CN109929779B - 一种含有生物活性肽的益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂及其制备方法和应用，涉及益生菌复合制剂领域，所述益生菌制剂包括益生菌和蛋白酶解多肽，益生菌选自植物乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌，所述益生菌还可是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的组合；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上。本发明研究表明，益生菌和蛋白酶解多肽复配后，能够显著提高益生菌的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力等作用。

Description

一种含有生物活性肽的益生菌制剂及其制备方法和应用

本申请要求2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810975240.1、发明名称为“一种马乳酒样乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810973314.8、发明名称为“一种双歧杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810974468.9、发明名称为“一种植物乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810975215.3、发明名称为“一种干酪乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810975183.7、发明名称为“一种嗜酸乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810974456.6、发明名称为“一种瑞士乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810975222.3、发明名称为“一种鼠李糖乳杆菌复合剂及其制备方法和应用”；2018年8月24日提交中国专利局、申请号为201810973360.8、发明名称为“一种直投式发酵剂及其制备方法和应用”的上述八个中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及益生菌复合制剂领域，具体涉及一种含有生物活性肽的益生菌制剂及其制备方法和应用。

背景技术

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。益生菌包括乳酸菌、链球菌和双歧杆菌等微生物益生菌是一种被证实有增强免疫、抑制致病菌、降低血清胆固醇含量、预防心血管疾病等多种生理功能的有益微生物，在酸奶及果蔬汁发酵、功能性益生菌制剂等产品中得到广泛的应用。

然而益生菌只有在活菌数足够高的条件下才能发挥以上所述益生作用，如何得到生产成本低、活菌数高、品质稳定且保存期长的益生菌菌粉成为一大难题。

发明内容

本发明为了解决现有技术中益生菌制剂活菌数不够高、稳定性不足以及增强免疫等益生效果不显著的问题，提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂，其中的益生菌与蛋白酶解多肽存在协同作用，能够显著提高益生菌的益生效果。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂，包括益生菌和蛋白酶解多肽，按重量份计：

当所述益生菌为植物乳杆菌时，包括植物乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.5～6份；

当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，包括马乳酒样乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；

当所述益生菌为双歧杆菌时，包括双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；

当所述益生菌为干酪乳杆菌时，包括干酪乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；

当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，包括保加利亚乳杆菌127.5～270、嗜热链球菌85～90份和蛋白酶解多肽1.6～64.8份；

当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，包括鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～13.5份；

当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；

当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，包括嗜酸乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；

所述乳杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上；

所述蛋白酶解多肽的重量以干重计。

优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。

优选的，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。

优选的，所述用于制备蛋白酶解多肽的蛋白选自苦瓜籽蛋白、大米蛋白、玉米蛋白、小麦谷朊、鱼胶原蛋白、鸡蛋清粉、乳清蛋白粉、大豆蛋白、豌豆蛋白和核桃粕中的一种或多种。

本发明还提供了一种上述技术方案所述含有生物活性肽的益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将益生菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；

(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养，得到二级种子液；

当益生菌为植物乳杆菌时，厌氧培养时间为8～24h；当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，厌氧培养时间为24～48h；当所述益生菌为双歧杆菌时，厌氧培养时间为24～36h；当所述益生菌为干酪乳杆菌时，厌氧培养时间为10～24h；当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，厌氧培养的时间为8～24h；当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，厌氧培养的时间为8～20h；当所述益生菌为瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌时，厌氧培养的时间为12～24h；

(3)将所述二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；

(4)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；

(5)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到含有生物活性肽的益生菌制剂。

优选的，步骤(4)中，按重量百分比计：

当所述益生菌为植物乳杆菌时，所述冻干保护剂包括10～30％的脱脂乳粉和10～15％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌或双歧杆菌时，所述冻干保护剂包括8～20％的脱脂乳粉和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为干酪乳杆菌时，所述冻干保护剂包括8～20％的脱脂乳粉和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，所述冻干保护剂包括8～20％的脱脂乳粉和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，所述冻干保护剂包括5～10％的脱脂乳粉、1～3％海藻糖、2～8％糊精和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，所述冻干保护剂包括8～15％的脱脂乳粉、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水；

当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，所述冻干保护剂包括8～15％的脱脂乳粉、2～8％海藻糖、1～6％甘油、0.1～0.6％明胶和1.5～6％的蛋白酶解多肽和余量的水。

优选的，步骤(4)中，

所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比为1:0.0075～0.18；所述乳化包埋时间为15～120min。

本发明还提供了前述技术方案所述的益生菌制剂在制备食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。

优选的，所述食品、药品、保健品或发酵剂含有生物活性肽的益生菌制剂和辅料。

优选的，所述食品、药品或保健品的形式包括片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂，包括益生菌和蛋白酶解多肽，所述益生菌选自植物乳杆菌、马乳酒样乳杆菌、双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌中的任意一种，所述益生菌还可以是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的组合；所述含有生物活性肽的益生菌制剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上、谷氨酸的质量分数在5％以上；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计。本发明研究表明，本发明所述的几种益生菌和蛋白酶解多肽复配后，能够显著提高益生菌的抗氧化作用、调节肠道菌群以及提高免疫力等作用。

本发明研究表明，当蛋白酶解多肽中含有天冬氨酸的质量百分数在1％、谷氨酸的质量分数在5％以上时才具有与益生菌复配增效的作用，蛋白酶解多肽中不含有天冬氨酸、谷氨酸或者含量不足的不具备这一作用。

在本发明中，当蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da的多肽质量占比达到80％以上时才具有与本发明所述的益生菌复配后的协同增效作用。

本发明还提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂的制备方法，益生菌经过两级种子培养基培养后得到二级培养液，将二级培养液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵培养，将高密度发酵培养得到的发酵液离心取沉淀得到菌泥，将菌泥与含有蛋白酶解多肽的冻干保护剂混合后乳化包埋、冷冻干燥，粉碎，即得含有生物活性肽的益生菌制剂。在本发明中，发酵培养基中的蛋白酶解多肽起到刺激益生菌生长，进而缩短发酵时间。

在本发明的优选技术方案中，冻干保护剂中含有蛋白酶解多肽，冻干保护剂中的蛋白酶解多肽还能够对益生菌起到保护作用，提高冷冻干燥后得到的活菌数、提高含有生物活性肽的益生菌制剂的稳定性。即，本发明采用乳化包埋以及冷冻干燥的方式能够有效提高含有生物活性肽的益生菌制剂的活菌数、提高保存时间。

