液，其中薄膜包衣剂的材料选自Opardy II、Opardy I、Opardy amb和Opardy XY中的一种或多种。

(3)含片的制备：用步骤(2)制备的薄膜包衣液对步骤(1)制备的双层片进行包衣，吹热风温度30-40℃，使双层片增重2-3％，干燥固化即可制备获得番茄红素骆驼乳含片。

本发明制备的番茄红素骆驼乳含片一面为红色，一面为乳白色的双层含片，制备的骆驼乳产品不仅保留了骆驼乳和番茄红素的主要营养成分,含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能。

本发明通过由体外模拟肠胃实验及ACE抑制率的测定结果，本申请采用的干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌组成的复合菌制备的益生菌酸乳ACE抑制率高，后期用来发酵产酸乳进行SHR大鼠血压的体内功能性实验。结合分子鉴定及降胆固醇、体外模拟肠胃实验结果来看，我们确定了复合菌混合发酵产生的发酵产物来进行后期应用尾动脉间接测压法进行发酵产物对SHR大鼠血压的体内功能性实验。

通过生理生化特性和分子水平鉴定，以及采用市场同类菌种的对比试验可知，本发明采用的干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌都为常见菌种，本领域公众可以通过公众渠道购买获得。

通过实施本发明具体的发明内容，可以达到以下有益效果:

(1)本发明提供的番茄红素骆驼乳含片中，番茄红素的提取率为87％，在提取过程中不使用成分复杂的试剂，得到的最终产品相对于现有技术方法纯度高，纯度为95％；且在蒸馏浓缩过程中回收到的有机溶剂可反复使用，相对于传统方法降低了生产成本。

(2)本发明提供的益生菌酸乳在番茄红素骆驼乳含片中的应用，制备的番茄红素骆驼乳含片口味酸甜细滑、营养成分有较大提高，其中蛋白质有20％左右被水解成为小的分子，发酵骆驼乳中的脂肪酸的含量增加2倍，营养素的利用率得以提高，保留了骆驼乳的全部营养成分，制备的番茄红素骆驼乳含片含有大量的高产ACEI活性的益生菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能，具有广泛而适用的价值。

(3)本发明提供的番茄红素骆驼乳含片具有护肝的功能，正常肝组织肝小叶结构正常，肝索呈放射状排列整齐，肝细胞完整，胞浆着色均匀，细胞核清晰，中央静脉及汇管区清晰可见。给予CCl₄后，肝组织严重损伤，肝细胞呈点状或小灶性坏死，肝细胞内的ALT和骆驼乳中的营养成分对对CCl₄诱导小鼠肝损伤具有保护作用。

(4)本发明制备的番茄红素骆驼乳含片一面为红色，一面为乳白色的双层含片，制备的骆驼乳产品不仅保留了骆驼乳和番茄红素的主要营养成分,含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能。

附图说明

图1显示为选用九种乳酸菌的胆固醇降解率(％)和ACE抑制率(％)的比较图。

图2显示为氯化钙添加量对凝乳时间的影响图。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。

本发明中设备和材料主要有：

PL601-S型电子天平、DL-1型电子万用炉、北京赛多利斯分析天平、HH-S型水浴锅、紫外可见分光光度计、YX280B手提式不锈钢蒸汽消毒器、GXZ-2AOA型智能光照培养箱、BCD-249CF型美菱牌冰箱、苏净集团安泰公司超净工作台、1000ul及200ul、10ul规格的移液枪、EPS-2A200型核酸电泳仪、C100S型PCR仪、Neofug 13R型台式高速冷冻离心机、DZF-6020型真空干燥箱、B3200型超声波仪、佳尼牌CR125-A-N型宜饮水机、DZF-6020型真空干燥箱、pHS-25型pH计。

本发明采用的干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌都为常见菌种，本领域公众可以通过公众渠道购买获得。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

实施例一：

本发明提供发酵骆驼乳颗粒的具体方法步骤如下：

(1)原料选择与预处理：采用合格无抗生素的优质鲜骆驼乳为原料，并用四层纱布进行过滤。

(2)杀菌：将步骤(1)预处理的骆驼乳经过超高压物料灭菌。

(3)菌种的活化：选用乳酸复合菌由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌分别进行活化和扩大培养，按照体积比2∶1:4：2:1:4:2:1:0.5混合使得液体培养基中菌种的数目达到10⁵个/ml，制备获得复合发酵剂。

