CN109022323A - 一种瑞士乳杆菌复合剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物复合制剂领域，提供一种瑞士乳杆菌复合剂，制备原料包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；蛋白酶解多肽的重量以干重计；瑞士乳杆菌复合剂中所含活菌数在1010cfu/g以上；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。本发明研究表明，瑞士乳杆菌和蛋白酶解多肽复配后，能够显著提高瑞士乳杆菌的降血压、增强免疫力及抗氧化作用。在制备过程中，蛋白酶解多肽还能够起到促进瑞士乳杆菌增殖以缩短发酵时间的作用以及冻干保护作用。

Description

一种瑞士乳杆菌复合剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物复合制剂领域，具体涉及一种瑞士乳杆菌复合剂及其制备方法和应用。
背景技术
瑞士乳杆菌是革兰氏阳性细菌中的一种，为益生菌，其呈长杆状，无鞭毛，无芽孢，菌落圆形，乳白色，边缘整齐，化能异养性，兼性厌氧，不液化明胶。瑞士乳杆菌因具有抗高血压，抑制肿瘤，降低胆固醇等功能，被广泛用于干酪、酸乳等发酵产品中。研究证实，益生菌的生理活性与活菌数量有着密切关系。然而瑞士乳杆菌只有在活菌数足够高的条件下才能有效发挥以上所述益生作用，如何得到生产成本低、活菌数高、品质稳定且保存期长的瑞士乳杆菌菌粉成为一大难题。
发明内容
本发明为了解决现有技术中瑞士乳杆菌制剂活菌数不够高、稳定性不足以及增强免疫等益生效果不显著的问题，提供了一种瑞士乳杆菌复合剂，其中的瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽存在协同作用，能够显著提高瑞士乳杆菌的益生效果。
为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种瑞士乳杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；
所述瑞士乳杆菌复合剂中所含活菌数在1010cfu/g以上；
所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。
优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。
优选的，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。
优选的，所述用于制备蛋白酶解多肽的蛋白选自大米、豌豆、鸡蛋清、苦瓜籽、大豆和核桃粕中的一种或多种。
本发明提供上述技术方案所述瑞士乳杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将瑞士乳杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养12～24h，得到二级种子液；
(3)将所述二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；
(4)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括8～15％脱脂乳粉、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠以及余量的水；
(5)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到瑞士乳杆菌复合剂。
优选的，所述步骤(1)和(2)中，所述种子培养基独立包括以下质量百分含量的组分：1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8。
优选的，步骤(3)所述含有蛋白酶解多肽的发酵培养基，按质量百分数计，包括包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。
优选的，步骤(4)中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比为1:0.01～0.10；所述乳化包埋时间为60～120min。
本发明还提供了一种食品、药品、保健品或发酵剂，包括前述技术方案所述瑞士乳杆菌复合剂和辅料。
优选的，所述食品、药品或保健品的形式包括片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：
本发明提供了一种瑞士乳杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；所述瑞士乳杆菌复合剂中所含活菌数在1010cfu/g以上；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。本发明研究表明，瑞士乳杆菌和蛋白酶解多肽复配后，二者在提高机体免疫力、降血压以及抗氧化方面存在协同增效作用。
