CN108865959A

CN108865959A - 一种双歧杆菌复合剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108865959A
Application number: CN201810973314.8A
Authority: CN
Inventors: 张阳; 杨帆; 潘芬; 何慧玲; 湛剑龙
Original assignee: Connaught (wuhan) Biological Technology Co Ltd
Current assignee: Connaught (wuhan) Biological Technology Co Ltd
Priority date: 2018-08-24
Filing date: 2018-08-24
Publication date: 2018-11-23

Abstract

本发明涉及微生物复合制剂领域，提供一种双歧杆菌复合剂，制备原料包括双歧杆菌和蛋白酶解多肽；双歧杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸质量分数在5％以上。本发明研究表明，双歧杆菌和蛋白酶解多肽复配后，能够显著提高双歧杆菌的增强免疫力以及调节肠道菌群作用。在制备过程中，蛋白酶解多肽还能够起到促进双歧杆菌增殖、缩短发酵时间的作用以及冻干保护作用。

Description

一种双歧杆菌复合剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物复合制剂领域，具体涉及一种双歧杆菌复合剂及其制备方法和应用。

背景技术

双歧杆菌是人和动物肠道最主要的有益菌之一，对维持肠道的微生态平衡起着重要作用，研究证实双歧杆菌具有抗感染、抗肿瘤、增强免疫、延缓机体衰老等多种功效。随着年龄的增加，饮食及环境因素的变化，肠道菌群会呈现动态变化，研究表明，肠道中双歧杆菌只有在足够高活菌数的条件下才能发挥以上所述益生作用。现有的双歧杆菌制剂存在活菌数高，不够稳定，生产成本较高等问题，因而如何得到生产成本低、活菌数高、品质稳定且保存期长的菌粉成为一大难题。

发明内容

本发明为了解决现有技术中双歧杆菌制剂益生效果作用不够显著的问题，提供了一种双歧杆菌复合剂，其中的双歧杆菌与蛋白酶解多肽存在协同作用，能够显著提高双歧杆菌的益生效果。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种双歧杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；

所述双歧杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸质量分数在5％以上。

优选的，所述双歧杆菌选自乳双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌或青春双歧杆菌中的一种。

优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。

优选的，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。

优选的，所述用于制备蛋白酶解多肽的蛋白选自大豆、玉米、豌豆、小麦、鸡蛋清和鱼胶原蛋白中的一种或多种。

本发明提供了一种上述技术方案所述双歧杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将双歧杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；

(2)将所述一级种子液接种至种子培养基中厌氧培养24～36h，得到二级种子液；

(3)将所述二级种子液接入种子培养基中厌氧培养24～36h，得到三级种子液；

(4)将所述三级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，离心取沉淀，得到菌泥；

(5)将所述菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液；

按质量百分比计，所述冻干保护剂包括8～20％脱脂乳粉和1.5～6％蛋白酶解多肽和其余量的水；

(6)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到双歧杆菌复合剂。

优选的，所述步骤(1)～(3)中，所述种子培养基独立包括以下质量百分含量的组分：1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8。

优选的，步骤(3)所述含有蛋白酶解多肽的发酵培养基，按质量百分数计，包括0.15～0.6％蛋白酶解多肽、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。

优选的，步骤(5)中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比为1:0.0075～0.15；所述乳化包埋时间为15～50min。

本发明还提供了一种食品、药品、保健品或发酵剂，包括前述技术方案所述双歧杆菌复合剂和辅料。

与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下优点：

本发明提供了一种双歧杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；所述双歧杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；所述蛋白酶解多肽中多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸质量分数在5％以上。本发明研究表明，双歧杆菌和蛋白酶解多肽复配后，能够显著提高双歧杆菌在提高增强免疫力以及调节肠道菌群方面存在协同增效作用。

本发明研究表明，当蛋白酶解多肽中的多肽的质量含量在75％以上、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比不低于80％，并且含有天冬氨酸的质量百分数在1％以上，谷氨酸质量分数在5％以上时，才具有与双歧杆菌复配增效的作用，蛋白酶解多肽中不含有天冬氨酸、谷氨酸或者多肽含量不足、分布不足的不具备这一作用。

本发明还提供了一种双歧杆菌复合剂的制备方法，双歧杆菌经过三级种子培养基培养后得到三级培养液，将三级培养液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵培养，将高密度发酵培养得到的发酵液离心取沉淀得到菌泥，将菌泥与含有蛋白酶解多肽的冻干保护剂混合后乳化包埋、冷冻干燥，粉碎，即得双歧杆菌复合剂。本发明通过离心的方式去除了发酵培养液，离心沉淀得到的菌泥主要含有双歧杆菌。