(4)发酵：将步骤(3)制备获得的复合发酵剂接种到步骤(2)中制备的骆驼乳中，并加入1％的CaCl₂进行发酵，使乳的酸度达到0.2％时停止发酵，其中发酵剂的添加量为0.006％，发酵温度30℃，CaCl₂的添加量为0.006％。

(5)添加凝乳酶：添加凝乳酶并搅拌4-5min，静置凝乳，搅拌，制备获得骆发酵驼乳，其中凝乳酶添加量为0.24g/l。

(6)真空冷冻干燥：将步骤(4)制备的发酵骆驼乳进行真空冷冻干燥，并进行粉碎，制备获得发酵骆驼乳冻干粉，其中真空冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度20Pa，真空干燥时间为10小时。

(7)制粒：将步骤(5)制备获得的发酵骆驼乳冻干粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的发酵骆驼乳颗粒。

实施例二：

本发明提供番茄红素颗粒的具体制备方法如下：

(1)原料的预处理：挑选成熟、无虫蚀的番茄，清洗、去蒂，切块、打浆，利用离心的方法去除水分获得番茄酱，其中离心的转速为3000r/min、时间15min。

(2)冷冻干燥：将步骤(1)制备获得的番茄酱在－20℃的冰箱中预冻12h，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为冷冻的温度为-50℃，真空度为0.081Mpa，干燥时间24h，制备获得冻干番茄酱。

(3)冻干番茄粉的制备：将步骤(2)中制备的冻干番茄酱进行超微粉碎，制备获得冻干番茄粉。

(4)番茄红素提取：利用超声辅助法提取番茄红素，超声提取的条件是液料比41:1mL/g、超声温度55℃、超声功率18W/g，超声处理时间15min，其中所选用的溶剂是2％二氯甲烷的石油醚。

(5)粉碎：将步骤(4)提取获得的番茄红素进行真空冷冻干燥，将冷冻干燥后的冻干番茄红素粉碎至150目，获得冻干番茄红素粉。

(6)制粒：将步骤(5)制备获得的番茄红素粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的番茄红素颗粒。

实施例三：

本发明提供番茄红素骆驼乳含片的具体制备方法步骤如下：

(1)混合：将上述制备的番茄红素颗粒和骆驼乳干酪颗粒按照1:1的比例分别装入分层压片机的两个不同料斗中进行压片，制备获得双层片。

(2)透明薄膜包衣的制备：按重量份数，取薄膜包衣剂0.5-1份，分散于2-3份无水乙醇中，完全溶解后，加入6.0-7.5份蒸馏水，配制成质量浓度为5-10％的薄膜包衣液，其中薄膜包衣剂的材料选自Opardy II、Opardy I、Opardy amb 和Opardy XY中的一种或多种。

(3)含片的制备：用步骤(2)制备的薄膜包衣液对步骤(1)制备的双层片进行包衣，吹热风温度30-40℃，使双层片增重2-3％，干燥固化即可制备获得番茄红素骆驼乳含片。

本发明制备的番茄红素骆驼乳含片一面为红色，一面为乳白色的双层含片，制备的骆驼乳产品不仅保留了骆驼乳和番茄红素的主要营养成分,含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能。

本发明通过由体外模拟肠胃实验及ACE抑制率的测定结果，本申请采用的干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌组成的复合菌制备的益生菌酸乳ACE抑制率高，后期用来发酵产酸乳进行SHR大鼠血压的体内功能性实验。结合分子鉴定及降胆固醇、体外模拟肠胃实验结果来看，我们确定了复合菌混合发酵产生的发酵产物来进行后期应用尾动脉间接测压法进行发酵产物对SHR大鼠血压的体内功能性实验。

实施例四：番茄红素颗粒的制备

番茄红素颗粒的具体制备方法：

(1)原料的预处理：挑选成熟、无虫蚀的番茄，清洗、去蒂，切块、打浆，利用离心的方法去除水分获得番茄酱，其中离心的转速为3000r/min、时间15min。

(2)冷冻干燥：将步骤(1)制备获得的番茄酱在－20℃的冰箱中预冻12h，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为冷冻的温度为-50℃，真空度为0.081Mpa，干燥时间24h，制备获得冻干番茄酱。