本发明还提供了一种前述技术方案所述含有生物活性肽的益生菌制剂在制备食品、药品、保健品或发酵剂的应用，所述的食品、药品或保健品具有抗氧化、调节肠道菌群、提高免疫力等作用；所述发酵剂相对于常规发酵剂可以有效缩短发酵时间。试验表明，与单独施用益生菌或蛋白酶解多肽相比，本发明所述的含有生物活性肽的益生菌制剂在发挥抗氧化、调节肠道菌群、提高免疫力等活性方面存在协同增效作用。

附图说明

图1为实施例5实验前后小鼠体内肠道菌群变化；其中，A.0和A.14分别代表空白组小鼠实验开始前和实验结束后的样本，B.0和B.14分别代表实验组小鼠实验开始前和实验结束后的样本；

图2为实施例7中，马乳酒样乳杆菌在不同发酵培养基中的有效活菌数。

具体实施方式

本发明提供了一种含有生物活性肽的益生菌制剂，包括益生菌和蛋白酶解多肽，按重量份计：当所述益生菌为植物乳杆菌时，包括植物乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.5～6份；当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，包括马乳酒样乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；当所述益生菌为双歧杆菌时，包括双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；当所述益生菌为干酪乳杆菌时，包括干酪乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，包括保加利亚乳杆菌127.5～270、嗜热链球菌85～90份和蛋白酶解多肽1.6～64.8份；当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，包括鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～13.5份；当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，包括嗜酸乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；所述益生菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽中所含的天冬氨酸1％以上、谷氨酸的质量分数在5％以上，则蛋白酶解多肽才具有与益生菌复配协同增效的作用。同时还需要满足多肽含量以及相对分子量分布的条件，具体的，本发明所述蛋白酶解多肽中的多肽含量在75～95％，更优选为80～90％；本发明所述蛋白酶解多肽在相对分子量1000Da以下的分布比例不低于80％，更优选为85～99％。

本发明所述的蛋白酶解多肽具有抗氧化、增强机体免疫功能、抑制有害菌生长的作用，本发明所述蛋白酶解多肽与本发明限定的益生菌按比例复配后能够提高益生菌各自的益生活性，在抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力等方面具有显著的协同增效作用。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽优选的选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种酶解的产物。本发明对于所述蛋白酶解的具体条件无特殊限定，只要能够获得符合本发明所述条件的蛋白酶解多肽即可。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽的酶解原料优选的选自苦瓜籽蛋白、大米蛋白、玉米蛋白、小麦谷朊、鱼胶原蛋白、鸡蛋清粉、乳清蛋白粉、大豆蛋白、豌豆蛋白和核桃粕中的一种或多种；进一步优选的，本发明所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种酶，酶解苦瓜籽蛋白、大米蛋白、玉米蛋白、小麦谷朊、鱼胶原蛋白、鸡蛋清粉、乳清蛋白粉、大豆蛋白、豌豆蛋白和核桃粕中一种或多种后得到的酶解产物，具体的可以为符合所述蛋白酶解多肽条件的苦瓜肽、核桃肽、豌豆肽以及大豆肽等。

本发明所述蛋白酶解多肽的重量以其干重计算，所述干重是指含水量在10％以下时的质量。本发明优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。所述蛋白酶解多肽干粉可以由蛋白酶解液干燥得到，本发明对具体干燥方法无特殊限定。

在本发明中，所述含有生物活性肽的益生菌制剂的有效活菌数更优选为2×10¹¹cfu/g以上，更进一步优选为3×10¹¹cfu/g～5×10¹¹cfu/g。

本发明提供的含有生物活性肽的益生菌制剂中的有效活菌数高，益生菌的益生活性与蛋白酶解多肽协同增效，具有显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力等作用。本发明提供的含有生物活性肽的益生菌制剂可以在-18℃的条件下保存24个月，有效活菌数不会发生显著改变，稳定性好，保质期更长。