本发明研究表明，当蛋白酶解多肽中的多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，并且含有天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上时，才具有与瑞士乳杆菌复配增效的作用，蛋白酶解多肽中不含有天冬氨酸、谷氨酸或者多肽含量不足、分布不足的不具备这一作用。
本发明还提供了一种瑞士乳杆菌复合剂的制备方法，瑞士乳杆菌经过两级种子培养基培养后得到二级培养液，将二级培养液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵培养，将高密度发酵培养得到的发酵液离心取沉淀得到菌泥，将菌泥与含有蛋白酶解多肽的冻干保护剂混合后乳化包埋、冷冻干燥，粉碎，即得瑞士乳杆菌复合剂。本发明通过离心的方式去除了发酵培养液，离心沉淀得到的菌泥主要含有瑞士乳杆菌。
在本发明中，发酵培养基中的蛋白酶解多肽起到刺激瑞士乳杆菌生长，进而缩短发酵时间；冻干保护剂中的蛋白酶解多肽还能够对瑞士乳杆菌起到保护作用，提高冷冻干燥后得到的活菌数、提高瑞士乳杆菌复合剂的稳定性。即，本发明采用乳化包埋以及冷冻干燥的方式能够有效提高瑞士乳杆菌复合剂的活菌数、延长保存时间。
本发明还提供了包括前述技术方案所述瑞士乳杆菌复合剂的食品、药品、保健品或发酵剂，所述的食品、药品或保健品具有降血压、增强免疫力及抗氧化的作用；所述发酵剂可以有效缩短发酵时间。试验表明，与单独施用瑞士乳杆菌或蛋白酶解多肽相比，本发明所述的瑞士乳杆菌复合剂在发挥降血压、增强免疫力及抗氧化等活性方面存在协同增效作用。
附图说明
图1为实施例4中不同给药后大鼠的收缩压变化图；
图2为实施例7中不同培养基对瑞士乳杆菌增殖的影响；
图3为实施例8中不同培养基对瑞士乳杆菌增殖的影响；
图4为实施例9中不同给药后大鼠的收缩压变化图。
具体实施方式
本发明提供了一种瑞士乳杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；
所述瑞士乳杆菌复合剂中所含活菌数在1010cfu/g以上；
所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。
本发明对所述瑞士乳杆菌的来源无特殊限定，采用本领域已知的瑞士乳杆菌即可，比如市售或自行分离均可。
在本发明中，所述蛋白酶解多肽中所含的天冬氨酸的质量百分数在1％以上、谷氨酸的质量分数在5％以上，则蛋白酶解多肽才具有与瑞士乳杆菌复配协同增效的作用。同时还需要满足多肽含量以及相对分子量分布的条件，具体的，本发明所述蛋白酶解多肽中的多肽含量在75～95％，更优选为80～90％；本发明所述蛋白酶解多肽在相对分子量1000Da以下的分布比例不低于80％，更优选为85～99％。
本发明所述的蛋白酶解多肽具有抗氧化、降低三高、抑制有害菌生长的作用，本发明所述蛋白酶解多肽与瑞士乳杆菌复配后能够提高瑞士乳杆菌的益生活性，在降血压、增强免疫力及抗氧化等方面具有显著的协同增效作用。
在本发明中，所述蛋白酶解多肽优选的选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种酶解的产物。本发明对于所述蛋白酶解的具体条件无特殊限定，只要能够获得符合本发明所述条件的蛋白酶解多肽即可。
在本发明中，所述蛋白酶解多肽的酶解原料优选的选自大米、豌豆、鸡蛋清、苦瓜籽、大豆和核桃粕中的一种或多种；进一步优选的，本发明所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种酶，蛋白酶解多肽是指以上述任意一种或多种蛋白酶酶解大米、豌豆、鸡蛋清、苦瓜籽、大豆和核桃粕中一种或多种后得到的酶解产物，具体的可以为符合所述蛋白酶解多肽条件的大米多肽、豌豆肽、蛋清肽、苦瓜肽、大豆肽以及核桃肽等。
本发明所述蛋白酶解多肽的重量以其干重计算，所述干重是指含水量在10％以下时的质量。本发明优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。所述蛋白酶解多肽干粉可以由蛋白酶解液干燥得到，本发明对具体干燥方法无特殊限定。
在本发明中，所述瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽的质量比优选为85～90:2～7，更优选为85～90:3～5。在本发明中，所述瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，瑞士乳杆菌的质量是指其菌体质量，所述瑞士乳杆菌中活菌数至少为1010cfu/g。