(3)冻干番茄粉的制备：将步骤(2)中制备的冻干番茄酱进行超微粉碎，制备获得冻干番茄粉。

(4)番茄红素提取：利用超声辅助法提取番茄红素，超声提取的条件是液料比41:1mL/g、超声温度55℃、超声功率18W/g，超声处理时间15min，其中所选用的溶剂是2％二氯甲烷的石油醚。

(5)粉碎：将步骤(4)提取获得的番茄红素进行真空冷冻干燥，将冷冻干燥后的冻干番茄红素粉碎至150目，获得冻干番茄红素粉。

(6)制粒：将步骤(5)制备获得的番茄红素粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的番茄红素颗粒。

本发明利用超声波提取技术提取番茄红素，超声的作用加了快提取过程渗透溶解和扩散的速度，缩短了提取时间；提取过程无须加热，适用于番茄红素热敏物质；同时，本发明采用真空冷冻干燥技术对番茄红素进行干燥，能够最大程度的保留番茄红素中的活性成分，保证活性成分不受到破坏。

同时，由于严格控制提取番茄红素时超声的条件，因此能够充分将番茄中的番茄红素提取出来，本发明提供提取番茄红素的方法的提取率为87％；在提取过程中不使用成分复杂的试剂，得到的最终产品相对于现有技术方法纯度高，纯度为95％；且在蒸馏浓缩过程中回收到的有机溶剂可反复使用，相对于传统方法降低了生产成本。

实施例五:发酵骆驼乳颗粒的制备

(1)原料选择与预处理：采用合格无抗生素的优质鲜骆驼乳为原料，并用四层纱布进行过滤。

(2)杀菌：将步骤(1)预处理的骆驼乳在50℃条件下进行超高压灭菌，并降温到30℃。

(3)菌种的活化：选用乳酸复合菌由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌分别进行活化和扩大培养，按照体积比2∶1:4：2:1:4:2:1:0.5混合使得液体培养基中菌种的数目达到10⁵个/ml，制备获得复合发酵剂。

(4)发酵：将步骤(3)制备获得的发酵剂接种到步骤(2)中制备的骆驼乳中，并加入1％的CaCl₂进行发酵，使乳的酸度达到0.2％时停止发酵，其中发酵剂的添加量为0.006％，发酵温度30℃，CaCl₂的添加量为0.006％。

(4)添加凝乳酶：添加凝乳酶并搅拌4-5min，静置凝乳，搅拌，制备获得骆发酵驼乳，其中凝乳酶添加量为0.24g/l。

(5)真空冷冻干燥：将步骤(4)制备的发酵骆驼乳进行真空冷冻干燥，并进行粉碎，制备获得发酵骆驼乳冻干粉，其中真空冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度20Pa，真空干燥时间为10小时。

(6)制粒：将步骤(5)制备获得的发酵骆驼乳冻干粉进行干法制粒，筛取得到1－3mm粒径的发酵骆驼乳颗粒。

发酵剂最主要的功能是将乳中的乳糖转化为乳酸。乳酸不仅能使pH降低；也能使不溶性的钙盐转变为可溶性的钙盐，形成凝块应有的硬度和质地。发酵剂的另一功能是抑制一些未被杀死的细菌或后污染细菌的生长。这些细菌有的需要乳糖，有的不耐酸，从而受到抑制。为了使干酪在成熟期间能获得预期的效果，达到正常的成熟，发酵剂的添加量应加以控制，使其在干酪中缓慢生长，产生后阶段需要的乳酸。

同时，制备的发酵骆驼乳口味酸甜细滑、营养成分有较大提高，其中蛋白质有20％左右被水解成为小的分子，发酵骆驼乳中的脂肪酸的含量增加2倍，营养素的利用率得以提高，保留了骆驼乳的全部营养成分，发酵骆驼乳颗粒还产生人体营养所必须的多种维生素，如VB1、VB2、VB6、VB12等。

实施例六:骆驼乳含片的制备

(1)混合：将上述实施例二、四制备的番茄红素颗粒和实施例一、五制备的骆驼乳干酪颗粒按照1:1的比例分别装入分层压片机的两个不同料斗中进行压片，制备获得双层片。

(2)透明薄膜包衣的制备：按重量份数，取薄膜包衣剂0.5-1份，分散于2-3份无水乙醇中，完全溶解后，加入6.0-7.5份蒸馏水，配制成质量浓度为5-10％的薄膜包衣液，其中薄膜包衣剂的材料选自Opardy II、Opardy I、Opardy amb和Opardy XY中的一种或多种。

