CN116035205A - 一种调节代谢的益生菌组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种调节代谢的益生菌组合物及其制备方法，属于益生菌技术领域。将豆类原料除去抗性物质后，酶解，得到豆类蛋白酶解产物；将葡萄、阿萨伊果水提醇沉，得到活性多糖；将苹果皮、葡萄皮在混合溶剂中提取，得到活性提取物，将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌接种至培养基，发酵得到发酵产物，与益生菌剂混合，用pH敏感型羟丙基甲基纤维素水凝胶包埋，与益生元、活性多糖、活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。本发明制得的调节代谢的益生菌组合物，多种物质协同作用下，起到减轻炎症，提高抗氧化作用，调节血糖、血脂、尿酸的含量，改善糖脂代谢异常，具有广阔的应用前景。

Description

一种调节代谢的益生菌组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，具体涉及一种调节代谢的益生菌组合物及其制备方法。
背景技术
糖脂代谢病是由遗传、环境和精神状况引起的一种复杂性疾病，其特点是糖、脂代谢紊乱，中医学称之为“消渴症”，随着生活水平和社会压力的提高该疾病呈现多龄化趋势。中药的多组分协同增效使其在长期治疗消渴症方面具有明显优势。糖尿病和高脂血症患者具有相似的代谢状态，其共同表现为肠道菌群结构失衡、短链脂肪酸产生能力下降、胆汁酸合成、修饰和信号转导功能受限以及肠道屏障破坏造成的血清内毒素负荷加重等，不同途径的代谢异常都将引起机体多器官慢性低水平炎症，进而引起胰岛素抵抗，脂质失衡，诱发或加速其发展进程。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)能够耐受有机体的防御机制，其中包括口腔中的酶、胃液中低pH值和小肠的胆汁酸等，起到调节肠内菌群平衡、促进人体消化吸收等作用，具有高效降血压、降胆固醇，促进细胞分裂，产生抗体免疫，增强人体免疫及预防癌症和抑制肿瘤生长等功能；嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)通过分泌抗生物素类物质(嗜酸乳菌素(acidolin)、嗜酸杆菌素(acidophilin)、乳酸菌素(laetocidon)调整肠道菌群平衡，对致病微生物具有拮抗作用。双歧杆菌在肠道内发酵后，还可产生乳酸和醋酸，能提高钙、磷、铁的利用率，促进铁和维生素D的吸收，产生维生素K及维生素B，还可以减少胆固醇的吸收，并能降低辐射对人体的伤害，可以预防腹泻，减少便秘，即双向调节，能起到预防和治疗各种肠道疾病的效果。副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)作为一种益生菌，能促进机体微生物菌群和酶的平衡以及刺激特异性和非特异性的免疫机制，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有明显抑制作用，抑菌谱广。植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)有一定的免疫调节作用，能有效改变各类型过敏，调整过敏体质，包括：过敏性鼻炎、结膜炎、异位性皮肤炎、荨麻疹、食物、花粉等各种过敏症状；嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)能帮助乳糖不耐受患者消化乳糖；能抑制轮状病毒的生长，能使艰难梭菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌等有有害菌的菌落直径减少约30％；同时能明显下调白细胞介素IL-6等炎症因子，对炎症有一定抑制作用。由于各类益生菌对其宿主营养、免疫、防病等具有显著的益生功效，越来越成为人们研究、开发、生产的焦点。
益生菌可以通过以下方式调节代谢，通过抑制脂质吸收、加速排泄，调节脂类摄入；促进胰高血糖素样肽-1释放和提高血管生成素样蛋白4水平，加大脂肪燃烧；促进粪便胆汁酸排出体外，加速脂质代谢过程；调节肠道激素，GLP-1和GLP-2是肠道L细胞分泌的肠促胰岛素，保护胰岛B细胞功能、调控脂肪摄取从而预防二型糖尿病发病。益生菌可以分泌抗菌物质，与其他病原菌竞争，从而抑制病原菌定植。同时益生菌参与肠道屏障、免疫炎症反应。
市场上，各种益生菌的饮料越来越多，各大品牌也纷纷推出益生菌饮料抢食市场。目前市面上此类饮料虽名目繁多，但在功能上却出现严重的同质化，特别是，缺乏降血糖降血脂类调节代谢的益生菌产品，限制了该部分市场的开拓。
中国专利(ZL201610405159.0)公布了一种改善肠道功能的芦笋发酵饮品及其制备方法，利用副干酪乳干菌CICC6270和副干酪乳杆菌CI CC6271进行发酵，提升了芦笋水溶性膳食纤维含量和质量，再通过添加益生元，相互之间协同增效，大大增强了芦笋发酵制品改善肠道的作用，表明益生元与益生菌结合，可有效调控和改善肠道菌群结构与功能。
中国专利(ZL201810073850.2)公布了一株植物乳杆菌DM-50株及其应用，通过糖尿病小鼠的灌胃试验，发现植物乳杆菌具有降血糖作用，但降糖效果不明显。
中国专利(ZL201710820373.7)公布了一种具有辅助降血糖功能的组合物及其制备方法，所述组合物由人参、黄芩、生地等中药经提取后喷雾制粉并按比例混合后制成，具有一定的辅助降血糖作用，但见效慢，效果亦不明显。
尽管目前一些公开专利显示益生菌或益生元具有降血糖的作用，但是相关研究报道多局限于单一方面，有些研究只关注益生菌，忽略了维持益生菌生长和代谢的营养物质(益生元)的作用，导致菌难以在肠道有效定植和持续繁殖，从而无法有效发挥益生菌的功效。有、些研究则主要关注益生元，却未能将其与功能性益生菌结合起来进、行研究，若在没有接种益生菌的情况下只提供一些营养物质，则无法保证益生菌的种类和数量，调控的效果只能是事倍功半。
发明内容
本发明的目的在于提出一种调节代谢的益生菌组合物及其制备方法，通过增加减少肠道致病菌的组成和比例，增加肠道益生菌比例，发挥益生菌调节作用，以及活性物质的协同作用下，起到减轻炎症，提高抗氧化作用，调节血糖、血脂、尿酸的含量，改善糖脂代谢异常，具有广阔的应用前景。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种调节代谢的益生菌组合物的制备方法，将大豆、角豆除去抗性物质后，采用复合蛋白酶酶解，得到豆类蛋白酶解产物；将葡萄、阿萨伊果水提取，过滤，滤渣为第一滤渣，滤液醇沉，得到活性多糖；将苹果皮、葡萄皮在乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中提取，过滤，滤渣为第二滤渣，滤液复合酶酶解，得到活性提取物，将第一滤渣、第一滤渣、豆类蛋白酶解产物、碳源制得培养基，接种活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液，发酵得到发酵产物，与益生菌剂混合，加入pH敏感型羟丙基甲基纤维素水凝胶中，冷冻干燥，与益生元、活性多糖、活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
作为本发明的进一步改进，包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将大豆、角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入混合溶剂，加热回流处理，取出，洗净，干燥，打粉，得到豆粉；
S2.复合蛋白酶酶解：将步骤S1制得的豆粉加入水中，加入复合蛋白酶，酶解，灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
S3.活性多糖的提取：将葡萄、阿萨伊果混合，干燥，粉碎，加水沸腾提取，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将苹果皮、葡萄皮混合，干燥，粉碎，加入乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热提取，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，加入复合酶酶解，灭酶，得到活性提取物；
S5.培养基的制备：将步骤S3中的第一滤渣、步骤S4中的第二滤渣、步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、碳源加入水中，混合均匀，灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，发酵培养第一时间段，加入氯化镁和维生素B12，继续发酵第二时间段，得到发酵产物；
S7.益生元的制备：将低聚木糖、菊粉、抗性糊精混合均匀，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌混合均匀，得到益生菌剂；
益生菌剂包括但不限于这三种菌，还可以包括青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌中的至少一种。
S9.缓释制剂的制备：将离子液体融解成透明液体，加入羟丙基甲基纤维素混合均匀，加热至90-100℃，搅拌溶解，惰性气体保护下，冷却至50-55℃后，加入引发剂和丙烯酸，搅拌反应，加入步骤S6制得的发酵产物、步骤S8制得的益生菌剂，混合均匀，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将步骤S9制得的缓释制剂、步骤S7制得的益生元、步骤S3制得的活性多糖、步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
作为本发明的进一步改进，步骤S1中所述大豆、角豆的质量比5-10：1-3，所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为1-3:5-7:3-5，所述加热的时间为30-50mi n；步骤S2中所述复合蛋白酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶中的至少两种，优选地，为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:6-8，所述豆粉、复合蛋白酶的质量比为10:0.5-1，所述酶解的时间为2-4h，温度为40-45℃。