在本发明中，当所述益生菌为植物乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括植物乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.5～6份；更优选的包括植物乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽2.5～2.7份。在本发明中，所述植物乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，植物乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的植物乳杆菌中活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，含有植物乳杆菌和蛋白酶解多肽的益生菌制剂中有效活菌数更优选为2×10¹¹cfu/g以上，更进一步优选为3×10¹¹cfu/g～5×10¹¹cfu/g。植物乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力的作用。在本发明中，当所述益生菌为植物乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以苦瓜籽、鸡蛋清粉、乳清蛋白粉、大豆蛋白粉、豌豆蛋白粉和核桃粕中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括马乳酒样乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；更优选的包括马乳酒样乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.275～8.1份；进一步优选的包括马乳酒样乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽3～6份。在本发明中，所述马乳酒样乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，马乳酒样乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的马乳酒样乳杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，含有马乳酒样乳杆菌与蛋白酶解多肽的微益生菌制剂的有效活菌数更优选为5×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为6×10¹⁰cfu/g～1×10¹¹cfu/g。马乳酒样乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力作用。在本发明中，当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以苦瓜籽、鸡蛋清、乳清、大豆蛋白、豌豆蛋白和核桃粕中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为双歧杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；更优选的包括双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.275～8.1份；进一步优选的包括双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽3～6份。在本发明中，所述双歧杆菌与蛋白酶解多肽复配时，双歧杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的双歧杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述双歧杆菌和蛋白酶解多肽组成的益生菌制剂中有效活菌数更优选为8×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为9×10¹⁰cfu/g～4×10¹¹cfu/g。双歧杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力作用。在本发明中，当所述益生菌为双歧杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以大豆、玉米、豌豆、小麦、鸡蛋清和鱼胶原蛋白中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为干酪乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌剂包括干酪乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～13.5份；更优选的包括干酪乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.275～6.75份；进一步优选的包括干酪乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽2～4份。在本发明中，所述干酪乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，干酪乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的干酪乳杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述干酪乳杆菌和蛋白酶解多肽组成的益生菌制剂中有效活菌数更优选为5×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为8×10¹⁰cfu/g～3×10¹¹cfu/g。干酪乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力作用。在本发明中，当所述益生菌为干酪乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以苦瓜籽、核桃粕、鸡蛋清、乳清蛋白粉、大豆、豌豆、玉米和大米中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括保加利亚乳杆菌127.5～270份、嗜热链球菌85～90份和蛋白酶解多肽1.6～64.8份。在本发明中，所述嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的质量比优选为1.5～3:1，更优选为2～2.5:1。在本发明中，所述保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌与蛋白酶解多肽复配时，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的质量是指其菌体质量，用于复配的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的活菌数独立的至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述益生菌制剂中保加利亚乳杆菌的活菌数优选的在1.5×10¹¹～3×10¹¹cfu/g，更优选为1.0×10¹¹～1.3×10¹¹cfu/g；嗜热链球菌的活菌数优选的在0.8×10¹¹～1.5×10¹¹cfu/g，更优选为1.8×10¹¹～2.5×10¹¹cfu/g，进一步优选为2×10¹¹～2.3×10¹¹cfu/g。保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂可作为直投式发酵剂，用于直投式发酵，有效活菌数高，发酵性能好，可有效缩短发酵制品的发酵时间、提高发酵制品的品质。本发明所述的直投式发酵剂的发酵性能提高包括产酸能力、风味、活菌数、后酸强度、发酵产品的稳定性和产品的质量等指标的提高。在本发明中，当所述益生菌为乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以豌豆、苦瓜籽、鸡蛋清、玉米、大豆和核桃粕中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～13.5份；更优选的包括鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.275～6.75份；进一步优选的包括鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽2～4份。在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，鼠李糖乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的鼠李糖乳杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述鼠李糖乳杆菌和蛋白酶解多肽组成的益生菌制剂中有效活菌数更优选为5×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为8×10¹⁰cfu/g～3×10¹¹cfu/g。鼠李糖乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力作用。在本发明中，当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以鸡蛋清、乳清蛋白粉、大豆、豌豆、玉米和大米中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；更优选的包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽2～7份；进一步优选的包括瑞士乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽3～5份。在本发明中，所述瑞士乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，瑞士乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的瑞士乳杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述瑞士乳杆菌和蛋白酶解多肽组成的益生菌制剂中有效活菌数更优选为5×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为8×10¹⁰cfu/g～2×10¹¹cfu/g。瑞士乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力作用。在本发明中，当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以大米、豌豆、鸡蛋清、苦瓜籽、大豆和核桃粕中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明中，当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，按重量份计，所述益生菌制剂包括嗜酸乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.2～8.1份；更优选的包括嗜酸乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽2～6份；进一步优选的包括嗜酸乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽3～5份。在本发明中，所述嗜酸乳杆菌与蛋白酶解多肽复配时，嗜酸乳杆菌的质量是指其菌体质量，用于复配的嗜酸乳杆菌的活菌数至少为10¹⁰cfu/g。在本发明中，所述嗜酸乳杆菌和蛋白酶解多肽组成的益生菌制剂中有效活菌数更优选为5×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为3×10¹⁰cfu/g～5×10¹¹cfu/g。嗜酸乳杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后得到的益生菌制剂具有更为显著的抗氧化、调节肠道菌群以及提高免疫力的作用。在本发明中，当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽优选的以豌豆、鸡蛋清、小麦谷朊、大豆和核桃粕中一种或多种为酶解原料制备得到的。

在本发明所述的益生菌制剂中，蛋白酶解多肽能够提高本发明限定的各益生菌的生物活性，包括但不限于抗氧化、调节肠道菌群、提高机体免疫力等作用，即所述蛋白酶解多肽与益生菌复配后能够提高益生菌自身具有的益生活性。

本发明还提供了一种上述技术方案所述含有生物活性肽的益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将益生菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；

(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养，得到二级种子液；

当益生菌为植物乳杆菌时，厌氧培养时间为8～24h；当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，厌氧培养时间为24～48h；当所述益生菌为双歧杆菌时，厌氧培养时间为24～36h；当所述益生菌为干酪乳杆菌时，厌氧培养时间为10～24h；当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，厌氧培养的时间为8～24h；当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，厌氧培养的时间为8～20h；当所述益生菌为瑞士乳杆菌或嗜酸乳杆菌时，厌氧培养的时间为12～24h；

(3)将所述二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；

(4)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；

(5)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到含有生物活性肽的益生菌制剂。

本发明将益生菌菌种接种于种子培养基中活化，得到一级种子液；本发明对所述益生菌菌种的接种量无特殊限定，蘸取菌种接种至种子培养基即可。本发明制备一级种子液的目的主要是为了活化菌种。

本发明所述的种子培养基作用为培养、活化菌种，促进益生菌增殖，本发明对于所述种子培养基的组成没有特殊限定，优选的可以选择如下种子培养基：

当所述益生菌为植物乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值6.2～6.8；优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、1.5～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为12～24h，更优选为16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，按照质量百分数计，本发明所述种子培养基优选的包括2～5％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8；优选的包括：3～4％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.7～0.9％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为24～48h，更优选为28～36h；所述活化温度优选为25～35℃，更优选为30～34℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为双歧杆菌时，按照质量百分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8；优选的包括：1.5～2.5％乳糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.7～0.9％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为24～36h，更优选为28～32h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为32～38℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为干酪乳杆菌时，按照质量百分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8；优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.7～0.9％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为8～20h，更优选为12～16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌分别接种到不同的种子培养基中进行活化，分别得到保加利亚乳杆菌一级发酵液和嗜热链球菌一级发酵液。本发明优选的，所述保加利亚乳杆菌的种子培养基优选为MRS肉汤培养基，所述嗜热链球菌的种子培养基优选为M17液体培养基。MRS肉汤培养基以质量分数计包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、其余量为水。M17液体培养基以质量分数计包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的磷酸氢二钾、其余量为水。在本发明中，所述活化时间独立的优选为14～20h，更优选为16h；所述活化温度独立的优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，按照质量百分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～1.5％牛肉膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.08～0.15％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.6；优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.8～1.2％牛肉膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.1～0.13％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为14～20h，更优选为16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值6.2～6.8；更优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、2～2.5％乳糖、1.2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、1.5～2％牛肉浸膏、0.5～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为14～20h，更优选为16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值6.2～6.8；优选的包括：1.5～2.5％葡萄糖、1.5～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。在本发明中，所述活化时间优选为14～20h，更优选为16h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