在本发明中，所述瑞士乳杆菌复合剂的有效活菌数更优选为5×1010cfu/g以上，更进一步优选为8×1010～2×1011cfu/g。
本发明提供的瑞士乳杆菌复合剂中的有效活菌数高，瑞士乳杆菌的益生活性强，具有显著的降血压、增强免疫力及抗氧化的作用。本发明提供的瑞士乳杆菌复合剂可以在-18℃的条件下保存24个月，有效活菌数不会发生显著改变，稳定性好，保质期更长。
本发明还提供了一种上述技术方案所述瑞士乳杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将瑞士乳杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养12～24h，得到二级种子液；
(3)将所述二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；
(4)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括8～15％脱脂乳粉、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠以及余量的水；
(5)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到瑞士乳杆菌复合剂。
本发明将瑞士乳杆菌菌种接种于种子培养基中活化，得到一级种子液；本发明对所述瑞士乳杆菌菌种的接种量无特殊限定，蘸取菌种接种至种子培养基即可。本发明制备一级种子液的目的主要是为了活化菌种。
本发明所述的种子培养基作用为培养、活化菌种，促进瑞士乳杆菌增殖，本发明对于所述种子培养基的组成没有特殊限定，优选的可以选择如下种子培养基：
按照质量分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值6.2～6.8；更优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％乳糖、1.2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、1.5～2％牛肉浸膏、0.5～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。
在本发明中，所述活化时间优选为14～20h，更优选为16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。
得到一级种子液后，本发明将一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下活化12～24h，得到二级种子液。本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同，在此不再赘述。
在本发明中，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为14～20h，更优选为15～18h。本发明将二级种子液进行厌氧发酵是为了进一步扩大瑞士乳杆菌的活菌数，为下一步高密度发酵做好准备。
得到二级种子液后，本发明将二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，所得发酵液离心取沉淀，得到菌泥。本发明采用高密度发酵方式能够显著提高菌体密度，同时降低生产设备的成本，满足提高比生产率、降低生产成本、加快产品商品化进程的竞争需求。
在本发明所述的发酵培养基中添加蛋白酶解多肽，能够显著提高瑞士乳杆菌的增殖，试验表明，添加了蛋白酶解多肽的发酵液在相同培养时间内瑞士乳杆菌活菌数为不添加蛋白酶解多肽的发酵液中瑞士乳杆菌活菌数的10～80倍。即，本发明所述蛋白酶解多肽在发酵培养基中起到促进瑞士乳杆菌增殖、缩短发酵培养时间的作用。
按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、1.2～2.6％乳糖、1.8～2.5％蛋白胨、1～2.5％酵母浸膏、1.5～2％牛肉浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。本发明提供的发酵培养基可适宜大规模工业化生产，满足高密度发酵时的微生物营养需求。
在本发明中，当发酵培养基中加入蛋白酶解多肽后，相对分子质量小的蛋白酶解多肽具有较高的溶解性和易消化吸收性能，这是蛋白酶解多肽发挥活性的前提条件，也是其优于普通蛋白质以及氨基酸的特性之一。蛋白酶解多肽在发酵培养基中能够为瑞士乳杆菌提供生长所必须的氨基酸，还能够作为氮源为微生物提供能源；蛋白酶解多肽可被瑞士乳杆菌直接利用，无需经过胞外蛋白酶酶解，能够直接有效地加快其生长进程；而且蛋白酶解多肽还能够提高益生菌的酸性环境下的耐受力，也能够促进瑞士乳杆菌的增殖，提高其活菌数。