在本发明中，发酵培养基中的蛋白酶解多肽起到刺激双歧杆菌生长，进而缩短发酵时间；冻干保护剂中的蛋白酶解多肽还能够对双歧杆菌起到保护作用，提高冷冻干燥后得到的活菌数、提高双歧杆菌复合剂的稳定性。即，本发明采用乳化包埋以及冷冻干燥的方式能够有效提高双歧杆菌复合剂的活菌数、提高保存时间。

本发明还提供了一种包括前述技术方案所述双歧杆菌复合剂和辅料的食品、药品、保健品或发酵剂，所述的食品、药品或保健品具有增强免疫力以及调节肠道菌群的作用；所述发酵剂可以有效缩短发酵时间。。试验表明，与单独施用双歧杆菌或蛋白酶解多肽相比，本发明所述的双歧杆菌复合剂在发挥增强免疫力以及调节肠道菌群等活性方面存在协同增效作用。

附图说明

图1为实施例4中不同培养基下双歧杆菌活菌数变化；

图2为实施例5中不同组别的小鼠巨噬细胞吞噬能力柱状图；

图3为实施例5中不同组别的小鼠NK细胞活性柱状图。

具体实施方式

所述双歧杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

本发明对所述双歧杆菌的来源无特殊限定，采用本领域已知的双歧杆菌即可，比如市售或自行分离均可。本发明优选的，所述双歧杆菌选自包括但不限于乳双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌或青春双歧杆菌中的一种。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽中所含的天冬氨酸的质量百分数在1％以上、谷氨酸质量分数在5％以上，则蛋白酶解多肽才具有与双歧杆菌复配协同增效的作用。同时还需要满足多肽含量以及相对分子量分布的条件，具体的，本发明所述蛋白酶解多肽中的多肽含量在75～95％，更优选为80～90％；本发明所述蛋白酶解多肽在相对分子量1000Da以下的分布比例不低于80％，更优选为85～99％。

本发明所述的蛋白酶解多肽具有抗氧化、降低三高、抑制有害菌生长的作用，本发明所述蛋白酶解多肽与双歧杆菌复配后能够提高双歧杆菌的益生活性，在增强免疫力以及调节肠道菌群等方面具有显著的协同增效作用。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽优选的选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶或胰蛋白酶中一种或多种酶解的产物。本发明对于所述蛋白酶解的具体条件无特殊限定，只要能够获得符合本发明所述条件的蛋白酶解多肽即可。

在本发明中，所述蛋白酶解多肽的酶解原料优选的选自大豆、玉米、豌豆、小麦、鸡蛋清和鱼胶原蛋白中的一种或多种；进一步优选的，本发明所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中的一种或多种酶，蛋白酶解多肽是指以上述任意一种或多种蛋白酶酶解大豆、玉米、豌豆、小麦、鸡蛋清和鱼胶原蛋白中一种或多种后得到的酶解产物，具体的可以为符合所述蛋白酶解多肽条件的大豆蛋白肽、玉米蛋白肽、豌豆蛋白肽、小麦蛋白肽、鸡蛋清蛋白肽和鱼胶原蛋白肽等。

本发明所述蛋白酶解多肽的重量以其干重计算，所述干重是指含水量在10％以下时的质量。本发明优选的，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。所述蛋白酶解多肽干粉可以由蛋白酶解液干燥得到，本发明对具体干燥方法无特殊限定。

在本发明中，所述双歧杆菌与蛋白酶解多肽的质量比优选为85～90:1.275～8.1，更优选为85～90:3～6。在本发明中，所述双歧杆菌与蛋白酶解多肽复配时，双歧杆菌的质量是指其菌体质量，所述双歧杆菌中活菌数至少为10¹⁰cfu/g。

在本发明中，所述双歧杆菌复合剂的有效活菌数更优选为8×10¹⁰cfu/g以上，更进一步优选为9×10¹⁰cfu/g～4×10¹¹cfu/g。

本发明提供的双歧杆菌复合剂中的有效活菌数高，双歧杆菌的益生活性强，具有显著的调节肠道菌群以及提高免疫力的作用。本发明提供的双歧杆菌复合剂可以在-18℃的条件下保存24个月，有效活菌数不会发生显著改变，稳定性好，保质期更长。

本发明还提供了一种上述技术方案所述双歧杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将双歧杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；