得到一级种子液后，本发明将一级种子液接种至种子培养基中进行厌氧培养，得到二级种子液。本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同，在此不再赘述。本发明将二级种子液进行厌氧发酵是为了进一步扩大益生菌的活菌数，为下一步高密度发酵做好准备。

在本发明中，当所述益生菌为植物乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为8～24h，更优选为10～20h，进一步优选为15～18h。

在本发明中，当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～10％(体积百分数)，更优选为4～8％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为25～35℃，更优选为28～32℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为24～48h，更优选为28～35h，进一步优选为30～32h。

在本发明中，当所述益生菌为双歧杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～10％(体积百分数)，更优选为4～8％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为30～40℃，更优选为32～36℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为24～36h，更优选为28～32h。

在本发明中，当所述益生菌为干酪乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为10～24h，更优选为12～18h，进一步优选为14～16h。

在本发明中，当所述益生菌为保加利亚乳杆菌时，本发明将所述保加利亚乳杆菌一级种子液和嗜热链球菌一级种子液分别接种至种子培养基中厌氧培养8～24h，得到保加利亚乳杆菌二级种子液和嗜热链球菌二级种子液。在本发明中，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为8～24h，更优选为14～20h，进一步优选为15～18h。

在本发明中，当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为12～24h，更优选为14～18h，进一步优选为15～16h。

在本发明中，当所述益生菌为瑞士乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为12～24h，更优选为14～20h，进一步优选为15～18h。

在本发明中，当所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～8％(体积百分数)，更优选为4～6％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为28～40℃，更优选为32～37℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为12～24h，更优选为14～20h，进一步优选为15～18h。

得到二级种子液后，本发明将二级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，所得发酵液离心取沉淀，得到菌泥。本发明采用高密度发酵方式能够显著提高菌体密度，同时降低生产设备的成本，满足提高比生产率、降低生产成本、加快产品商品化进程的竞争需求。

在本发明所述的发酵培养基中添加蛋白酶解多肽，能够显著提高益生菌对酸性的耐受性、促进益生菌增殖，试验表明，添加了蛋白酶解多肽的发酵液在相同培养时间内益生菌活菌数为不添加蛋白酶解多肽的发酵液中益生菌活菌数的10～100倍。即，本发明所述蛋白酶解多肽在发酵培养基中起到促进益生菌增殖、提高益生菌酸性耐受性、缩短发酵培养时间的作用。

当所述益生菌为植物乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、1.5～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。

当所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、1.5～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为双歧杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括0.15～0.6％蛋白酶解多肽、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括0.2～0.45％蛋白酶解多肽、2.5～4％乳糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为干酪乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，得到保加利亚乳杆菌二级种子液和嗜热链球菌二级种子液后，本发明将所述保加利亚乳杆菌二级种子液和嗜热链球菌二级种子液分别接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到保加利亚乳杆菌菌泥和嗜热链球菌菌泥。按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％的蛋白酶解多肽，1～3％的葡萄糖，1～3％的蛋白胨，0.2～2％的酵母浸膏，0.1～0.8％无水乙酸钠，0.02～0.08％的七水硫酸镁，0.02～0.08％的一水硫酸锰，0.05～0.2％的吐温80和余量的水，pH值为6.2-7.0。更优选的包括2～4％的蛋白酶解多肽，1.5～2.5％的葡萄糖，1.5～2.5％的蛋白胨，0.5～1.5％的酵母浸膏，0.2～0.6％无水乙酸钠，0.04～0.06％的七水硫酸镁，0.03～0.06％的一水硫酸锰，0.08～0.15％的吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～2.5％酵母浸膏、0.3～0.8％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～6.8；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.5～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为瑞士乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、1.2～2.6％乳糖、1.8～2.5％蛋白胨、1～2.5％酵母浸膏、1.5～2％牛肉浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。

当本发明所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括1.5～6％蛋白酶解多肽、1～3％葡萄糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.5～3％牛肉浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括2～4.5％蛋白酶解多肽、1.5～2.5％葡萄糖、1.5～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.6％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.04～0.06％硫酸锰、0.06～0.08％吐温80和余量的水。本发明提供的发酵培养基可适宜大规模工业化生产，满足高密度发酵时的益生菌营养需求。

本发明提供的上述发酵培养基可适宜大规模工业化生产，满足高密度发酵时的益生菌营养需求。研究表明，当发酵培养基中加入蛋白酶解多肽后，相对分子质量小的蛋白酶解多肽具有较高的溶解性和易消化吸收性能，这是蛋白酶解多肽发挥活性的前提条件，也是其优于普通蛋白质以及氨基酸的特性之一。蛋白酶解多肽在发酵培养基中能够为益生菌提供生长所必须的氨基酸，还能够作为氮源为益生菌提供能源；蛋白酶解多肽可被益生菌直接利用，无需经过胞外蛋白酶酶解，能够直接有效地加快其生长进程；而且蛋白酶解多肽还能够提高益生菌的酸性环境下的耐受力，也能够促进益生菌的增殖，提高其活菌数。

在本发明中，所述高密度发酵至发酵液中的活菌数达到10⁹cfu/mL以上时，即可停止发酵。本发明所述高密度发酵的发酵时间仅需5～12h，相对于一般益生菌发酵的时间有明显缩短。

本发明通过对发酵培养基的优化，相对于常规的发酵培养基降低了价格较高的牛肉浸粉等培养基原料使用，能够有效地节约发酵成本。同时，发酵培养基中加入蛋白酶解多肽，能够有效加快益生菌的生长周期，提高益生菌的活菌数，节省达到目标活菌数的时间，从而节约发酵成本。

在本发明中，所述二级种子液接入发酵培养基的接种量优选为1～10％(体积百分比)，更优选为2～7％(体积百分比)。

在本发明中，所述高密度发酵的发酵温度优选为30～40℃，更优选为37℃。在本发明中，所述高密度发酵时优选的伴随搅拌，所述搅拌速率优选为80～200r/min，更优选为100～150r/min。

在本发明中，对高密度发酵得到的发酵液进行离心是为了获得较为纯净的菌体。在本发明中，所述离心转速优选为6000～12000r/min，更优选为8000r/min。在本发明中，所述离心时间优选为15～30min，更优选为20min。