在本发明中，所述高密度发酵至发酵液中的活菌数达到109cfu/mL以上时，即可停止发酵。本发明所述高密度发酵的发酵时间仅需6～12h，相对于一般的瑞士乳杆菌发酵时间有明显缩短。
同时，发酵培养基中加入蛋白酶解多肽，能够有效加快瑞士乳杆菌的生长周期，提高瑞士乳杆菌的活菌数，节省达到目标活菌数的时间，从而节约发酵成本。
在本发明中，所述二级种子液接入发酵培养基的接种量优选为1～5％(体积百分比)，更优选为3～4％(体积百分比)。
在本发明中，所述高密度发酵的发酵温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述高密度发酵时优选的伴随搅拌，所述搅拌速率优选为80～200r/min，更优选为100～120r/min。
在本发明中，对高密度发酵得到的发酵液进行离心是为了获得较为纯净的菌体。在本发明中，所述离心转速优选为6000～10000r/min，更优选为8000r/min。在本发明中，所述离心时间优选为10～30min，更优选为15min。
得到菌泥后，本发明将菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液。本发明将菌泥进行乳化包埋的目的在于保护瑞士乳杆菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对瑞士乳杆菌活菌数和活性的影响。
按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～15％脱脂乳粉、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠以及余量的水；更优选的包括10～13％脱脂乳粉、2.5～4％蛋白酶解多肽、2～4.5％海藻糖、1～2.5％谷氨酸钠以及余量的水。
在本发明中，冻干保护剂中的脱脂乳粉、海藻糖和谷氨酸钠起到乳化包埋作用；蛋白酶解多肽则一方面属于瑞士乳杆菌复合剂的有效成分，另一方面蛋白酶解多肽还能够起到冻干保护剂的作用，防止冷冻干燥对瑞士乳杆菌的损伤。
在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.01～0.10，更优选为1:0.012～0.09，进一步优选为1:0.02～0.06。在本发明提供的质量比下，冻干保护剂中的蛋白酶解多肽可有效发挥冻干保护作用。
在本发明中，所述乳化包埋的温度优选为18～25℃，更优选为19～22℃。本发明对所述乳化方式无特殊限定，采用本领域已知的乳化方式即可，比如搅拌乳化。
本发明优选的，所述乳化时间优选为60～120min，更优选为80～100min。本发明乳化包埋是将瑞士乳杆菌和蛋白酶解多肽包埋在脱脂乳等乳化包埋材料中，以增强其稳定性，也有利于保证最终产品的粒径均一。
得到乳化液后，本发明将乳化液冷冻干燥，再粉碎，得到瑞士乳杆菌复合剂。本发明进行冷冻干燥的目的是为了去除产品的多余水分，提高成品稳定性；同时，将蛋白酶解多肽与瑞士乳杆菌一同进行冷冻干燥有利于保持瑞士乳杆菌的活性，使成品所含有效活菌数更高，还能够提高蛋白酶解多肽的活性。
在本发明中，所述冷冻干燥优选为真空冷冻干燥。在本发明中，所述冷冻干燥还包括预冷冻。所述预冷冻的温度优选为-35～-5℃，更优选为-20℃；预冷冻时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。在本发明中，所述冷冻干燥时间优选为25～40h，更优选为30h。
在本发明中，所述冷冻干燥后的粉碎是为了分散产品，使成品的粒度均一、混合均匀。本发明优选的，所述粉碎粒径为5～20目。本发明制备得到的瑞士乳杆菌为粉状。
本发明提供了一种食品、药品、保健品或发酵剂，包括前述技术方案所述瑞士乳杆菌复合剂和辅料。
在本发明中，所述包括瑞士乳杆菌复合剂的食品、药品或保健品具有降血压、增强免疫力及抗氧化的作用，其中瑞士乳杆菌复合剂作为活性成分，能够提供降血压、增强免疫力及抗氧化的作用。
在本发明中，所述包括瑞士乳杆菌复合剂的发酵剂具有缩短发酵时间的作用，发酵效率更高，并能够为发酵物提供降血压、增强免疫力及抗氧化功效。
本发明优选的，所述瑞士乳杆菌复合剂在所述食品、药品、保健品或发酵剂中的含量为1～99％；更优选为30～50％。
在本发明中，所述药品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂或包衣剂。食品或保健品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。本发明优选的，将包括所述瑞士乳杆菌复合剂的食品制成休闲零食的各种形式。
本发明对于如何将瑞士乳杆菌复合剂制成相应食品、药品、保健品或发酵剂无特殊限定，采用本领域已知的制剂制备方法即可。本发明对所述食品、药品、保健品或发酵剂中的辅料无特殊限定，采用本领域熟知的食品辅料、药品辅料以及保健品辅料即可。