作为本发明的进一步改进，步骤S3中所述葡萄、阿萨伊果的质量比为2-4:1-2，所述提取的时间为1-2h，提取的次数为2-3次，所述加入乙醇沉淀为加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80％，沉淀的时间为12-18h；步骤S4中所述苹果皮、葡萄皮的质量比为1-3:1-3，所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为3-5:2-4:4-6，所述加热提取的温度为60-70℃，时间为2-4h，所述浓缩液、复合酶的质量比为10-15:1-2，所述浓缩液的相对密度为1.05-1.12，所述复合酶选自羟丙基甲基纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少两种，优选地，为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:1-3；所述酶解的温度为35-45℃，时间为1-3h。
作为本发明的进一步改进，步骤S5中所述第一滤渣、第二滤渣、豆类蛋白酶解产物、碳源的质量比为5-10:5-10:7-12:3-5，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、低聚果糖、木糖醇、可溶性淀粉中的至少一种；步骤S6中所述嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，50-70r/mi n，36-39℃，活化培养12-16h，得到含有108-109cfu/mL的菌种种子液，所述活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液的接种量分别为1-3％、0.5-1％、1-2％，所述发酵培养第一时间段的条件为50-70r/mi n，36-39℃，发酵培养24-36h，所述氯化镁和维生素B12的添加量分别为1-3g/L和2-4g/L，所述发酵第二时间段的条件为50-70r/mi n，36-38℃，发酵培养18-24h。
作为本发明的进一步改进，步骤S7中所述低聚木糖、菊粉、抗性糊精的质量比为10:3-5:2-4；步骤S8中所述婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌的质量比为1-3:1-3:3-5:2-4。
作为本发明的进一步改进，步骤S9中所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，所述离子液体、羟丙基甲基纤维素、引发剂、丙烯酸、发酵产物、益生菌剂的质量比为100:25-35:0.5-1:7-10:5-7:2-3，所述引发剂选自过硫酸钠、过硫酸铵、过硫酸钾中的至少一种；步骤S10中所述缓释制剂、益生元、活性多糖、活性提取物的质量比为10:1-3:2-4:3-5。
作为本发明的进一步改进，具体包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将5-10重量份大豆、1-3重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入混合溶剂，加热回流30-50mi n，取出，洗净，干燥，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为1-3:5-7:3-5；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入水中，加入0.5-1重量份复合蛋白酶，40-45℃酶解2-4h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:6-8；
S3.活性多糖的提取：将2-4重量份葡萄、1-2重量份阿萨伊果混合，干燥，粉碎，加水沸腾提取1-2h，提取2-3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80％，沉淀12-18h，过滤，洗涤，干燥，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将1-3重量份苹果皮、1-3重量份葡萄皮混合，干燥，粉碎，加入乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至60-70℃，提取2-4h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.05-1.12，向10-15重量份浓缩液中加入1-2重量份复合酶，35-45℃酶解1-3h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为3-5:2-4:4-6；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:1-3；
S5.培养基的制备：将5-10重量份步骤S3中的第一滤渣、5-10重量份步骤S4中的第二滤渣、7-12重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3-5重量份碳源加入水中，搅拌混合10-15mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为1-3％、0.5-1％、1-2％，50-70r/mi n，36-39℃，发酵培养24-36h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为1-3g/L和2-4g/L，50-70r/mi n，36-38℃，发酵培养18-24h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，50-70r/mi n，36-39℃，活化培养12-16h，得到含有108-109cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、3-5重量份菊粉、2-4重量份抗性糊精，搅拌混合5-10mi n，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将1-3重量份婴儿双歧杆菌、1-3重量份动物双歧杆菌、3-5重量份罗伊氏乳杆菌、2-4重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合5-10mi n，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入25-35重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合10-15mi n，加热至90-100℃，搅拌溶解，惰性气体保护下，冷却至50-55℃后，加入0.5-1重量份引发剂和7-10重量份丙烯酸，搅拌反应1-2h，加入5-7重量份步骤S6制得的发酵产物、2-3重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合30-40mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
优选地，所述惰性气体选自氮气、氦气、氩气、氖气中的至少一种。
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、1-3重量份步骤S7制得的益生元、2-4重量份步骤S3制得的活性多糖、3-5重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
本发明进一步保护一种上述的制备方法制得的调节代谢的益生菌组合物。
本发明进一步保护一种上述调节代谢的益生菌组合物在制备治疗及辅助治疗降血糖、降血压的产品中的应用。
本发明具有如下有益效果：
豆类含有丰富的豆蛋白，本发明添加的大豆和角豆，豆类中含有胰蛋白酶抑制素，且其热稳定性很高，不易被降解，胰蛋白酶抑制素不但阻止大豆本身的蛋白营养消化吸收，同时还要破坏和阻止体内其它蛋白质营养的消化吸收，而且还要产生毒性，有害有损人体健康。因此，本发明首先采用化学溶剂+物理蒸汽加热结合的方法对豆类原料进行脱毒处理，在高温蒸汽作用下，胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶解于化学溶剂高温蒸汽中，部分高温分解，变成挥发性物质而随蒸气散失，部分与化学溶剂中的有机物反应，如胺与硫键反应，起到高效有效脱毒的效果。经过抗性物质去除后的豆类原料经过蛋白酶酶解、以及后续益生菌发酵后，三级结构的蛋白质分子降解成二级结构的短肽、活性多肽、氨基酸等物质，统称为豆蛋白源性肽，包含多种且分子链长度不等的肽类混合物，除了具有易吸收的特点外，还具有降低胆固醇、降血脂、降尿酸和降血糖的作用。其中的疏水肽可以抑制肠道胆固醇吸收，露那辛肽能够降低PCSK9的表达水平，提高LDL-R蛋白的表达，促进HepG2细胞对LDL-C的摄取，含有的赖氨酸—丙氨酸(KA)、缬氨酸—赖氨酸(VK)和丝氨酸—酪氨酸(SY)成分，能抑制人肝HepG2细胞中乙酸合成甘油三酯，异亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ile-Leu-Leu，ILL)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸L(Leu-Leu-Leu，LL)和缬氨酸-组氨酸-缬氨酸-缬氨酸(Val-His-Val-Val，VHVV)具有刺激脂解反应的活性，从而起到了很好的调节糖脂代谢的作用。
葡萄、阿萨伊果含有丰富的多糖，其中，制得的活性多糖具有降血脂、降尿酸和调节脂质代谢、抗氧化、抗炎、调节肠道菌群的作用；其中，阿萨伊果多糖能够抑制α-葡萄糖苷酶阻止机体对葡萄糖的吸收和转运，达到降血糖作用，能够通过激活p-AMPK，抑制其下游靶点SREBP-1和ACC-1调节脂质代谢，达到调血脂作用；葡萄多糖可以起到高效抑制氧化应激关键生物标志物MDA，减少超氧化物、羟基和过氧化氢等活性氧产生，间接抑制炎症反应与胰岛素抵抗；以及抑制PKC、MAPK、JNK和NF-κB信号通路来抑制脂肪因子诱导的炎症因子生成，抑制胰岛素抵抗来调节糖脂代谢，还可以进一步降低血液中尿酸含量。同时，本发明活性多糖也能够增加肠道SCFAs、减少肠道致病菌的组成和比例，起到减轻炎症，改善糖脂代谢异常。