得到菌泥后，本发明将菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液。本发明将菌泥进行乳化包埋的目的在于保护益生菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对益生菌活菌数和活性的影响。

当本发明所述益生菌为植物乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括10～30％的脱脂乳粉和10～15％的蛋白酶解多肽和余量的水；更优选的包括15～25％的脱脂乳粉和12～14％的蛋白酶解多肽和余量的水。

当本发明所述益生菌为马乳酒样乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～20％脱脂乳粉和1.5～6％蛋白酶解多肽和其余量的水；更优选的包括10～15％脱脂乳粉和2.5～4％蛋白酶解多肽和余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.01～0.10，更优选为1:0.012～0.09，进一步优选为1:0.02～0.06。

当本发明所述益生菌为双歧杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～20％脱脂乳粉和1.5～6％蛋白酶解多肽和其余量的水；更优选的包括10～15％脱脂乳粉和2.5～4％蛋白酶解多肽和余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.0075～0.15，更优选为1:0.010～0.10，进一步优选为1:0.015～0.08。

当本发明所述益生菌为干酪乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～15％脱脂乳粉和1.5～6％蛋白酶解多肽和其余量的水；更优选的包括10～12％脱脂乳粉和2.5～4％蛋白酶解多肽和余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.0075～0.15，更优选为1:0.010～0.10，进一步优选为1:0.015～0.08。

当本发明所述益生菌为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌时，按质量百分比计，所述冻干保护剂优选的包括9～12％脱脂乳粉和2～4％蛋白酶解多肽。在本发明中，蛋白酶解多肽还可作为直投式发酵剂的有效成分提高所述益生菌制剂作为发酵剂时的发酵效果。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.0075～0.15，更优选为1:0.010～0.10，进一步优选为1:0.015～0.08。

当本发明所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括5～10％脱脂乳粉、1～3％海藻糖、2～8％糊精和5～20％蛋白酶解多肽和其余量的水；更优选的包括6～8％脱脂乳粉、1.5～2.5％海藻糖、4～6％糊精和8～15％蛋白酶解多肽和余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.0075～0.15，更优选为1:0.08～0.12，进一步优选为1:0.9～0.10。

当本发明所述益生菌为瑞士乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～15％脱脂乳粉、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％海藻糖、0.5～4％谷氨酸钠以及余量的水；更优选的包括10～13％脱脂乳粉、2.5～4％蛋白酶解多肽、2～4.5％海藻糖、1～2.5％谷氨酸钠以及余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.01～0.10，更优选为1:0.012～0.09，进一步优选为1:0.02～0.06。

当本发明所述益生菌为嗜酸乳杆菌时，按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～15％脱脂乳粉、2～8％海藻酸钠、1.5～6％蛋白酶解多肽、1～6％甘油、0.1～0.6％明胶以及余量的水；更优选的包括10～12％脱脂乳粉、4～6％海藻酸钠、2～4％蛋白酶解多肽、2～4％甘油、0.2～0.5％明胶以及余量的水。在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.01～0.10，更优选为1:0.012～0.09，进一步优选为1:0.02～0.06。

在本发明中，冻干保护剂中的脱脂乳起到乳化包埋作用，蛋白酶解多肽则一方面属于含有生物活性肽的益生菌制剂的有效成分，另一方面蛋白酶解多肽还能够起到冻干保护剂的作用，防止冷冻干燥对益生菌的损伤。在本发明中，所述冻干保护剂中，优选的还可以包括脱脂乳粉、海藻糖、糊精、谷氨酸钠、葡聚糖、甘油和明胶等乳化包埋材料，用以增强乳化包埋效果。在本发明提供的质量比下，冻干保护剂中的蛋白酶解多肽可有效发挥冻干保护作用。

在本发明中，所述乳化包埋的温度优选为18～22℃，更优选为19～21℃。本发明对所述乳化方式无特殊限定，采用本领域已知的乳化方式即可，比如搅拌乳化。本发明优选的，所述乳化时间优选为20～50min，更优选为30～40min。本发明乳化包埋是将益生菌和蛋白酶解多肽包埋在脱脂乳等乳化包埋材料中，以增强其稳定性，也有利于保证最终产品的粒径均一。

得到乳化液后，本发明将乳化液冷冻干燥，再粉碎，得到含有生物活性肽的益生菌制剂。本发明进行冷冻干燥的目的是为了去除产品的多余水分，提高成品稳定性；同时，将蛋白酶解多肽与益生菌一同进行冷冻干燥有利于保持益生菌的活性，使成品所含有效活菌数更高，还能够提高蛋白酶解多肽的活性。

在本发明中，所述冷冻干燥优选为真空冷冻干燥。在本发明中，所述冷冻干燥还包括预冷冻。所述预冷冻的温度优选为-40～-35℃，更优选为-38℃；预冷冻时间优选为1..5～4h，更优选为2～3h。在本发明中，所述冷冻干燥时间优选为30～40h，更优选为36h。

在本发明中，所述冷冻干燥后的粉碎是为了分散产品，使成品的粒度均一、混合均匀。本发明优选的，所述粉碎粒径为5～20目。

本发明还提供了前述技术方案所述的益生菌制剂在制备食品、药品、保健品或发酵剂中的应用；所述食品、药品、保健品或发酵剂中优选的包括前述技术方案所述含有生物活性肽的益生菌制剂和辅料。

在本发明中，所述包括含有生物活性肽的益生菌制剂的食品、药品或保健品具有抗氧化、调节肠道菌群和/或提高免疫力等作用，其中含有生物活性肽的益生菌制剂作为活性成分，能够提供抗氧化、调节肠道菌群或提高免疫力的作用。

在本发明中，所述包括含有生物活性肽的益生菌制剂的发酵剂具有缩短发酵时间的作用，发酵效率更高，并能够为发酵物提供抗氧化、调节肠道菌群和/或提高免疫力功效。

本发明优选的，所述含有生物活性肽的益生菌制剂在所述食品、药品、保健品或发酵剂中的含量为1～99％；更优选为30～50％。

在本发明中，所述药品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂或包衣剂。食品或保健品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。本发明优选的，将包括所述含有生物活性肽的益生菌制剂的食品制成休闲零食的各种形式。