为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
按质量百分比计，种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.6％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.3；
按质量百分比计，发酵培养基：5％鸡蛋清蛋白酶解多肽(以干重计，0.15％鸡蛋清蛋白酶解多肽)、2％葡萄糖、1％乳糖、1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.5；
经检测，鸡蛋清蛋白酶解多肽中多肽含量为82％，相对分子量1000Da以下的分布比例为87％，天冬氨酸质量百分比为1.8％，谷氨酸的质量百分数为9.3％。按质量百分比计，冻干保护剂：10％的脱脂乳，5％的海藻糖，15％鸡蛋清酶解液，2％的谷氨酸钠和余量的水。
将市售的瑞士乳杆菌种到装有种子培养基的试管中活化，得到一级种子液，再将一级种子液按照3％的接种量转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为28～34℃，厌氧培养12h；将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为3％，培养条件为35℃，厌氧培养8h，待发酵液中菌体密度达到109cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌体，将菌体加入保护剂进行乳化包埋，乳化时间80min；将乳化液在-35℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，真空度为0.15mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎至10目，得到瑞士乳杆菌复合剂，所得瑞士乳杆菌复合剂的活菌数为1.05×1011cfu/g。
实施例2
按质量百分比计，种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.6％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5；
按质量百分比计，发酵培养基：6％大米蛋白酶解多肽(以干重计，0.18％大米蛋白酶解多肽)、2％葡萄糖、1％乳糖、1％蛋白胨、0.5％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.8；
经检测，大米蛋白酶解多肽中多肽含量为84％，相对分子量1000Da以下的分布比例为93％，天冬氨酸质量百分比为3.2％，谷氨酸的质量百分数为7.1％。按质量百分比计，冻干保护剂：10％的脱脂乳，5％的海藻糖，8％豌豆酶解液，2％谷氨酸钠和余量的水。
将瑞士乳杆菌接种到装有种子培养基的试管中活化，得到一级种子液，再将一级种子液按照4％的接种量转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为35～38℃，厌氧培养16h；将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％，培养条件为37℃，厌氧培养7h，待发酵液中菌体密度达到109cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌体，将菌体加入保护剂进行乳化包埋，乳化时间60min；将乳化液在-20℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，真空度为0.2mbar，；真空冷冻干燥后将其粉碎至20目，得到瑞士乳杆菌复合剂，所得瑞士乳杆菌复合剂的活菌数为1.96×1011cfu/g。
实施例3
将实施例2制备的瑞士乳杆菌复合剂5％、低聚果糖22％、赤藓糖醇25％、抗性糊精40％和大米蛋白酶解多肽8％进行混合，得到具有辅助降血压的复合益生菌制剂，有效活菌数为9.8×109cfu/g。
其中，采用的大米蛋白酶解多肽与实施例2相同。
实施例4
本次试验为了验证瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽之间在降血压方面的协同增效作用。
1.试验材料
试验动物：SHR(自发性高血压)雄性大鼠40只(北京维通利华实验动物中心提供)，体重180～220g
试验对象：以活菌数为1×1010cfu/g的市售瑞士乳杆菌菌粉和大米蛋白酶解多肽为样品，其中大米蛋白酶解多肽与实施例2相同。
基础饲料：购于斯贝福(北京)生物科技有限公司，商品名大小鼠维持饲料；
2.试验方法
购买的大鼠适应3d后按体重随机分组，每组10只。
A组：对照组，灌胃生理盐水1mL/d；
B组：对自发性高血压大鼠灌胃0.1g 1×1010cfu/g瑞士乳杆菌(1mL/d，0.1g1×1010cfu/g瑞士乳杆菌溶于1mL生理盐水)