本发明活性提取物通过对苹果皮、葡萄皮采用乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂提取，得到活性提取物，其中，苹果皮提取物中具有较好的降血脂、降尿酸和降血糖活性，对α-淀粉酶活力具有明显的抑制作用，还能抑制α-葡萄糖苷酶。葡萄皮提取物含有丰富的多羟基酚等物质，这两者具有很好的降血脂的功效，可抑制胰脂肪酶活性，抑制脂肪消化，还可以进一步降低血液中尿酸含量。
致病菌的大量增加会破坏肠道屏障，引起肠上皮细胞间紧密连接蛋白功能减退，从而使得细菌内毒素入血引发炎症，造成胰岛素抵抗和血糖、血脂异常增高。益生菌可以通善肠道黏膜完整性，减少细菌入侵和脂多糖引起的炎症反应，从而调节血糖、血脂代谢，降低患糖尿病和高脂血症的风险。食用特定的益生菌菌株为人体健康带来多种益处，包括强化肠道黏膜屏障和改善通透性、抗氧化应激、降低脂多糖水平，从而防止肠道渗漏和内毒素血症、减轻慢性炎症反应和调节免疫系统等。益生菌的摄入通过血糖和血脂代谢调节，具有缓解糖脂代谢紊乱的效果。
本发明中，益生菌剂中的罗伊氏乳杆菌和副干酪乳杆菌可以改善肠道完整性、降低全身脂多糖水平、增加胰高血糖素样肽1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)水平、减弱内质网应激来达到改善外周胰岛素敏感性的效果。婴儿双歧杆菌可以显著改善抗氧化状态，有效调节血糖、血脂、血清尿素和肌酐等生物化学指标。动物双歧杆菌对α-葡萄糖苷酶有抑制作用。
本发明发酵选用的益生菌包括嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌，其中，嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌能有效改善高脂饮食引起的高脂血症，缓解肝脏脂肪聚积。他们协同作用，通过降低肠道中法尼醇X受体(farnesoid Xreceptor，FXR)来调节胆汁酸代谢，降低NPC1L1来减少肠道对膳食胆固醇吸收。长双歧杆菌可以作用于FXR/FGF15途径，逆转CYP7A1在肝脏中的表达，促进胆固醇在肝脏中的分解。另外，鼠李糖乳杆菌还可以通过AMPK和TLR/NF-κB途径调节新生脂质合成和抑制炎症，从而改善非酒精性脂肪性肝病，对调控血脂代谢起到了有效作用。
本发明采用多种益生菌的协同作用，多种益生菌联合使用表现出的临床参数改善可能优于单一菌株的作用。可以通过胆汁酸的酶解偶联、益生菌细胞膜对胆固醇的同化作用，更重要的是益生菌发酵时产生的短链脂肪酸可减少胆固醇的合成。同时，益生菌发酵代谢产物短链脂肪酸，可作为信号转导分子，通过激活肠道表面G蛋白偶联受体(Gprotein-coupled receptor，GPR)41和GPR43，促进GLP-1和胃肠多肽酪酪肽(peptide YY，PYY)释放，以改善胰岛细胞的生存和功能，增加胰岛素和瘦素分泌，间接刺激机体血糖水平下降。益生菌菌株分泌具有抗菌活性的短链脂肪酸等次级代谢物和多肽，其可能与宿主或病原体直接相互作用，对黏液和肠道上皮细胞的粘附不仅使菌株具有竞争优势，而且可与宿主形成更强的相互作用，从而刺激宿主的免疫反应。益生菌除了对致病性定植有抗性外，还通过细胞表面蛋白质、胞外多糖、脂质体酸、肽聚糖、菌毛与宿主组织相互作用，结合粘蛋白，调节粘蛋白、免疫和肠道细胞以提高转运时间改善肠道屏障的完整性。此外，益生菌菌株的定植阻止了肠道病原体与肠道细胞的粘附，从而降低致病菌的量，减少了细菌内毒素入血，从而对血脂、血糖调节起到了正向作用。另外，还可以通过提高抗氧化物质，包括超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)和GSH-Px，改善肠道屏障功能和减少氧化应激以控制糖尿病进程，改善血脂谱，减少心血管等相关并发症。
本发明还添加了益生元，包括低聚木糖、菊粉、抗性糊精，这些益生元到达肠道，积极促进肠道内益生菌发酵产生短链脂肪酸，为肠道营造酸性环境，起到抑制有害菌的生长，与益生菌协同作用，一同对肠道菌群平衡有促进作用，两者之间的协同效应使益生菌在肠道内获得优势，从而快速定植生长繁殖并成为优势菌。另外，菊粉还能促进益生菌产生的细菌素、有机酸、过氧化氢和铁载体等代谢产物，抑制肠道菌群中的不利菌群，预防细菌致病性定植，对竞争的肠道病原体发挥直接的抗菌作用。
摄入足够的益生菌和益生元可以通过改善肠道菌群的组成、保持肠道完整性和促进肠道有益菌的生长而对宿主健康产生积极影响。乳杆菌和双歧杆菌可以抑制胰岛细胞的破坏，提高胰岛素的结合能力。乳杆菌可减少肾脏中某些糖基化产物的形成或积累。双歧杆菌可降低促炎因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)6、IL-1β水平，同时增加抗炎因子转化生长因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)和IL-10表达，TGF-β和IL-10可参与血管重塑，抑制炎症细胞聚集或泡沫细胞形成，从发挥抗炎症反应的作用。
本发明通过将羟丙基甲基纤维素溶于离子液体中，加入丙烯酸单体，引发聚合后，制得了一种pH敏感型水凝胶，其三维网络中含有可离子化的基团，由于含有大量的-COOH基团的存在，使得其在高pH值环境下的溶胀度远远高于其在低pH值环境下的溶胀度，从而使得将益生菌以及活性肽包埋在水凝胶体系内，在胃部的酸性环境下，不会发生溶胀，而进入碱性的肠道环境中，迅速溶胀，释放益生菌、活性肽，起到很好的缓释包埋作用。
本发明制得的调节代谢的益生菌组合物，含有缓释制剂、益生元、活性多糖、活性提取物，通过增加减少肠道致病菌的组成和比例，增加肠道益生菌比例，发挥益生菌调节作用，以及活性物质的协同作用下，起到减轻炎症，提高抗氧化作用，调节血糖、血脂、尿酸的含量，改善糖脂代谢异常，具有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明测试例1中各组存活率对比图；
图2为本发明测试例1中各组释放率对比图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
菠萝蛋白酶，FDG-2201，10万U/g；胰蛋白酶，GDG-2016，4万U/g；羟丙基甲基纤维素酶，SDG-2425，1万U/g；木瓜蛋白酶，FDG-2203，10万U/g；均购于夏盛(北京)生物科技开发有限公司。
嗜酸乳杆菌，为JYLA-101，100亿cfu/g；长双歧杆菌，为BLG-19，100亿cfu/g；鼠李糖乳杆菌，为JYLR-005，100亿cfu/g；罗伊氏乳杆菌，为JYLB-291，100亿cfu/g；副干酪乳杆菌，为JLPF-176，100亿cfu/g；均购于山东中科嘉亿生物工程有限公司。
婴儿双歧杆菌，为ATCC 15697，100亿cfu/g；购于上海复祥生物科技有限公司；动物双歧杆菌，货号EY-J963535，100亿cfu/g；购于上海研一生物科技有限公司。
低聚木糖，有效物质含量>99％，购于武汉万荣科技发展有限公司；菊粉，有效物质含量>99％，深圳乐芙生物科技有限公司；抗性糊精，有效物质含量>99％，购于武汉恒乐盛生物科技有限公司。羟丙基甲基纤维素，购于河南宗创食品配料有限公司。
1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，购于山东云海生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种调节代谢的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将5重量份大豆、1重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流30mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为1:5:3；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入50重量份水中，加入0.5重量份复合蛋白酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3:6；
S3.活性多糖的提取：将2重量份葡萄、1重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1h，提取2次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为70％，沉淀12h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将1重量份苹果皮、1重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至60℃，提取2h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.05，向10重量份浓缩液中加入1重量份复合酶，35℃酶解1h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为3:2:4；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:1；