本发明对于如何将含有生物活性肽的益生菌制剂制成相应食品、药品、保健品或发酵剂无特殊限定，采用本领域已知的制剂制备方法即可。本发明对所述食品、药品、保健品或发酵剂中的辅料无特殊限定，采用本领域熟知的食品辅料、药品辅料以及保健品辅料即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1：

以质量分数计，种子培养基包括：乳糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，无水乙酸钠0.5％，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，吐温800.07％，其余量为水，pH值为6.2-6.8；以质量分数计，发酵培养基包括：10％的鸡蛋清蛋白酶解液(以干重计，3％鸡蛋清蛋白酶解多肽)，2％的乳糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温-80，其余量为水；pH值为6.6-7.0；以质量分数计，冻干保护剂包括：脱脂乳12％，鸡蛋清酶解液10％(以干重计，3％鸡蛋清蛋白酶解多肽)，其余量为水。经检测，鸡蛋清蛋白酶解多肽中多肽含量为82％，相对分子量1000Da的分布比例为87％，天冬氨酸的质量百分数为1.8％，谷氨酸的质量分数为9.3％。按质量百分比计，冻干保护剂：脱脂乳10％，鸡蛋清蛋白酶解液10％，其余量为水。

将长双歧杆菌接种于装有种子培养基的试管中，35℃、厌氧活化24h，得到一级种子液；按照体积比3％接种量，将一级种子液转接至种子培养基中，35℃厌氧培养24h，得到二级种子液；按照体积比3％接种量，将二级种子液接种到种子培养基中，34℃培养26h，得到三级种子液；将三级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，三级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％，培养条件为36℃，厌氧培养16h，待发酵液中菌体密度达到10⁹cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌泥。按照菌泥质量与冻干保护剂中蛋白酶解多肽的质量比1:0.0075的比例，将菌泥与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，乳化时间20min，得到乳化液。将乳化液在-30℃下预冷冻1.5h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，温度为-40℃，真空度为0.20mbar；真空冷冻干燥至含水量小于5％后将其粉碎至15目，得到含有生物活性肽的微生态制剂，所得含有生物活性肽的微生态制剂的活菌数为4.8×10¹¹cfu/g。

实施例2

按质量百分比计，种子培养基：2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.06％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值6.5～6.8；按质量百分比计，发酵培养基：12％鸡蛋清蛋白酶解液(以干重计，3.6％鸡蛋清蛋白酶解多肽)、2％葡萄糖、1％蛋白胨、0.5％酵母浸膏、0.5％无水乙酸钠、0.06％硫酸镁、0.02％硫酸锰、0.1％吐温80和余量的水，pH值为6.2；经检测，小麦蛋白酶解液中多肽含量为2.7％(以干重计，小麦蛋白酶解多肽中的多肽含量为90％)，相对分子量<1000Da的分布比例为91％，天冬氨酸含量为3.4％，谷氨酸含量为21.3％。按质量百分比计，冻干保护剂：脱脂乳10％，小麦蛋白酶解液10％，其余量为水。

将市售的微生物种到装有种子培养基的试管中活化，得到一级种子液，再将一级种子液按照2％的接种量转接至种子培养基中得到二级种子液，培养条件为28～30℃，厌氧培养10h；将二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，二级种子液接至发酵培养基中的接种量为3％，培养条件为35℃，厌氧培养12h，待发酵液中菌体密度达到10⁹cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌体，按照菌体与冻干保护剂中的苦瓜籽蛋白酶解多肽干粉的质量比1:0.02混合，进行乳化包埋，乳化时间20min；将乳化液在-40℃下预冷冻1.5h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，真空度为0.15mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎至10目，得到含有生物活性肽的微生态制剂，所得含有生物活性肽的微生态制剂的活菌数为2.9×10¹¹cfu/g。

实施例3：

将实施例1制备的含有生物活性肽的微生态制剂5％，低聚果糖10％，低聚木糖8％，赤藓糖醇35％，抗性糊精38％和鸡蛋清蛋白酶解多肽4％进行混合，得到具有增强免疫功能的复合益生菌制剂，有效活菌数为2.4×10¹⁰cfu/g。

其中，采用的鸡蛋清蛋白酶解多肽与实施例1相同。

实施例4：

1、试验材料：实验动物：SPF级BALB/c雌性小鼠50只，18～22g；试验对象：以植物乳杆菌和小麦蛋白酶解多肽为样品，其中小麦蛋白酶解多肽与实施例2采用的相同。

2、造模与分组

空白对照组：自由饮食自由进水，在实验开始前1～3天腹腔注射0.2mL生理盐水；

免疫抑制模型组：自由饮食自由进水，在实验开始前1～3天腹腔注射0.2mL浓度为80mg/mL环磷酰胺溶液。

将小鼠分组，并按照以下方式进行灌胃：

A空白对照组：对空白对照组小鼠继续灌胃0.2mL生理盐水；

B免疫抑制模型组：对免疫抑制模型小鼠继续灌胃0.2mL生理盐水；

C植物乳杆菌组：将0.1g、4×10¹¹cfu/g活菌数的植物乳杆菌溶于10mL生理盐水中，取0.2mL灌胃免疫抑制模型小鼠；

D小麦蛋白酶解多肽组：将0.2g小麦蛋白酶解多肽溶解于10mL生理盐水中，取0.2mL灌胃免疫抑制模型小鼠；

E鸡蛋清蛋白酶解多肽+植物乳杆菌组：将0.1g、4×10¹¹cfu/g活菌数的植物乳杆菌溶于5mL生理盐水中，得到植物乳杆菌溶液；将0.2g小麦蛋白酶解多肽溶解于5mL生理盐水中，得到小麦蛋白酶解多肽溶液；将植物乳杆菌溶液与鸡蛋清蛋白溶液混合得到灌胃溶液，取0.2mL灌胃溶液对小鼠进行灌胃。

3、指标测定：灌胃2周后，称重，摘眼球取血处死小鼠，收集小鼠血液和摘取胸腺和脾脏，测定小鼠免疫脏器指数和血清中相关细胞因子含量。

4、实验结果：

表1小鼠免疫脏器指数

注：*表示与模型组相比P<0.05；**表示与模型组相比P<0.01

表2小鼠血清中相关细胞因子含量

注：*表示与模型组相比P<0.05；**表示与模型组相比P<0.01

根据表1～2的记载可知，植物乳杆菌与小麦蛋白酶解多肽均具有提高小鼠机体免疫力的作用，而植物乳杆菌与小麦蛋白酶解多肽复配后存在显著的协同增效作用。可见，本发明将植物乳杆菌与小麦蛋白酶解多肽复配后能够获得显著的提高免疫力作用。