(6)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到双歧杆菌复合剂。

本发明将双歧杆菌菌种接种于种子培养基中活化，得到一级种子液；本发明对所述双歧杆菌菌种的接种量无特殊限定，蘸取菌种接种至种子培养基即可。本发明制备一级种子液的目的主要是为了活化菌种。

本发明所述的种子培养基作用为培养、活化菌种，促进双歧杆菌增殖，本发明对于所述种子培养基的组成没有特殊限定，优选的可以选择如下种子培养基：

按照质量百分数计，本发明所述种子培养基优选的包括1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8；优选的包括：1.5～2.5％乳糖、2～2.5％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.8％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.05％硫酸锰、0.7～0.9％吐温80和余量的水。

在本发明中，所述活化时间优选为24～36h，更优选为28～32h；所述活化温度优选为30～40℃，更优选为32～38℃。在本发明中，所述活化时为厌氧条件。

得到一级种子液后，本发明将一级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下培养24～36h，得到二级种子液。本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同，在此不再赘述。

在本发明中，所述一级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～10％(体积百分数)，更优选为4～8％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为30～40℃，更优选为32～36℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为24～36h，更优选为28～32h。本发明将二级种子液进行厌氧发酵是为了进一步扩大双歧杆菌的活菌数。

得到二级种子液后，本发明将二级种子液接种至种子培养基中在厌氧条件下培养24～36h，得到三级种子液。本发明采用的种子培养基与制备一级种子液时的相同，在此不再赘述。

在本发明中，所述二级种子液接种至种子培养基的接种量优选为2～10％(体积百分数)，更优选为4～8％(体积百分数)。在本发明中，所述厌氧培养温度优选为30～40℃，更优选为32～36℃。在本发明中，所述厌氧培养时间优选为24～36h，更优选为28～32h。本发明将三级种子液进行厌氧发酵是为了进一步扩大双歧杆菌的活菌数，为下一步高密度发酵做好准备。

得到三级种子液后，本发明将三级种子液接入含有蛋白酶解多肽的发酵培养基中进行高密度发酵，所得发酵液离心取沉淀，得到菌泥。本发明采用高密度发酵方式能够显著提高菌体密度，同时降低生产设备的成本，满足提高比生产率、降低生产成本、加快产品商品化进程的竞争需求。

在本发明所述的发酵培养基中添加蛋白酶解多肽，能够增强双歧杆菌对酸性环境的耐受能力，进而显著提高双歧杆菌的增殖。试验表明，添加了蛋白酶解多肽的发酵液在相同培养时间内双歧杆菌活菌数为不添加蛋白酶解多肽的发酵液中双歧杆菌活菌数的10～100倍。即，本发明所述蛋白酶解多肽在发酵培养基中起到增强双歧杆菌在酸性环境下的耐受力、促进双歧杆菌增殖、缩短发酵培养时间的作用。

按照质量分数计，本发明所述发酵培养基优选的包括0.15～0.6％蛋白酶解多肽、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0；优选的包括0.2～0.45％蛋白酶解多肽、2.5～4％乳糖、2～2.8％蛋白胨、1～2％酵母浸膏、0.4～0.7％无水乙酸钠、0.04～0.06％硫酸镁、0.03～0.07％硫酸锰、0.08～0.10％吐温80和余量的水。本发明提供的发酵培养基可适宜大规模工业化生产，满足高密度发酵时的微生物营养需求。

在本发明中，当发酵培养基中加入蛋白酶解多肽后，相对分子质量小的蛋白酶解多肽具有较高的溶解性和易消化吸收性能，这是蛋白酶解多肽发挥活性的前提条件，也是其优于普通蛋白质以及氨基酸的特性之一。蛋白酶解多肽在发酵培养基中能够为双歧杆菌提供生长所必须的氨基酸，还能够作为氮源为微生物提供能源；蛋白酶解多肽可被双歧杆菌直接利用，无需经过胞外蛋白酶酶解，能够直接有效地加快其生长进程；而且蛋白酶解多肽还能够提高益生菌的酸性环境下的耐受力，也能够促进双歧杆菌的增殖，提高其活菌数。

本发明通过对发酵培养基的优化，相对于常规的发酵培养基降低了价格较高的牛肉浸粉等培养基原料使用，能够有效地节约发酵成本。同时，发酵培养基中加入蛋白酶解多肽，能够有效加快双歧杆菌的生长周期，提高双歧杆菌的活菌数，节省达到目标活菌数的时间，从而节约发酵成本。