S5.培养基的制备：将5重量份步骤S3中的第一滤渣、5重量份步骤S4中的第二滤渣、7重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖加入500重量份水中，搅拌混合10mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为1％、0.5％、1％，50r/mi n，36℃，发酵培养24h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为1g/L和2g/L，50r/mi n，36℃，发酵培养18h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，50r/mi n，36℃，活化培养12h，得到含有108cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、3重量份菊粉、2重量份抗性糊精，搅拌混合5mi n，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将1重量份婴儿双歧杆菌、1重量份动物双歧杆菌、3重量份罗伊氏乳杆菌、2重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合5mi n，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入25重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合10mi n，加热至90℃，搅拌溶解，氖气保护下，冷却至50℃后，加入0.5重量份过硫酸钠和7重量份丙烯酸，搅拌反应1h，加入5重量份步骤S6制得的发酵产物、2重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合30mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、1重量份步骤S7制得的益生元、2重量份步骤S3制得的活性多糖、3重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
实施例2
本实施例提供一种调节代谢的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将10重量份大豆、3重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流50mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为3:7:5；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入50重量份水中，加入1重量份复合蛋白酶，45℃酶解4h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为5:8；
S3.活性多糖的提取：将4重量份葡萄、2重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取2h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为80％，沉淀18h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将3重量份苹果皮、3重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至70℃，提取4h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.12，向15重量份浓缩液中加入2重量份复合酶，45℃酶解3h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为5:4:6；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:3；
S5.培养基的制备：将10重量份步骤S3中的第一滤渣、10重量份步骤S4中的第二滤渣、12重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖、2重量份麦芽糖加入500重量份水中，搅拌混合15mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为3％、1％、2％，70r/mi n，39℃，发酵培养36h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为3g/L和4g/L，70r/mi n，38℃，发酵培养24h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，70r/mi n，39℃，活化培养16h，得到含有109cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、5重量份菊粉、4重量份抗性糊精，搅拌混合10mi n，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将3重量份婴儿双歧杆菌、3重量份动物双歧杆菌、5重量份罗伊氏乳杆菌、4重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合10mi n，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入35重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合15mi n，加热至100℃，搅拌溶解，氩气保护下，冷却至55℃后，加入1重量份过硫酸铵和10重量份丙烯酸，搅拌反应2h，加入7重量份步骤S6制得的发酵产物、3重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合40mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、3重量份步骤S7制得的益生元、4重量份步骤S3制得的活性多糖、5重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
实施例3
本实施例提供一种调节代谢的益生菌组合物的制备方法，具体包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将7重量份大豆、2重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为2:6:4；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入50重量份水中，加入0.7重量份复合蛋白酶，42℃酶解3h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为4:7；
S3.活性多糖的提取：将3重量份葡萄、1.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，向12重量份浓缩液中加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为4:3:5；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:2；
S5.培养基的制备：将7重量份步骤S3中的第一滤渣、7重量份步骤S4中的第二滤渣、10重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为2％、0.7％、1.5％，60r/mi n，37℃，发酵培养30h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为2g/L和3g/L，60r/mi n，37℃，发酵培养22h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，60r/mi n，37℃，活化培养14h，得到含有109cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、4重量份菊粉、3重量份抗性糊精，搅拌混合7mi n，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将2重量份婴儿双歧杆菌、2重量份动物双歧杆菌、4重量份罗伊氏乳杆菌、3重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合7mi n，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入6重量份步骤S6制得的发酵产物、2.5重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、2重量份步骤S7制得的益生元、3重量份步骤S3制得的活性多糖、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
实施例4
与实施例3相比，不同之处在于，复合蛋白酶为单一的菠萝蛋白酶。
实施例5
与实施例3相比，不同之处在于，复合蛋白酶为单一的胰蛋白酶。
实施例6
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的羟丙基甲基纤维素酶。
实施例7
与实施例3相比，不同之处在于，复合酶为单一的木瓜蛋白酶。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中未添加水，乙醇、乙酸乙酯的体积比为4:8。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中未添加乙酸乙酯，乙醇、水的体积比为4:8。
对比例1
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加大豆。
具体如下：
S1.豆类的抗性物质去除：将9重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉。
对比例2
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S1中未添加角豆。
具体如下：
S1.豆类的抗性物质去除：将9重量份大豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉。
对比例3
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S1、S2。
具体如下：
S1.活性多糖的提取：将3重量份葡萄、1.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S2.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，向12重量份浓缩液中加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为4:3:5；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:2；