(3)含片的制备：用步骤(2)制备的薄膜包衣液对步骤(1)制备的双层片进行包衣，吹热风温度30-40℃，使双层片增重2-3％，干燥固化即可制备获得含片。

经上述制备的番茄红素骆驼乳含片一面为红色，一面为乳白色的双层含片，制备的骆驼乳产品不仅保留了骆驼乳和番茄红素的主要营养成分,含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口,风味独特,食用方便，同时具有护肝的功能。

实施例七:制备发酵骆驼乳颗粒的实验研究

实验过程

1、发酵剂添加量的确定

驼乳进行超高压灭菌，其中发酵温度35℃，凝乳酶的添加量是0.2g/L；CaCl₂的添加量是0.1g/L的条件下，分别添加不同剂量的发酵剂(0.002、0.004、0.006、0.008、0.010％)进行发酵，结合发酵剂不同添加量下的发酵时间和凝乳状态，确定发酵剂最佳添加量。

2、CaCl₂添加量的确定

驼乳进行超高压灭菌，其中发酵温度35℃，发酵剂添加量是0.006％，凝乳酶的添加量是0.2g/l的条件下，测定在不同CaCl₂添加量(0.06、0.08、0.1、0.12、0.14g/L)条件下凝乳酶的凝乳时间和凝乳状态，确定CaCl₂的最佳添加量。

3、凝乳酶添加量的确定

驼乳进行超高压灭菌，其中发酵温度35℃，发酵剂添加量是0.006％，CaCl₂添加量是0.1％的条件下，分别添加不同剂量的凝乳酶(0.16、0.2、0.24、0.28、0.32g/L),测定凝乳时间及凝乳状态，确定凝乳酶的最佳添加量。

4、正交试验

结合单因素试验结果，以发酵剂、CaCl₂、凝乳酶为因素，采用L9(3³)正交试验，以出品率结合感官得分为指标，筛选最佳工艺条件，因素水平如表1。

表1：正交试验因素水平表

实验结果

1、发酵剂添加量的确定

发酵剂添加量为0.002％时，驼乳凝乳差；随发酵剂添加量的增大，发酵速度加快，产生乳酸增多，凝乳时间随之缩短；发酵剂添加量为0.06g/L时，凝乳风味较好，且浓厚相宜。

2、CaCl₂添加量的确定

当CaCl₂添加量在0.01～0.05(g/L)之间时，凝乳时间总体上看随CaCl₂添加量的增大而缩短，其中CaCl₂添加量为0.03g/L时，驼乳凝乳时间较短，此时凝乳酶活力较高，参见附图1，这是由于钙离子通过与酪蛋白结合而减弱胶束表面电荷，导致静电排斥力变小，促进酪蛋白的凝聚。CaCl₂添加量为0.05g/L时，凝乳酶活力也较高，但与0.03g/L相比，差异不显著。

3、CaCl₂添加量的确定

在相同的凝乳时间内，随着氯化钙添加量的增加凝乳质地越来越好。但当它的添加量不足时凝乳速度变慢；当钙的添加量过多、凝乳快，质地硬，甚至还有苦味产生。结合凝乳时间对凝乳质地的影响，以0.03％的添加量较为适中。

结论

综上所述,综合考虑，得出驼乳发酵加工工艺的最优条件为凝乳温度35℃、CaCl₂添加量0.03g/L。发酵剂的添加量为0.006％，验证实验制得的发酵驼乳的质地细腻，硬度适宜，感官较好。

实施例八:番茄红素骆驼乳含片对化学性肝损伤保护作用的实验研究

(1)实验方法

实验动物选择SPF级健康成年雄性小鼠50只，体重18-22g，实验设3个组，本发明实施例五制备的乳酸菌的含片组、空白对照组和模型对照组。用CC1₄(分析纯)造成肝损伤模型，小鼠CCl₄灌胃浓度为1％，以食用植物油稀释，灌胃量0.05ml/10g。

(2)实验步骤

实验动物每日经口灌胃给予设定剂量受试样品，空白对照组和模型对照组给予蒸馏水。将动物每周称重2次，以调整受试样品剂量。于实验第30天将各组动物隔夜禁食16h，模型组及样品组1次灌胃给予CC1₄空白对照组给植物油，受试组继续给予受试样品至实验结束(与CC1₄灌胃间隔4h以上)。给予CC1₄后24h处死动物，取血，以3 000r/min离心15min，取上清液测定血清中的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的含量。