实施例5：本次试验为了验证实施例3中的复合益生菌制剂在调节肠道菌群方面的作用

1.试验材料

试验动物：SPF级BALB/c雌性小鼠40只，体重18～22g。试验对象：实施例3中的复合益生菌制剂。基础饲料：购于斯贝福(北京)生物科技有限公司，商品名大小鼠维持饲料。

2.试验分组：

A组：空白对照组，每天灌胃无菌生理盐水0.2mL；

B组：实验组，取实施例3制备得到的复合益生菌制剂，按照1×10⁸cfu：2mL的比例将含有生物活性肽的微生态制剂与生理盐水混合，取0.2mL对小鼠灌胃；

每组连续灌胃14d，在实验开始前和实验结束后收集各组小鼠粪便样品，在实验结束后采用16S高通量测序方法测定各组小鼠实验前后肠道菌群变化

3.结果与分析

从图1的结果可以看出，实验组小鼠在试服结束后肠道内理研氏菌科、肠杆菌科等条件致病菌科的相对丰度显著减少，毛螺菌科、乳杆菌科等有益菌科的相对丰度显著增加，且相比于空白对照组，差异显著，表明实施例3得到的复合益生菌制剂有显著调节肠道菌群的功效。

实施例2中制备的复合益生菌制剂所低聚果糖、低聚木糖等原料在复合益生菌剂中起到益生元和甜味剂的作用，抗性糊精作为填充剂使用，一般不具备调节肠道菌群的功效；所以，本发明提供的复合益生菌制剂中主要是由双歧杆菌和鸡蛋清蛋白肽提供了调节肠道菌群的功效。

实施例6本次试验为了验证植物乳杆菌与蛋白酶解多肽复配在抗氧化方面的协同增效作用。

1、试验材料：

实验动物：SPF级昆明小鼠，雄性，体重30～34g。

试验对象：以活菌数为2×10¹¹cfu/g的市售植物乳杆菌菌粉和核桃粕酶解多肽为样品，

经检测，核桃粕酶解多肽中多肽含量为87％，相对分子量<1000Da的分布比例为85％，天冬氨酸的含量为3.5％，谷氨酸的含量为10.7％。

2、分组与造模：

动物分组：50只SPF及昆明雄性小鼠，按体重分为5组，分别为：

A空白对照组：自由饮食自由进水，生理盐水灌胃0.2mL，且每天颈部皮下注射生理盐水0.2mL；

B衰老模型组：自由饮食自由进水，生理盐水灌胃0.2mL，且每天颈部皮下注射浓度为50g/L的D-半乳糖0.2mL；

C植物乳杆菌组：自由饮食自由进水，将1g活菌数为2×10¹¹cfu/g植物乳杆菌菌粉溶于10mL无菌水，得到植物乳杆菌溶液；取0.2mL植物乳杆菌溶液对小鼠进行灌胃，且每天颈部皮下注射浓度为50g/L的D-半乳糖0.2mL；

D核桃肽组：自由饮食自由进水，将0.8g核桃粕酶解多肽溶于10mL无菌水，得到核桃粕酶解多肽溶液；取0.2mL核桃粕酶解多肽溶液对小鼠进行灌胃，且每天颈部皮下注射浓度为50g/L的D-半乳糖0.2mL；

E核桃肽+植物乳杆菌组：自由饮食自由进水，将1g活菌数为2×10¹¹cfu/g植物乳杆菌菌粉溶于10mL无菌水，得到植物乳杆菌溶液；将0.8g核桃粕酶解多肽溶于10mL无菌水，得到核桃粕酶解多肽溶液；将植物乳杆菌溶液与核桃粕酶解多肽溶液混合得到灌胃溶液，取0.2mL灌胃溶液对小鼠进行灌胃。

3、指标测定：小鼠在灌胃6周后，禁食12h，摘眼球取血，离心，取血清；解剖小鼠，取小鼠肝脏，制成肝脏匀浆；测定小鼠血清和肝脏中MDA、GSH-Px和SOD。

4、实验结果：

表3各组小鼠血清中相关抗氧化指标检测结果

注：*表明相比于模型组P<0.05；**表示相比于模型组P<0.01

结果表明，植物乳杆菌和核桃粕酶解多肽均能降低衰老小鼠血清和肝脏组织中MDA水平，提高血清和肝脏组织中GSH-Px和SOD活性，具有良好的体内抗氧化活性和抗衰老作用；

将植物乳杆菌与核桃粕酶解多肽联用灌胃时，该组小鼠的血清和肝脏MDA水平显著低于单用植物乳杆菌和核桃粕酶解多肽组小鼠的血清和肝脏MDA水平，血清和肝脏GSH-Px和SOD活性显著高于单用植物乳杆菌和核桃粕酶解多肽组小鼠的血清和肝脏GSH-Px和SOD活性，则表明植物乳杆菌与核桃粕酶解多肽联用在发挥抗氧化、抗衰老活性方面有协同增效的作用。

实施例7本次试验为了验证蛋白酶解多肽对马乳酒样乳杆菌的发酵促进作用。

种子培养基以质量分数计包括：葡萄糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，无水乙酸钠0.5％，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，吐温800.1％、其余量为水，种子培养基的初始pH值为6.2-6.8；发酵培养基按质量分数计包括10％的乳清蛋白酶解液，2％的葡萄糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温-80，其余量为水；的pH值为6.2-7.0。经检测，乳清蛋白酶解多肽中多肽含量为78％，相对分子量1000Da的分布比例为89％，天冬氨酸的质量百分数为2.4％，谷氨酸的质量分数为5.5％。

将马乳酒样乳杆菌ZW3于种子培养基中活化，将活化后的种子液按照5％接种量接入发酵培养基中，在30℃的厌氧培养，每4h测定活菌数。配制除不含乳清蛋白酶解液外其他成分均相同的对照发酵培养基，将活化后的马乳酒样乳杆菌ZW3以同样接种量接种对照发酵培养基，在相同条件下培养，作为对照组。