S3.培养基的制备：将7重量份步骤S1中的第一滤渣、7重量份步骤S2中的第二滤渣、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S4.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为2％、0.7％、1.5％，60r/mi n，37℃，发酵培养30h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为2g/L和3g/L，60r/mi n，37℃，发酵培养22h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，60r/mi n，37℃，活化培养14h，得到含有109cfu/mL的菌种种子液；
S5.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、4重量份菊粉、3重量份抗性糊精，搅拌混合7mi n，得到益生元；
S6.益生菌剂的混合：将2重量份婴儿双歧杆菌、2重量份动物双歧杆菌、4重量份罗伊氏乳杆菌、3重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合7mi n，得到益生菌剂；
S7.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入6重量份步骤S4制得的发酵产物、2.5重量份步骤S6制得的益生菌剂，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S8.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S7制得的缓释制剂、2重量份步骤S5制得的益生元、3重量份步骤S1制得的活性多糖、4重量份步骤S2制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例4
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S2。
S1.豆类的抗性物质去除：将7重量份大豆、2重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为2:6:4；
S2.活性多糖的提取：将3重量份葡萄、1.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S3.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，向12重量份浓缩液中加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为4:3:5；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:2；
S4.培养基的制备：将7重量份步骤S2中的第一滤渣、7重量份步骤S3中的第二滤渣、10重量份步骤S1制得的豆粉、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S5.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为2％、0.7％、1.5％，60r/mi n，37℃，发酵培养30h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为2g/L和3g/L，60r/mi n，37℃，发酵培养22h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，60r/mi n，37℃，活化培养14h，得到含有109cfu/mL的菌种种子液；
S6.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、4重量份菊粉、3重量份抗性糊精，搅拌混合7mi n，得到益生元；
S7.益生菌剂的混合：将2重量份婴儿双歧杆菌、2重量份动物双歧杆菌、4重量份罗伊氏乳杆菌、3重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合7mi n，得到益生菌剂；
S8.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入6重量份步骤S5制得的发酵产物、2.5重量份步骤S7制得的益生菌剂，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S9.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S8制得的缓释制剂、2重量份步骤S6制得的益生元、3重量份步骤S2制得的活性多糖、4重量份步骤S3制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例5
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加葡萄。
具体如下：
S3.活性多糖的提取：将4.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖。
对比例6
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S3中未添加阿萨伊果。
具体如下：
S3.活性多糖的提取：将4.5重量份葡萄混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖。
对比例7
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未添加复合酶酶解。
具体如下：
S4.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，得到活性提取物。
对比例8
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S4中未进行乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂提取。
具体如下：
S4.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份水，加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物。
对比例9
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加第一滤渣。
具体如下：
S5.培养基的制备：将7重量份步骤S4中的第二滤渣、10重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基。
对比例10
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加第二滤渣。
具体如下：
S5.培养基的制备：将7重量份步骤S3中的第一滤渣、10重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基。
对比例11
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S5中未添加豆类酶解产物。
具体如下：
S5.培养基的制备：将7重量份步骤S3中的第一滤渣、7重量份步骤S4中的第二滤渣、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基。
对比例12
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S5、S6。
S1.豆类的抗性物质去除：将7重量份大豆、2重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为2:6:4；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入50重量份水中，加入0.7重量份复合蛋白酶，42℃酶解3h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为4:7；
S3.活性多糖的提取：将3重量份葡萄、1.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，向12重量份浓缩液中加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为4:3:5；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:2；
S5.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、4重量份菊粉、3重量份抗性糊精，搅拌混合7mi n，得到益生元；
S6.益生菌剂的混合：将2重量份婴儿双歧杆菌、2重量份动物双歧杆菌、4重量份罗伊氏乳杆菌、3重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合7mi n，得到益生菌剂；
S7.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入6重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、2.5重量份步骤S6制得的益生菌剂，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S8.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S7制得的缓释制剂、2重量份步骤S5制得的益生元、3重量份步骤S3制得的活性多糖、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例13
与实施例3相比，不同之处在于，未进行步骤S9。
S1.豆类的抗性物质去除：将7重量份大豆、2重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入100重量份混合溶剂，加热回流40mi n，取出，清水洗净，70℃干燥1h，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为2:6:4；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入50重量份水中，加入0.7重量份复合蛋白酶，42℃酶解3h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为4:7；