C组：对自发性高血压大鼠灌胃0.5g大米蛋白酶解多肽(0.5g大米蛋白酶解多肽溶于1mL生理盐水)
D组：对自发性高血压大鼠灌胃0.05g 1×1010cfu/g瑞士乳杆菌和0.25g大米蛋白酶解多肽(1mL/d，0.05g 1×1010cfu/g溶于1mL生理盐水，再将0.25g大米蛋白酶解多肽溶解其中)。
采用尾动脉脉搏测压法。测压前，将SHR大鼠放入(40±1)℃电热加温箱内，预热10min，然后选择合适的固定器，固定于测压台上测压。在安静状态下，连续测收缩压3次，取平均值作为测压结果。适应性测压1W，待大鼠适应环境，血压稳定后，开始进行测试，每天灌胃1次，每次1mL，采用无创动脉血压计分别测定灌胃1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W后大鼠收缩压。
3.试验结果
不同组给药后的大鼠血压变化情况如图1所示，A组的收缩压在170mmhg上下浮动，A、C和D组给药后的自发性高血压大鼠的收缩压有不同程度的下降，说明瑞士乳杆菌和大米蛋白酶解多肽对大鼠血压的降低有一定作用；8周后D组较A、B、C组能显著降低自发性高血压大鼠收缩压(P<0.05)，表明瑞士乳杆菌与大米蛋白酶解多肽在降血压方面有协同作用，二者共同作用，降血压效果明显提升。表明本发明提供的瑞士乳杆菌复合剂对自发性高血压大鼠有显著降血压作用。
实施例5
本次试验为了验证瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽之间在增强免疫方面的协同增效作用。
1.试验材料：
试验动物：BALB/c健康雄性小鼠50只，体重18～22g。
试验对象：以活菌数为1×1010cfu/g的市售瑞士乳杆菌菌粉和鸡蛋清蛋白酶解多肽为样品。
所述鸡蛋清蛋白酶解多肽与实施例1相同。
基础饲料：购于斯贝福(北京)生物科技有限公司，商品名大小鼠维持饲料；
2.试验方法
2.1动物分组：按体重分为4组，分别为：
A：空白对照组，给予普通饲料自由进食，灌胃0.2ml生理盐水。
B：瑞士乳杆菌组，灌胃0.1g 1×1010cfu/g瑞士乳杆菌(0.2mL/d，0.1g1×1010cfu/g溶于0.2mL生理盐水)；
C：鸡蛋清蛋白酶解多肽组，灌胃0.1g鸡蛋清蛋白酶解多肽(0.1g鸡蛋清蛋白酶解多肽溶于0.2mL生理盐水)
D鸡蛋清蛋白酶解多肽+瑞士乳杆菌组：灌胃0.05g 1×1010cfu/g瑞士乳杆菌和0.05g鸡蛋清蛋白酶解多肽(1mL/d，0.05g 1×1010cfu/g溶于1mL生理盐水，再将0.05g鸡蛋清蛋白酶解多肽溶解其中)。
2.2指标测定：适应培养1W后，开始灌胃，灌胃4W后，摘眼球取血处死小鼠，收集小鼠血液和摘取胸腺和脾脏，测定小鼠免疫脏器指数，巨噬细胞吞噬活性，NK细胞活性和小鼠血清IgG含量
3.实验结果：
表2小鼠免疫脏器指数
胸腺指数 脾脏指数
A 2.08±0.32 3.13±0.24
B 2.68±0.21* 4.35±0.35*
C 2.35±0.18 3.62±0.15*
D 3.05±0.12* 5.66±0.28**
注：*表示与对照组相比P<0.05；**表示与对照组相比P<0.01
表3小鼠吞噬细胞和NK细胞活性
组别 巨噬细胞吞噬活性(％) NK细胞活性(％)
A 37.63±1.11 43.52±1.65
B 51.36±0.83* 51.51±1.84
C 42.14±1.05 48.66±2.36
D 65.62±1.32* 58.21±1.58*
注：*表示与空白对照组相比P<0.05；**表示与空白对照组相比P<0.01
表4小鼠血清IgG抗体和IgM抗体含量测定
IgG(mg/mL) IgM(mg/mL)
A 8.35±1.23 1.36±0.35
B 11.28±0.98* 2.03±0.53*
C 9.38±1.35 1.98±0.62*
D 13.55±1.88** 2.53±0.32*
如表2～4所示，B、C和D组的免疫器官指数、吞噬细胞吞噬活性、NK细胞活性以及血清中抗体IgG含量均高于A组，这表明瑞士乳杆菌和鸡蛋鸡蛋清蛋白酶解多肽都具有增强免疫力的作用；同时瑞士乳杆菌和鸡蛋鸡蛋清蛋白酶解多肽联合使用，效果要显著高于单独使用，说明瑞士乳杆菌和鸡蛋鸡蛋清蛋白酶解多肽有增强免疫力方面有协同作用。
可见，本发明将瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽复配后能够获得显著的提高免疫力作用。
实施例6
本次试验为了验证瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽之间在抗氧化方面的协同增效作用。
1、试验材料：
实验动物：SD雄性大鼠40只，180～220g；
试验对象：以瑞士乳杆菌和核桃粕蛋白酶解多肽为样品。