肝脏病理组织学检查:取小鼠肝脏左叶用10％甲醛固定，从肝左叶中部做横切面取材，常规病理制片，石蜡包埋，苏木素-伊红(HE)染色，在光学显微镜下对小鼠肝脏病理改变和损伤程度进行分级评分。

(3)实验结果

骆驼乳对小鼠体重的影响：样品剂量组与对照组相比，体重变化均无统计学意义。

骆驼乳对CCl₄所致急性化学性肝损伤小鼠血清转氨酶的影响与空白对照组比较，模型组小鼠血清ALT和AST水平显著升高(P＜0.01)，说明模型建立成功；与模型组比较，骆驼乳中和高剂量均能显著降低肝损伤小鼠血清中的ALT和AST含量(P＜0.01)，结果见表2。

表2：骆驼乳对CCl 4致急性化学性肝损伤小鼠血清ALT和AST活性的影响(x±s)

组别	ALT(IU/L－1)	AST(IU/L－1)
			空白对照组	53.52±11.95*	94.54±7.67*
本发明番茄红素骆驼乳含片组	2410.42±1048.23	910.07±635.84
			高剂量组	182.04±106.64*	218.03±129.41*

注:与模型组比较，*P＜0.01；n＝10。

骆驼乳肝脏病理组织学评分结果：模型组肝脏组织学病理评分高于空白对照组，差异具有统计学意义(P＜0.01)证明模型建立成功。驼乳剂量组肝脏组织学病理评分与模型组比降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)，见表3。

表3：骆驼乳含片肝脏病理组织学评分结果(x±s)

病理组织学检查

取小鼠肝组织常规制片，HE染色，光学显微镜检查。空白对照组肝小叶结构正常，肝细胞形态正常，肝细胞核清晰，着色均匀，未出现肝细胞坏死、变性、肿胀及其他异常改变。模型组动物肝细胞每视野下可见多处大片坏死，肝小叶结构紊乱，胞核大小不一，形态异常，可见大量细胞核浓缩和破碎。本发明制备的番茄红素骆驼乳含片组肝小叶基本完整，肝细胞核形态基本接近正常，胞浆染色较均匀，未见明显肝细胞坏死、变性。

实验结果表明：正常肝组织肝小叶结构正常，肝索呈放射状排列整齐，肝细胞完整，胞浆着色均匀，细胞核清晰，中央静脉及汇管区清晰可见。给予CCl₄后，肝组织严重损伤，肝细胞呈点状或小灶性坏死，肝细胞内的ALT和骆驼乳中的营养成分与其对CCl₄诱导小鼠肝损伤的保护作用有密切联系

实施例九：乳酸菌ACE抑制活性的测定

选用干酪乳杆菌的代号为KS-3-a、屎肠球菌的代号为KS-4-d、保加利亚乳杆菌的代号为KS-5-b、嗜热链球菌的代号为HT-b、鼠李糖乳杆菌的代号为HT-e、嗜酸乳杆菌的代号为HT-f、植物乳杆菌的代号为ALT-1-a、双乙酰链球菌的代号为ALT-2和双歧乳杆菌的代号为ALT-2-c。

ACE抑制活性的测定

ACE抑制率的测定采用Cushman和Cheung的方法，紫外分光光度计测定228nm处的OD值。

ACE的抑制率(％)＝[(B-A)/(B-C)]*100％

A：含发酵乳乳清和ACE溶液的吸光度

B:不含发酵乳乳清，但含ACE溶液的吸光度

C：蒸馏水，不含ACE溶液的吸光度

ACE抑制活性的测定方法：通过制备发酵乳上清液80ul，将250ul的马尿酸溶液和80ul的乳清混合，37℃，静置5min，加入20ul ACE溶液(活力0.1u/ml)，37℃，静置30min，加入250ul 1mol/l的盐酸终止反应，加1.7ml乙酸乙酯，振荡混匀15s,静止15min，吸取1ml乙酸乙酯，90-100℃烘干，加一定量的灭菌蒸馏水，228nm处测吸光度。