S3.活性多糖的提取：将3重量份葡萄、1.5重量份阿萨伊果混合，晒干，粉碎，加5倍质量的水沸腾提取1.5h，提取3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为75％，沉淀16h，过滤，清水洗净，70℃干燥1h，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将2重量份苹果皮、2重量份葡萄皮混合，晒干，粉碎，加入50重量份乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至65℃，提取3h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.1，向12重量份浓缩液中加入1.5重量份复合酶，40℃酶解2h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为4:3:5；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:2；
S5.培养基的制备：将7重量份步骤S3中的第一滤渣、7重量份步骤S4中的第二滤渣、10重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3重量份葡萄糖、1重量份低聚果糖加入500重量份水中，搅拌混合12mi n，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为2％、0.7％、1.5％，60r/mi n，37℃，发酵培养30h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为2g/L和3g/L，60r/mi n，37℃，发酵培养22h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，60r/mi n，37℃，活化培养14h，得到含有109cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、4重量份菊粉、3重量份抗性糊精，搅拌混合7mi n，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将2重量份婴儿双歧杆菌、2重量份动物双歧杆菌、4重量份罗伊氏乳杆菌、3重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合7mi n，得到益生菌剂；
S9.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份制剂(步骤S6制得的发酵产物和步骤S8制得的益生菌剂的质量比为6:2.5)、2重量份步骤S7制得的益生元、3重量份步骤S3制得的活性多糖、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例14
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中未添加益生菌剂。
具体如下：
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入8.5重量份步骤S6制得的发酵产物，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂。
对比例15
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S9中未添加发酵产物。
具体如下：
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入30重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合12mi n，加热至95℃，搅拌溶解，氮气保护下，冷却至52℃后，加入0.7重量份过硫酸钾和8.5重量份丙烯酸，搅拌反应1.5h，加入8.5重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合35mi n，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂。
对比例16
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加益生元。
具体如下：
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、3重量份步骤S3制得的活性多糖、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例17
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加活性多糖。
具体如下：
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、2重量份步骤S7制得的益生元、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例18
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加活性提取物。
具体如下：
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、2重量份步骤S7制得的益生元、3重量份步骤S3制得的活性多糖混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
对比例19
与实施例3相比，不同之处在于，步骤S10中未添加缓释制剂。
具体如下：
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将2重量份步骤S7制得的益生元、3重量份步骤S3制得的活性多糖、4重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
测试例1
将1g本发明实施例1-3制得的缓释制剂，以及对比例13中混合物(步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物和步骤S6制得的益生菌剂，质量比为6:2.5)的分别加入到9mL人工模拟胃pH值环境的溶液(pH＝1.2，通过将2g NaC l和7mL浓HC l溶于1000mL蒸馏水中制备)和9mL人工模拟肠pH值环境的溶液(pH＝6.8，通过将250mL 0.1mo l/L KH2PO4和118mL 0.2mo l/LNaOH混合制备)中，在37℃、70r/mi n条件下分别反应2h和3h，另外，取等量的调节代谢的益生菌组合物先加入到9mL人工模拟胃pH值环境的溶液中，先置于摇床中，在37℃、70r/mi n条件下反应2h后，离心，再加入9mL人工模拟肠pH值环境的溶液继续反应3h。反应结束后进行益生菌群细胞计数。按照以下公式计算存活率：
存活率(％)＝Nt/N0×100％
式中，Nt为在体外人工模拟胃液或人工模拟肠液中孵育一定时间后存活的益生菌浓度(cfu/g)，N0为人工模拟胃液或人工模拟肠液中添加的益生菌原始浓度(cfu/g)。
按照以下公式计算释放率：
释放率(％)＝(Wt-W0)/W0×100％
式中，W0为样品起始重量；Wt为样品在体外模拟人工模拟胃液和人工模拟肠液中孵育一定时间后重量。
结果见图1和图2。由图可知，本发明通过羟丙基甲基纤维素水凝胶对益生菌及多肽具有很好的包埋作用。本发明通过将羟丙基甲基纤维素溶于离子液体中，加入丙烯酸单体，引发聚合后，制得了一种pH敏感型水凝胶，其三维网络中含有可离子化的基团，由于含有大量的-COOH基团的存在，使得其在高pH值环境下的溶胀度远远高于其在低pH值环境下的溶胀度，从而使得将益生菌以及活性肽包埋在水凝胶体系内，在胃部的酸性环境下，不会发生溶胀，而进入碱性的肠道环境中，迅速溶胀，释放益生菌、活性肽，起到很好的缓释包埋作用。
测试例2
测试对象：将本发明实施例1-5，对比例1-3、13制得的调节代谢的益生菌组合物进行豆类蛋白肽分子量分布实验。
预处理：取10g产品，匀浆器破碎后，离心取上清液，冷冻干燥，取样品加水充分溶解，经0.45um滤膜过滤。
色谱柱：TSKgel G2000SWxL凝胶色谱柱(300×7.8mm，Tosoh)，流动相：乙腈-水-三氟乙酸(40:60:0.1)；检测波长：220nm；流速：0.5mL/mi n；柱温：30℃；进样体积：10μL；等梯度洗脱。
检测结果见表1。
表1
组别 >10000 6000-10000 1000-6000 <1000
实施例1 2.5 2.2 17.8 77.5
实施例2 2.7 1.9 17.5 77.9
实施例3 1.6 2.0 17.9 78.5
实施例4 8.4 4.5 14.9 72.2
实施例5 9.1 3.9 15.5 71.5
对比例1 6.4 5.0 18.2 70.4
对比例2 5.6 5.2 16.5 72.7
对比例4 14.2 6.2 13.9 65.7
对比例12 16.8 3.9 16.4 62.9
由上表可知，本发明方法处理后，多肽的分子量大大减少，大部分为小分子肽。
测试例3促进血脂代谢试验
将SPF级KM雄性小鼠184只，体质量22g左右，自由饮食，适应性喂养1w。随机分为正常组、模型组、实施例1-9组、对比例1-19组，每组6只，正常组10只。除了正常组，其他组每天饲喂高脂饲料，正常组每天饲喂普通饲料。连续饲喂8w，造成高血脂模型，随后，实施例1-9和对比例1-19组分别每天饲喂相应制得的调节代谢的益生菌组合物500mg/kg/天，正常组、模型组饲喂等量的生理盐水。连续灌喂2w后，除正常组外，余下三组小鼠腹腔注射(i.p.)次黄嘌呤(600mg/kg)造高尿酸模型，1h后，各组小鼠注射3％水合氯醛，摘眼球取血，每组采血时间不超过5min，并解剖，摘取肝脏于容器内，置于-80℃冰箱保存备用。
血清中总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)含量测定：采血后室温静置1h，离心，取血清，按试剂盒操作说明测定TC、TG含量。