经检测，核桃粕酶解多肽中多肽含量为87％，相对分子量1000Da以下的分布比例为85％，天冬氨酸质量百分比为3.5％，谷氨酸质量百分比为10.7％。
种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.6％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5-6.8。
MRS肉汤：购于北京陆桥技术股份有限公司
2、试验方法
动物分组：按体重分为4组，分别为：
A组：空白对照组，灌胃生理盐水1mL/d；
B组：核桃肽肽组，灌胃0.2g核桃粕酶解多肽(0.2g核桃粕酶解多肽溶于1mL生理盐水)
C组：瑞士乳杆菌组，灌胃瑞士乳杆菌(1mL/d，0.1g 1×1010cfu/g溶于1mL生理盐水)
D组：灌胃瑞士乳杆菌和10％核桃粕蛋白酶解多肽组，灌胃0.05g1×1010cfu/g瑞士乳杆菌和0.1g核桃粕酶解多肽(1mL/d，0.05g 1×1010cfu/g溶于1mL生理盐水，再将0.1g核桃粕酶解多肽溶解其中)。
3、指标测定：大鼠适应生长1周后，开始灌胃，灌胃4周后，测定大鼠血清MDA，SOD及GSH-Px活性。
4、实验结果：
表5各组给药后的大鼠血清中抗氧化活性测定
MDA SOD GSH-Px
A 15.63±2.33 30.21±1.68 20.36±1.44
B 10.55±1.85* 41.39±1.34* 28.32±2.55*
C 12.24±0.95* 36.76±2.89 25.83±2.85
D 8.36±1.21* 53.62±1.54* 35.12±2.36*
注：*表示与空白对照组相比P<0.05；**表示与空白对照组相比P<0.01
如表5所示的体内抗氧化检测结果，B、C和D组的MDA显著降低，SOD及GSH-Px明显升高，即体内试验也证明瑞士乳杆菌和核桃粕蛋白酶解多肽具有抗氧化作用；D组的体内抗氧化性能显著优于其他三组，表明瑞士乳杆菌和核桃粕蛋白酶解多肽复配后在抗氧化功能方面具有协同作用。
综合实施例4～6可以看出，瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽复配后，在降血压、增强免疫力以及抗氧化方面存在显著的协同作用。
实施例7
本次试验为了验证蛋白酶解多肽能促进瑞士乳杆菌增殖，缩短发酵时间
1.试验材料
试验对象：以瑞士乳杆菌和大米蛋白酶解多肽为样品，采用的大米蛋白酶解多肽与实施例2相同。
种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.6％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5-6.8；
MRS肉汤：购于北京陆桥技术股份有限公司。
2.试验方法
将瑞士乳杆菌接种到装有种子培养基的试管中活化，得到一级种子液，将一级种子液按照3％的接种量分别接入MRS液体培养基(培养基A)和添加了质量分数0.5％大米蛋白酶解多肽的MRS液体培养基(培养基B)中，在37℃条件下恒温培养，分别于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进行活菌计数，绘制生长曲线。
3.试验结果
结果如图2所示，添加0.5％大米蛋白酶解多肽后的的MRS肉汤(培养基B)，瑞士乳杆菌活菌数显著高于MRS肉汤组(P<0.05)，同时缩短发酵至稳定期所需时间，说明大米肽能促进瑞士乳杆菌增殖，缩短发酵周期。
实施例8
本次试验为了验证蛋白酶解多肽能促进瑞士乳杆菌增殖，缩短发酵时间
1.试验材料
试验对象：以瑞士乳杆菌和鸡蛋清蛋白酶解多肽为样品，采用的鸡蛋清蛋白酶解多肽与实施例1相同。
种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.8％酵母浸膏、0.6％牛肉浸膏、0.6％无水乙酸钠、0.02％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5-6.8；
MRS肉汤：购于北京陆桥技术股份有限公司。
2.试验方法
将瑞士乳杆菌接种到装有种子培养基的试管中活化，得到一级种子液，将一级种子液按照3％的接种量分别接入MRS液体培养基(培养基A)和添加了质量分数0.5％鸡蛋清蛋白酶解多肽的MRS液体培养基(培养基B)中，在37℃条件下恒温培养，分别于0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h进行活菌计数，绘制生长曲线。
3.试验结果
如图3，添加0.5％鸡蛋清蛋白酶解多肽的MRS肉汤(培养基B)，瑞士乳杆菌活菌数显著高于MRS肉汤组(P<0.05)，同时缩短发酵至稳定期所需时间，说明鸡蛋清蛋白酶解多肽能促进瑞士乳杆菌增殖，缩短发酵周期。
实施例9
本次试验对含有本发明所述瑞士乳杆菌的益生菌复合制剂的功效进行验证
1.试验材料