在本发明中，所述高密度发酵至发酵液中的活菌数达到10⁹cfu/mL以上时，即可停止发酵。本发明所述高密度发酵的发酵时间优选为16～24h。

本发明中所述发酵培养基相对于常规的发酵培养基，降低了价格较高的牛肉浸粉等培养基原料使用，能够有效地节约发酵成本。同时，发酵培养基中加入蛋白酶解多肽，能够有效加快双歧杆菌的生长周期，提高双歧杆菌的活菌数，节省达到目标活菌数的时间，从而节约发酵成本。

在本发明中，所述三级种子液接入发酵培养基的接种量优选为2～10％(体积百分比)，更优选为2～6％(体积百分比)。

在本发明中，所述高密度发酵的发酵温度优选为30～40℃，更优选为34～38℃。在本发明中，所述高密度发酵时优选的伴随搅拌，所述搅拌速率优选为80～200r/min，更优选为100～120r/min。

在本发明中，对高密度发酵得到的发酵液进行离心是为了获得较为纯净的菌体。在本发明中，所述离心转速优选为6000～10000r/min，更优选为8000r/min。在本发明中，所述离心时间优选为10～30min，更优选为15min。

得到菌泥后，本发明将菌泥与冻干保护剂混合后进行乳化包埋，得到乳化液。本发明将菌泥进行乳化包埋的目的在于保护双歧杆菌的活性，降低后续的冷冻干燥步骤对双歧杆菌活菌数和活性的影响。

按质量百分比计，本发明所述冻干保护剂包括包括8～20％脱脂乳粉和1.5～6％蛋白酶解多肽和其余量的水；更优选的包括10～15％脱脂乳粉和2.5～4％蛋白酶解多肽和余量的水。

在本发明中，冻干保护剂中的脱脂乳粉、海藻糖和糊精起到乳化包埋作用；蛋白酶解多肽则一方面属于双歧杆菌复合剂的有效成分，另一方面蛋白酶解多肽还能够起到冻干保护剂的作用，防止冷冻干燥对双歧杆菌的损伤。

在本发明中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比优选为1:0.0075～0.15，更优选为1:0.010～0.10，进一步优选为1:0.015～0.08。在本发明提供的质量比下，冻干保护剂中的蛋白酶解多肽可有效发挥冻干保护作用。

在本发明中，所述乳化包埋的温度优选为18～25℃，更优选为19～22℃。本发明对所述乳化方式无特殊限定，采用本领域已知的乳化方式即可，比如搅拌乳化。

本发明优选的，所述乳化时间优选为15～50min，更优选为20～40min。本发明乳化包埋是将双歧杆菌和蛋白酶解多肽包埋在脱脂乳等乳化包埋材料中，以增强其稳定性，也有利于保证最终产品的粒径均一。

得到乳化液后，本发明将乳化液冷冻干燥，再粉碎，得到双歧杆菌复合剂。本发明进行冷冻干燥的目的是为了去除产品的多余水分，提高成品稳定性；同时，将蛋白酶解多肽与双歧杆菌一同进行冷冻干燥有利于保持双歧杆菌的活性，使成品所含有效活菌数更高，还能够提高蛋白酶解多肽的活性。

在本发明中，所述冷冻干燥优选为真空冷冻干燥。在本发明中，所述冷冻干燥还包括预冷冻。所述预冷冻的温度优选为-35～-15℃，更优选为-20℃；预冷冻时间优选为0.5～3h，更优选为1～2h。在本发明中，所述冷冻干燥时间优选为25～40h，更优选为30h。

在本发明中，所述冷冻干燥后的粉碎是为了分散产品，使成品的粒度均一、混合均匀。本发明优选的，所述粉碎粒径为5～20目。所述制备得到的双歧杆菌复合剂为粉剂。

在本发明中，所述包括双歧杆菌复合剂的食品、药品或保健品具有增强免疫力以及调节肠道菌群的作用，其中双歧杆菌复合剂作为活性成分，能够提供增强免疫力以及调节肠道菌群的作用。

在本发明中，所述包括双歧杆菌复合剂的发酵剂具有缩短发酵时间的作用，发酵效率更高，并能够为发酵物提供增强免疫力以及调节肠道菌群功效。

本发明优选的，所述双歧杆菌复合剂在所述食品、药品、保健品或发酵剂中的含量为1～99％；更优选为30～50％。

在本发明中，所述药品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂或包衣剂。食品或保健品的形式包括但不限于片剂、粉剂、胶囊剂、颗粒剂、包衣剂、饮料、糕点、饼干、糖果、巧克力或果冻。本发明优选的，将包括所述双歧杆菌复合剂的食品制成休闲零食的各种形式。