兽用全自动生化仪(BS-240VET，深圳迈瑞)测定血清中尿酸含量。
肝脏组织中超氧化物岐化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量的测定：按肝脏组织质量(g)：试剂盒里的试剂体积(mL)＝1：10的比例进行冰浴匀浆，离心，取上清液按试剂盒操作说明测定SOD、MDA数值。
结果见表2。
表2
Figure BDA0004126591500000351
Figure BDA0004126591500000361
注释：*为与正常组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的调节代谢的益生菌组合物能够很好的降低血脂和尿酸指标，以及提高肝脏中抗氧化酶(SOD)的含量，降低丙二醛(MDA)的含量，丙二醛是脂质过氧化代谢终产物，其含量反映组织的损伤程度。
测试例4促进血糖代谢试验
将SPF级小鼠190只，体质量22g左右，自由饮食，适应性喂养1w，禁食16h后测量空腹血糖值，随机分为正常组、模型组、阳性对照组、实施例1-9组、对比例1-19组，每组6只，正常组10只。根据体质量连续5d腹腔注射50mg/kg链脲佐菌素(STZ)溶液，每天1次，最后1次注射STZ后，禁食16h并再次测定血糖值，若模型组血糖值显著高于正常组，则表明造模成功。造模成功后，实施例1-9和对比例1-19组分别每天饲喂相应制得的调节代谢的益生菌组合物500mg/kg/天，正常组、模型组饲喂等量的生理盐水。阳性对照组饲喂二甲双胍250mg/kg/天，连续28d。在第0、14、28天，测定各组小鼠血糖值，结果见表3。
表3
Figure BDA0004126591500000371
Figure BDA0004126591500000381
注释：*为与正常组相比，P<0.05；#为与模型组相比，P<0.05。
由上表可知，本发明实施例1-3制得的调节代谢的益生菌组合物能够很好的降低小鼠的血糖值，起到很好的促进血糖代谢的作用。
实施例4、5与实施例3相比，复合蛋白酶为单一的菠萝蛋白酶或胰蛋白酶。对比例4与实施例3相比，未进行步骤S2。小分子量肽含量减少，血糖值升高、血脂指标升高。菠萝蛋白酶是一种巯基蛋白酶，优先水解碱性氨基酸(例如精氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基侧上的肽链；胰蛋白酶能选择性的水解蛋白质中由赖氨酸或者精氨酸的羧基构成的肽链，通过合适比例的菠萝蛋白酶和胰蛋白酶，使得豆类蛋白酶解为较小的分子蛋白肽，从而为其发挥促进糖脂代谢。
实施例6、7与实施例3相比，复合酶为单一的纤维素酶或木瓜蛋白酶。对比例7与实施例3相比，步骤S4中未添加复合酶酶解。血糖值升高、SOD含量减少，MDA含量提高，血脂指标升高。苹果皮、葡萄皮中含有丰富的纤维素类物质，以及细胞壁等，可以通过纤维素酶进行酶解，从而促进大量的细胞内容物溶出，进一步被木瓜蛋白酶酶解，产生大量的小分子短肽，内容物中的活性物质以及小分子肽能够起到很好的降血糖、降血压的效果。
实施例8、9与实施例3相比，所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中未添加水，乙醇、乙酸乙酯的体积比为4:8；或者所述未添加乙酸乙酯，乙醇、水的体积比为4:8。对比例9与实施例3相比，步骤S4中未进行乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂提取。血糖、尿酸值升高、SOD含量减少，MDA含量提高。水的添加能够促进对原料中极性活性物质(水溶性成分)的提取，乙酸乙酯的添加能促进对原料中非极性活性物质(油溶性成分)的提取，从而获得大量、丰富的活性物质，提高抗氧化、抗炎等作用，促进益生菌生长增殖，起到很好的糖脂代谢调节的作用。
对比例1、2与实施例3相比，步骤S1中未添加大豆或角豆。小分子量肽含量减少，对比例3与实施例3相比，未进行步骤S1、S2。血糖值升高，血脂指标升高。豆类含有丰富的豆蛋白，本发明添加的大豆和角豆，豆类中含有胰蛋白酶抑制素，且其热稳定性很高，不易被降解，胰蛋白酶抑制素不但阻止大豆本身的蛋白营养消化吸收，同时还要破坏和阻止体内其它蛋白质营养的消化吸收，而且还要产生毒性，有害有损人体健康。因此，本发明首先采用化学溶剂+物理蒸汽加热结合的方法对豆类原料进行脱毒处理，在高温蒸汽作用下，胰蛋白酶抑制素以及其它抗营养因子通过溶解于化学溶剂高温蒸汽中，部分高温分解，变成挥发性物质而随蒸气散失，部分与化学溶剂中的有机物反应，如胺与硫键反应，起到高效有效脱毒的效果。经过抗性物质去除后的豆类原料经过蛋白酶酶解、以及后续益生菌发酵后，三级结构的蛋白质分子降解成二级结构的短肽、活性多肽、氨基酸等物质，统称为豆蛋白源性肽，包含多种且分子链长度不等的肽类混合物，除了具有易吸收的特点外，还具有降低胆固醇、降血脂、降尿酸和降血糖的作用。其中的疏水肽可以抑制肠道胆固醇吸收，露那辛肽能够降低PCSK9的表达水平，提高LDL-R蛋白的表达，促进HepG2细胞对LDL-C的摄取，含有的赖氨酸—丙氨酸(KA)、缬氨酸—赖氨酸(VK)和丝氨酸—酪氨酸(SY)成分，能抑制人肝HepG2细胞中乙酸合成甘油三酯，异亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸(Ile-Leu-Leu，ILL)、亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸L(Leu-Leu-Leu，LL)和缬氨酸-组氨酸-缬氨酸-缬氨酸(Val-His-Val-Val，VHVV)具有刺激脂解反应的活性，从而起到了很好的调节糖脂代谢的作用。
对比例5、6与实施例3相比，步骤S3中未添加葡萄或阿萨伊果。对比例17与实施例3相比，步骤S10中未添加活性多糖。血糖、尿酸值升高，SOD含量减少，MDA含量提高，血脂指标升高。葡萄、阿萨伊果含有丰富的多糖，其中，制得的活性多糖具有降血脂、降尿酸和调节脂质代谢、抗氧化、抗炎、调节肠道菌群的作用；其中，阿萨伊果多糖能抑制α-葡萄糖苷酶阻止机体对葡萄糖的吸收和转运，达到降血糖作用；阿萨伊果多能够通过激活p-AMPK，抑制其下游靶点SREBP-1和ACC-1调节脂质代谢，达到调血脂作用；葡萄多糖可以起到高效抑制氧化应激关键生物标志物MDA，减少超氧化物、羟基和过氧化氢等活性氧产生，间接抑制炎症反应与胰岛素抵抗；以及抑制PKC、MAPK、JNK和NF-κB信号通路来抑制脂肪因子诱导的炎症因子生成，抑制胰岛素抵抗来调节糖脂代谢，还可以进一步降低血液中尿酸含量。同时，本发明活性多糖也能够增加肠道SCFAs、减少肠道致病菌的组成和比例，起到减轻炎症，改善糖脂代谢异常。
对比例9、10、11与实施例3相比，步骤S5中未添加第一滤渣、第二滤渣或豆类酶解产物。对比例13与实施例3相比，未进行步骤S5、S6，小分子量肽含量减少。对比例14、15与实施例3相比，步骤S9中未添加益生菌剂或发酵产物。对比例19与实施例3相比，步骤S10中未添加缓释制剂。血糖、尿酸值明显升高，SOD含量明显减少，MDA含量明显提高，血脂指标明显升高。摄入足够的益生菌和益生元可以通过改善肠道菌群的组成、保持肠道完整性和促进肠道有益菌的生长而对宿主健康产生积极影响。乳杆菌和双歧杆菌可以抑制胰岛细胞的破坏，提高胰岛素的结合能力。乳杆菌可减少肾脏中某些糖基化产物的形成或积累。双歧杆菌可降低促炎因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)6、IL-1β水平，同时增加抗炎因子转化生长因子β(transforming growthfactor-β，TGF-β)和IL-10表达，TGF-β和IL-10可参与血管重塑，抑制炎症细胞聚集或泡沫细胞形成，从发挥抗炎症反应的作用。
对比例13与实施例3相比，未进行步骤S9。血糖、尿酸值明显升高，SOD含量明显减少，MDA含量明显提高，血脂指标明显升高。本发明通过将纤维素溶于离子液体中，加入丙烯酸单体，引发聚合后，制得了一种pH敏感型水凝胶，其三维网络中含有可离子化的基团，由于含有大量的-COOH基团的存在，使得其在高pH值环境下的溶胀度远远高于其在低pH值环境下的溶胀度，从而使得将益生菌以及活性肽包埋在水凝胶体系内，在胃部的酸性环境下，不会发生溶胀，而进入碱性的肠道环境中，迅速溶胀，释放益生菌、活性肽，起到很好的缓释包埋作用。
对比例16与实施例3相比，步骤S10中未添加益生元。血糖值升高，SOD含量减少，MDA含量提高，血脂指标升高。本发明还添加了益生元，包括低聚木糖、菊粉、抗性糊精，这些益生元到达肠道，积极促进肠道内益生菌发酵产生短链脂肪酸，为肠道营造酸性环境，起到抑制有害菌的生长，与益生菌协同作用，一同对肠道菌群平衡有促进作用，两者之间的协同效应使益生菌在肠道内获得优势，从而快速定植生长繁殖并成为优势菌。另外，菊粉还能促进益生菌产生的细菌素、有机酸、过氧化氢和铁载体等代谢产物，抑制肠道菌群中的不利菌群，预防细菌致病性定植，对竞争的肠道病原体发挥直接的抗菌作用。
对比例18与实施例3相比，步骤S10中未添加活性提取物。血糖、尿酸值升高，血脂指标升高。本发明活性提取物通过对苹果皮、葡萄皮采用乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂提取，得到活性提取物，其中，苹果皮提取物具有较好的降血脂、降尿酸和降血糖活性，对α-淀粉酶活力具有明显的抑制作用，还能抑制α-葡萄糖苷酶。葡萄皮提取物含有丰富的多羟基酚等物质，这两者具有很好的降血脂的功效，可抑制胰脂肪酶活性，抑制脂肪消化，还可以进一步降低血液中尿酸含量。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种调节代谢的益生菌组合物的制备方法，其特征在于，将大豆、角豆除去抗性物质后，采用复合蛋白酶酶解，得到豆类蛋白酶解产物；将葡萄、阿萨伊果水提取，过滤，滤渣为第一滤渣，滤液醇沉，得到活性多糖；将苹果皮、葡萄皮在乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中提取，过滤，滤渣为第二滤渣，滤液复合酶酶解，得到活性提取物，将第一滤渣、第一滤渣、豆类蛋白酶解产物、碳源制得培养基，接种活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液，发酵得到发酵产物，与益生菌剂混合，加入pH敏感型羟丙基甲基纤维素水凝胶中，冷冻干燥，与益生元、活性多糖、活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将大豆、角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入混合溶剂，加热回流处理，取出，洗净，干燥，打粉，得到豆粉；