试验动物：SHR雄性大鼠20只(北京维通利华实验动物中心提供)，健康雄性大鼠10只，体重180～220g；
试验对象：以实施例3制备的益生菌复合制剂和大米蛋白酶解多肽为样品，其中大米蛋白酶解多肽与实施例2相同。
基础饲料：购于斯贝福(北京)生物科技有限公司，商品名大小鼠维持饲料；
2.试验方法
2.1.降血压试验
适应3d后按体重随机分组，每组10只
A组：对照组，对健康大鼠灌胃生理盐水1mL/d
B组：模型组(SHR大鼠)：对SHR大鼠灌胃生理盐水1mL/d
C组：实验组，对SHR大鼠灌胃实施例3所述益生菌复合制剂(1mL/d，益生菌复合制剂溶于1mL生理盐水)。
2.2检测方法
采用尾动脉脉搏测压法。测压前，将SHR大鼠放入(40±1)℃电热加温箱内，预热10min，然后选择合适的固定器，固定于测压台上测压。在安静状态下，连续测收缩压3次，取平均值作为测压结果。适应性测压1W，待大鼠适应环境，血压稳定后，开始进行测试，每天灌胃1次，每次2mL，采用无创动脉血压计测定连续灌胃1W、2W、3W、4W、5W、6W、7W、8W。
3.试验结果
如图4所示，灌胃瑞士乳杆菌制剂后，自发性高血压大鼠(SHR)收缩压显著下降，6w后血压趋于稳定，说明含有本发明所述瑞士乳杆菌的益生菌复合制剂有辅助降血压作用。
实施例3中制备的复合益生菌制剂所含低聚果糖、赤藓糖等原料在复合益生菌剂中起到益生元和甜味剂的作用，抗性糊精作为填充剂使用，一般不具备降血压，增强免疫力及抗氧化等功效；所以，本发明提供的复合益生菌制剂中主要是由瑞士乳杆菌复合剂提供了降血压，增强免疫力及抗氧化等功效。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种瑞士乳杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；
所述瑞士乳杆菌复合剂中所含活菌数在1010cfu/g以上；
所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。
2.根据权利要求1所述的瑞士乳杆菌复合剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。
3.根据权利要求1或2所述的瑞士乳杆菌复合剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。
4.根据权利要求3所述的瑞士乳杆菌复合剂，其特征在于，所述用于制备蛋白酶解多肽的蛋白选自大米、豌豆、鸡蛋清、苦瓜籽、大豆和核桃粕中的一种或多种。
5.权利要求1～4任意一项所述瑞士乳杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将瑞士乳杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；
(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养12～24h，得到二级种子液；
(3)将所述二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；
(4)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；
按质量百分比计，所述冻干保护剂包括8～15％脱脂乳粉、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠以及余量的水；
(5)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到瑞士乳杆菌复合剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)和(2)中，所述种子培养基独立包括以下质量百分含量的组分：1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8。
7.根据权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述含有蛋白酶解多肽的发酵培养基，按质量百分数计，包括包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比为1:0.01～0.10；所述乳化包埋时间为60～120min。
9.一种食品、药品、保健品或发酵剂，其特征在于，包括权利要求1～4任意一项所述瑞士乳杆菌复合剂和辅料。
10.根据权利要求9所述的食品、药品、保健品或发酵剂，其特征在于，所述食品、药品或保健品的形式包括片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。
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