将选用的九种乳酸菌用10％的脱脂乳在37℃的条件下，培养20h。如此，反复活化3次。对乳酸菌ACE抑制活性的测定，是在发酵培养时乳酸菌生长的对数期和稳定期的前一时段(大约在5h-15h之间)。每隔两小时测一次乳酸菌ACE抑制活性。

发酵乳清的制备

10％的脱脂乳分装在试管中，在90℃下灭菌15min。杀菌后冷却到37℃，无菌条件下，以4％的量接种乳酸菌菌种，37℃恒温培养24h。如此在10％的脱脂乳上将乳酸菌菌种活化3代。活化后的乳酸菌以4％接种量接种到10％的脱脂乳中，37℃恒温发酵培养。分别取发酵5h，7h，9h，11h，13h，15h后样品2mL,8000r/min,4℃，离心15min。收集上清液，再用5mol/L的NaOH溶液将pH值调节到8.3，8000r/min,4℃，离心15min。收集上清液，测定ACE抑制率。

ACE抑制率的测定方法

ACE抑制率的测定是利用Cushman和Cheung的方法。根据实验要求，实验方法稍作改动。具体方法如下：

10mL试管中加入250μL的5mmol马尿酸溶液(用0.3mol/L NaOH的0.1mol/L硼酸盐缓冲液pH8.3，将马尿酸固体配成5mmol马尿酸溶液)和80μL的发酵乳上清液，在37℃下放置5min。再加入20μL的ACE溶液(0.1U/mL)，在37℃反应30min。之后加入250μL的1mol/L的HCl溶液终止反应。再加入1.7mL的乙酸乙酯，15s充分振荡混匀，静置10min。用移液管吸取1mL的乙酸乙酯，在真空干燥箱中90-100℃干燥30min左右。加入一定量的蒸馏水，混匀。用紫外分光光度计在228nm处测其吸光度(实验重复3次)。

ACE抑制率的计算：

A：含发酵乳乳清和ACE溶液的吸光度

B：不含发酵乳乳清样品，但含有ACE溶液的吸光度

C：蒸馏水，不含ACE溶液的吸光度(空白对照)

测定结果如下：

在对上述9株乳酸菌用10％的脱脂乳连续发酵20h，分别在1h，3h，5h，7h，9h，11h，13h，15h，17h，19h测其ACE抑制率。发现,各菌株的ACE抑制率随发酵时间的延长不断变化，其变化趋势是ACE抑制率先是由低逐渐升高，到达一定值后又逐渐下降。而且所测乳酸菌ACE抑制活性最好时，大都出现在发酵培养了7h-13h之间。因此，在后两次的ACE抑制活性测定中，选择了5h-15h发酵培养的时间段。

胆固醇降解率的测定：用硫酸铁铵方法测定，紫外分光光度计测定560nm处的OD值。(2ml无水乙醇和2ml硫酸铁铵显色液作为空白对照调零)

降解率(％)＝[(B-A)/B]*100％

A:含乳酸菌的MRS胆固醇发酵液在560nm处的吸光值。

B：不含乳酸菌的MRS胆固醇发酵液在560nm处的吸光值

胆固醇降解率的测定方法：制备乳酸菌发酵液，，4％的量接种在MRS胆固醇液体培养基上，37℃，培养48h，吸取一定量乳酸菌用无水乙醇稀释10倍，4℃，4000r/min，15min离心，吸取上清夜2ml，沿壁缓慢加入2ml硫酸铁铵显色液，振荡混匀，冷却20min，30min内在560nm处测其吸光度。

由附图1可以说明，乳酸菌的胆固醇降解率与ACE抑制率不是成正比关系的。3株KS菌和3株ALT菌明显表现出菌种的ACE抑制率较高，而胆固醇降解率相对较低。从3株HT菌可以看出，菌种的胆固醇降解率较高，而ACE抑制率相对偏低。综上可见，本发明提供的番茄红素骆驼乳含片具有显著降胆固醇率高的活性，采用复合菌具有高产ACEI活性的益生菌，制备的番茄红素骆驼乳含片含有大量的益生菌乳酸菌，能够改善人体的肠道菌群，改善人体的消化功能，且口感细腻、爽口，风味独特，食用方便，同时具有护肝的功能，具有广泛而适用的价值。