结果如图2所示，与对照组相比，试验组的活菌数有显著增高，表明以含有蛋白酶解多肽的发酵培养基培养马乳酒样乳杆菌可以有效提高其发酵速率，缩短发酵时间，提前达到目的活菌数。

实施例8

按质量百分比计，保加利亚乳杆菌的种子培养基(MRS肉汤培养基)：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的柠檬酸氢二铵、0.2％的磷酸氢二钾、0.06％的七水硫酸镁、0.02％的一水硫酸锰、其余量为水；pH6.2；按质量百分比计，嗜热乳链球菌的种子培养基(M17液体培养基)：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸钠、0.2％的磷酸氢二钾、其余量为水；pH6.8；按质量百分比计，发酵培养基：10％的苦瓜籽酶解液(以干重计，0.3％的苦瓜籽蛋白酶解多肽)，2％的葡萄糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温80，其余量为水；pH值为6.5。经检测，苦瓜籽蛋白酶解多肽中多肽含量为78％，相对分子量1000Da以下的分布比例为83％，天冬氨酸质量百分比为1.2％，谷氨酸的质量分数为5.8％。保护剂按质量分数计包括脱脂乳10％，苦瓜籽酶解液10％(以干重计，3％的苦瓜籽蛋白酶解多肽)，其余量为水。

将市售的保加利亚乳杆菌接种到装有MRS肉汤培养基的试管中，35℃、厌氧条件下活化14h，得到保加利亚乳杆菌一级种子液，再将保加利亚乳杆菌一级种子液按照3％的接种量转接至MRS肉汤培养基中得到保加利亚乳杆菌二级种子液，培养条件为30～35℃，厌氧培养18h；将保加利亚乳杆菌二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，保加利亚乳杆菌二级种子液接至发酵培养基中的接种量为3％，培养条件为38℃，厌氧培养10h，待发酵液中菌体密度达到109cfu/mL，收集发酵液，离心获得保加利亚乳杆菌菌泥。按照保加利亚乳杆菌菌泥与冻干保护剂中的苦瓜籽蛋白酶解多肽的质量比1:0.03混合，进行乳化包埋，乳化时间40min；将乳化液在-35℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，真空度为0.15mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎至10目，得到保加利亚乳杆菌菌粉。

将市售的嗜热链球菌接种到装有M17液体培养基的试管中，35℃、厌氧条件下活化14h，得到嗜热链球菌一级种子液，再将嗜热链球菌一级种子液按照3％的接种量转接至M17液体培养基中得到嗜热链球菌二级种子液，培养条件为30～35℃，厌氧培养18h；将嗜热链球菌二级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，嗜热链球菌二级种子液接至发酵培养基中的接种量为3％，培养条件为38℃，厌氧培养10h，待发酵液中菌体密度达到109cfu/mL，收集发酵液，离心获得嗜热链球菌菌泥。按照嗜热链球菌菌泥与冻干保护剂中的苦瓜籽蛋白酶解多肽的质量比1:0.03混合，进行乳化包埋，乳化时间40min；将乳化液在-35℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，真空度为0.15mbar；真空冷冻干燥后将其粉碎至10目，得到嗜热链球菌菌粉。

将保加利亚乳杆菌菌粉和嗜热链球菌菌粉按照质量比2:1的比例混合，得到直投式发酵剂，其中含有保加利亚乳杆菌2.0×10¹¹cfu/g，嗜热链球菌1.2×10¹¹cfu/g。

对比例1

除发酵培养基和冻干保护剂中不添加苦瓜籽酶解液外，其他均与实施例8相同，得到对照直投式发酵剂1。

实施例9本次试验对复配蛋白酶解多肽后，直投式发酵剂的发酵时间进行验证。

1、实验方法：将对比例1得到的对照直投式发酵剂1(不添加苦瓜籽蛋白酶解液)以1×10⁷cfu/mL的接种量分别接入12％脱脂乳培养基(对照组)和添加了质量分数为0.5％的苦瓜籽蛋白酶解多肽的12％脱脂乳培养基(实验组)中，在42℃条件下恒温培养，分别于0、2、4、6、8小时取发酵液测定pH值数。

其中，苦瓜籽蛋白酶解多肽与实施例32采用的相同；12％脱脂乳培养基的配制：称取120g脱脂乳粉溶于1000mL水中，105℃灭菌5min。

2、实验结果

表4复配蛋白酶解多肽对直投式发酵剂发酵过程中pH值的影响

注：*表示与对照组相比P<0.05；**表示与对照组相比P<0.01

在发酵过程中，以达到一定范围的pH值作为发酵重点的标志，本次试验中，发酵终点的pH值范围为4.3～4.6。

如表4所示，发酵2h以后，实验组的发酵液pH值显著低于对照组，发酵6h后，试验组发酵液的pH值达到4.51，发酵完成；而对照组则在发酵8h后，发酵液的pH值才达到4.60，即此时才发酵完成。这表明，将嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌与蛋白酶解多肽复配后能够显著缩短直投式发酵剂的发酵所需时间，有效降低了工业成本。

蛋白酶解多肽具有显著的促进嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌增殖的作用，在制备直投式发酵剂的发酵培养基中添加能够起到缩短直投式发酵剂制备时间的作用，在直投式发酵剂中复配蛋白酶解多肽则起到缩短直投式发酵剂的发酵时间作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种含有生物活性肽的益生菌制剂，由益生菌和蛋白酶解多肽组成，按重量份计：

当所述益生菌为植物乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽为核桃粕多肽，由植物乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽1.5～6份组成；

当所述益生菌为双歧杆菌时，所述蛋白酶解多肽为玉米蛋白酶解多肽，由双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份组成；

当所述益生菌为鼠李糖乳杆菌时，所述蛋白酶解多肽为 大豆蛋白酶解多肽，由鼠李糖乳杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～13.5份组成；

所述乳杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸的质量分数在5％以上；

所述蛋白酶解多肽的重量以干重计。

2.根据权利要求1所述的含有生物活性肽的益生菌制剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。

3.根据权利要求1或2所述的含有生物活性肽的益生菌制剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。

4.权利要求1～3任意一项所述的益生菌制剂在制备食品、药品、保健品或发酵剂中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品、药品、保健品或发酵剂含有生物活性肽的益生菌制剂和辅料。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述食品、药品或保健品的形式包括片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。

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