S2.复合蛋白酶酶解：将步骤S1制得的豆粉加入水中，加入复合蛋白酶，酶解，灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
S3.活性多糖的提取：将葡萄、阿萨伊果混合，干燥，粉碎，加水沸腾提取，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇沉淀，过滤，洗涤，干燥，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将苹果皮、葡萄皮混合，干燥，粉碎，加入乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热提取，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，加入复合酶酶解，灭酶，得到活性提取物；
S5.培养基的制备：将步骤S3中的第一滤渣、步骤S4中的第二滤渣、步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、碳源加入水中，混合均匀，灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，发酵培养第一时间段，加入氯化镁和维生素B12，继续发酵第二时间段，得到发酵产物；
S7.益生元的制备：将低聚木糖、菊粉、抗性糊精混合均匀，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌混合均匀，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将离子液体融解成透明液体，加入羟丙基甲基纤维素混合均匀，加热至90-100℃，搅拌溶解，惰性气体保护下，冷却至50-55℃后，加入引发剂和丙烯酸，搅拌反应，加入步骤S6制得的发酵产物、步骤S8制得的益生菌剂，混合均匀，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将步骤S9制得的缓释制剂、步骤S7制得的益生元、步骤S3制得的活性多糖、步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述大豆、角豆的质量比5-10：1-3，所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为1-3:5-7:3-5，所述加热的时间为30-50min；步骤S2中所述复合蛋白酶选自木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味蛋白酶中的至少两种，优选地，为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:6-8，所述豆粉、复合蛋白酶的质量比为10:0.5-1，所述酶解的时间为2-4h，温度为40-45℃。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中所述葡萄、阿萨伊果的质量比为2-4:1-2，所述提取的时间为1-2h，提取的次数为2-3次，所述加入乙醇沉淀为加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80％，沉淀的时间为12-18h；步骤S4中所述苹果皮、葡萄皮的质量比为1-3:1-3，所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为3-5:2-4:4-6，所述加热提取的温度为60-70℃，时间为2-4h，所述浓缩液、复合酶的质量比为10-15:1-2，所述浓缩液的相对密度为1.05-1.12，所述复合酶选自羟丙基甲基纤维素酶、果胶酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶中的至少两种，优选地，为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:1-3；所述酶解的温度为35-45℃，时间为1-3h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5中所述第一滤渣、第二滤渣、豆类蛋白酶解产物、碳源的质量比为5-10:5-10:7-12:3-5，所述碳源选自葡萄糖、麦芽糖、果糖、异麦芽糖、阿拉伯糖、低聚果糖、木糖醇、可溶性淀粉中的至少一种；步骤S6中所述嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，50-70r/min，36-39℃，活化培养12-16h，得到含有108-109cfu/mL的菌种种子液，所述活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液的接种量分别为1-3％、0.5-1％、1-2％，所述发酵培养第一时间段的条件为50-70r/min，36-39℃，发酵培养24-36h，所述氯化镁和维生素B12的添加量分别为1-3g/L和2-4g/L，所述发酵第二时间段的条件为50-70r/min，36-38℃，发酵培养18-24h。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S7中所述低聚木糖、菊粉、抗性糊精的质量比为10:3-5:2-4；步骤S8中所述婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌、罗伊氏乳杆菌、副干酪乳杆菌的质量比为1-3:1-3:3-5:2-4。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S9中所述离子液体为1-丁基-3-甲基咪唑氯盐，所述离子液体、羟丙基甲基纤维素、引发剂、丙烯酸、发酵产物、益生菌剂的质量比为100:25-35:0.5-1:7-10:5-7:2-3，所述引发剂选自过硫酸钠、过硫酸铵、过硫酸钾中的至少一种；步骤S10中所述缓释制剂、益生元、活性多糖、活性提取物的质量比为10:1-3:2-4:3-5。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
S1.豆类的抗性物质去除：将5-10重量份大豆、1-3重量份角豆洗净，干燥，抛光后，置于容器上层筛网，容器中加入混合溶剂，加热回流30-50min，取出，洗净，干燥，打粉，得到豆粉；
所述混合溶剂为三乙胺、乙醇和乙酸乙酯的混合物，体积比为1-3:5-7:3-5；
S2.复合蛋白酶酶解：将10重量份步骤S1制得的豆粉加入水中，加入0.5-1重量份复合蛋白酶，40-45℃酶解2-4h，紫外线灭酶，得到豆类蛋白酶解产物；
所述复合蛋白酶为菠萝蛋白酶和胰蛋白酶的混合物，质量比为3-5:6-8；
S3.活性多糖的提取：将2-4重量份葡萄、1-2重量份阿萨伊果混合，干燥，粉碎，加水沸腾提取1-2h，提取2-3次，过滤，得到第一滤渣，留用，滤液中加入乙醇至体系中乙醇含量为70-80％，沉淀12-18h，过滤，洗涤，干燥，得到活性多糖；
S4.活性提取物的制备：将1-3重量份苹果皮、1-3重量份葡萄皮混合，干燥，粉碎，加入乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂，加热至60-70℃，提取2-4h，过滤，得到第二滤渣，留用，滤液浓缩，得到浓缩液，相对密度为1.05-1.12，向10-15重量份浓缩液中加入1-2重量份复合酶，35-45℃酶解1-3h，紫外线灭酶，得到活性提取物；
所述乙醇-水-乙酸乙酯混合溶剂中乙醇、水、乙酸乙酯的体积比为3-5:2-4:4-6；
所述复合酶为羟丙基甲基纤维素酶和木瓜蛋白酶，质量比为10:1-3；
S5.培养基的制备：将5-10重量份步骤S3中的第一滤渣、5-10重量份步骤S4中的第二滤渣、7-12重量份步骤S2制得的豆类蛋白酶解产物、3-5重量份碳源加入水中，搅拌混合10-15min，紫外线灭菌，得到培养基；
S6.发酵：将活化的嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌的菌种种子液接种至步骤S5制得的培养基中，接种量分别为1-3％、0.5-1％、1-2％，50-70r/min，36-39℃，发酵培养24-36h，加入氯化镁和维生素B12，添加量分别为1-3g/L和2-4g/L，50-70r/min，36-38℃，发酵培养18-24h，得到发酵产物；
活化方法为将菌种分别接种至高氏培养基中，50-70r/min，36-39℃，活化培养12-16h，得到含有108-109cfu/mL的菌种种子液；
S7.益生元的制备：将10重量份低聚木糖、3-5重量份菊粉、2-4重量份抗性糊精，搅拌混合5-10min，得到益生元；
S8.益生菌剂的混合：将1-3重量份婴儿双歧杆菌、1-3重量份动物双歧杆菌、3-5重量份罗伊氏乳杆菌、2-4重量份副干酪乳杆菌，搅拌混合5-10min，得到益生菌剂；
S9.缓释制剂的制备：将100重量份离子液体1-丁基-3-甲基咪唑氯盐融解成透明液体，加入25-35重量份羟丙基甲基纤维素，搅拌混合10-15min，加热至90-100℃，搅拌溶解，惰性气体保护下，冷却至50-55℃后，加入0.5-1重量份引发剂和7-10重量份丙烯酸，搅拌反应1-2h，加入5-7重量份步骤S6制得的发酵产物、2-3重量份步骤S8制得的益生菌剂，搅拌混合30-40min，冷却至室温，清水洗涤除去离子液体和杂质，冷冻干燥，得到缓释制剂；
S10.调节代谢的益生菌组合物的制备：将10重量份步骤S9制得的缓释制剂、1-3重量份步骤S7制得的益生元、2-4重量份步骤S3制得的活性多糖、3-5重量份步骤S4制得的活性提取物混合均匀，制得调节代谢的益生菌组合物。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的制备方法制得的调节代谢的益生菌组合物。
10.一种如权利要求9所述调节代谢的益生菌组合物在制备治疗及辅助治疗降血糖、降血压的产品中的应用。
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