表4：选用九种乳酸菌的ACE抑制率(％)、蛋白质水解能力关系

菌株	ACE抑制率(％)	胆固醇降解率(％)	蛋白质水解能力A<sub>140</sub>
				KS-3-a	71.21	44.75	0.365
KS-4-d	55.44	39.67	0.412
				KS-5-b	69.18	33.89	0.364
HT-b	48.33	56.92	0.402
				HT-e	50.18	62.80	0.492
HT-f	52.91	48.96	0.473
				ALT-1-a	61.70	27.56	0.305
ALT-2	55.05	34.96	0.385
				ALT-2-b	71.43	29.13	0.390

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

Claims (1)

1.一种番茄红素骆驼乳含片，其特征在于，具体制备方法步骤如下：

(1)混合：选用制备的番茄红素颗粒和骆驼乳干酪颗粒按照1:1的比例分别装入分层压片机的两个不同料斗中进行压片，制备获得双层片；

(2)透明薄膜包衣的制备：按重量份数，取薄膜包衣剂0.5-1份，分散于2-3份无水乙醇中，完全溶解后，加入6.0-7.5份蒸馏水，配制成质量浓度为5-10％的薄膜包衣液，其中薄膜包衣剂的材料选自Opardy II、Opardy I、Opardy amb和Opardy XY中的一种或多种；

(3)含片的制备：用步骤(2)制备的薄膜包衣液对步骤(1)制备的双层片进行包衣，吹热风温度30-40℃，使双层片增重2-3％，干燥固化即可制备获得番茄红素骆驼乳含片；

所述的骆驼乳干酪颗粒制备方法步骤如下：

(1)原料选择与预处理：采用合格无抗生素的优质鲜骆驼乳为原料，并用四层纱布进行过滤；

(2)杀菌：将上述步骤(1)预处理的骆驼乳经过超高压物料灭菌；

(3)菌种的活化：选用乳酸复合菌由干酪乳杆菌、屎肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、双乙酰链球菌和双歧乳杆菌分别进行活化和扩大培养，按照体积比2:1:4:2:1:4:2:1:0.5混合使得液体培养基中菌种的数目达到10⁵个/ml，制备获得复合发酵剂；

(4)发酵：将上述步骤(3)制备获得的复合发酵剂接种到上述步骤(2)中制备的骆驼乳中，并加入1％的CaCl₂进行发酵，使乳的酸度达到0.2％时停止发酵，其中发酵剂的添加量为0.006％，发酵温度30℃，CaCl₂的添加量为0.006％；

(5)添加凝乳酶：添加凝乳酶并搅拌4-5min，静置凝乳，搅拌，制备获得骆发酵驼乳，其中凝乳酶添加量为0.24g/l；

(6)真空冷冻干燥：将上述步骤(4)制备的发酵骆驼乳进行真空冷冻干燥，并进行粉碎，制备获得发酵骆驼乳冻干粉，其中真空冷冻干燥的条件为温度-50℃，真空度20Pa，真空干燥时间为10小时；

(7)制粒：将上述步骤(5)制备获得的发酵骆驼乳冻干粉进行干法制粒，筛取得到1-3mm粒径的发酵骆驼乳颗粒；

所述的番茄红素颗粒制备方法如下：

(1)原料的预处理：挑选成熟、无虫蚀的番茄，清洗、去蒂，切块、打浆，利用离心的方法去除水分获得番茄酱，其中离心的转速为3000r/min、时间15min；

(2)冷冻干燥：将上述步骤(1)制备获得的番茄酱在-20℃的冰箱中预冻12h，进行真空冷冻干燥，真空冷冻干燥的条件为冷冻的温度为-50℃，真空度为0.081MPa，干燥时间24h，制备获得冻干番茄酱；

(3)冻干番茄粉的制备：将上述步骤(2)中制备的冻干番茄酱进行超微粉碎，制备获得冻干番茄粉；

(4)番茄红素提取：利用超声辅助法提取番茄红素，超声提取的条件是液料比41:1mL/g、超声温度55℃、超声功率18W/g，超声处理时间15min，其中所选用的溶剂是2％二氯甲烷的石油醚；

(5)粉碎：将上述步骤(4)提取获得的番茄红素进行真空冷冻干燥，将冷冻干燥后的冻干番茄红素粉碎至150目，获得冻干番茄红素粉；

(6)制粒：将上述步骤(5)制备获得的番茄红素粉进行干法制粒，筛取得到1-3mm粒径的番茄红素颗粒。

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