本发明对于如何将双歧杆菌复合剂制成相应食品、药品、保健品或发酵剂无特殊限定，采用本领域已知的制剂制备方法即可。本发明对所述食品、药品、保健品或发酵剂中的辅料无特殊限定，采用本领域熟知的食品辅料、药品辅料以及保健品辅料即可。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

以质量分数计，种子培养基包括：乳糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，无水乙酸钠0.5％，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，吐温800.07％，其余量为水，pH值为6.2-6.8；

以质量分数计，发酵培养基包括：0.9％的大豆蛋白粉酶解液(以干重计，0.3％大豆蛋白酶解多肽)，2％的乳糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温-80，其余量为水；pH值为6.6-7.0；

以质量分数计，冻干保护剂包括：脱脂乳12％，大豆蛋白粉酶解液15％(以干重计，5％大豆蛋白酶解多肽)，其余量为水。

经检测，大豆蛋白酶解液中多肽的质量含量在92％、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比90％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在2.2％，谷氨酸质量分数在15.3％。

将长双歧杆菌接种于装有种子培养基的试管中，35℃、厌氧活化24h，得到一级种子液；按照体积比3％接种量，将一级种子液转接至种子培养基中，35℃厌氧培养24h，得到二级种子液；按照体积比3％接种量，将二级种子液接种到种子培养基中，34℃培养26h，得到三级种子液；将三级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，三级种子液接至发酵培养基中的接种量为5％，培养条件为36℃，厌氧培养16h，待发酵液中菌体密度达到10⁹cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌泥。按照菌泥质量与冻干保护剂中蛋白酶解多肽的质量比1:0.0075的比例，将菌泥与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，乳化时间20min，得到乳化液。将乳化液在-30℃下预冷冻1.5h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，温度为-40℃，真空度为0.20mbar；真空冷冻干燥至含水量小于5％后将其粉碎至15目，得到双歧杆菌复合剂，所得双歧杆菌复合剂的活菌数为9×10¹⁰cfu/g。

实施例2

以质量分数计，种子培养基包括：乳糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，无水乙酸钠0.5％，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，吐温800.1％、其余量为水，其余量为水，pH值为6.4～6.6；

以质量分数计，发酵培养基包括：0.75％的乳清蛋白酶解液(以干重计，0.3％乳清蛋白酶解多肽)，2％的乳糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温-80，其余量为水；pH值为6.5-7.0；

以质量分数计，冻干保护剂包括：脱脂乳12％，乳清蛋白酶解液15％(以干重计，6％乳清蛋白酶解多肽)，其余量为水。

经检测，乳清蛋白酶解液中多肽的质量含量在78％、所述蛋白酶解多肽中相对分子量1000Da以下的多肽的质量占比89％，所述蛋白酶解多肽中天冬氨酸的质量百分数在2.4％，谷氨酸质量分数在5.5％。

将乳双歧杆菌接种于装有种子培养基的试管中，32℃、厌氧活化28h，得到一级种子液；按照体积比2％接种量，将一级种子液转接至种子培养基中，36℃厌氧培养24h，得到二级种子液；按照体积比5％接种量，将二级种子液接种到种子培养基中，37℃培养28h，得到三级种子液；将三级种子液接入发酵培养基中进行高密度发酵，三级种子液接至发酵培养基中的接种量为6％，培养条件为33℃，厌氧培养24h，待发酵液中菌体密度达到10⁹cfu/mL，收集发酵液，离心获得菌泥。按照菌泥质量与冻干保护剂中蛋白酶解多肽的质量比1:0.022的比例，将菌泥与冻干保护剂混合，进行乳化包埋，乳化时间25min，得到乳化液。将乳化液在-16℃下预冷冻2h，将预冷冻后的乳化液进行真空冷冻干燥，温度为-42℃，真空度为0.17mbar；真空冷冻干燥至含水量小于5％后将其粉碎至10目，得到双歧杆菌复合剂，所得双歧杆菌复合剂的活菌数为1×10¹¹cfu/g。

实施例3

将低聚果糖、赤藓糖醇、水苏糖、清蛋白多肽和实施例1制备得到的双歧杆菌复合剂按4:3:1:1:1比例混合均匀，制得提高免疫力复合益生菌制剂，所得益生菌制剂中活菌数9×10⁹cfu/g，该益生菌制剂可以提高机体免疫。

实施例4

本次试验为了验证蛋白酶解多肽对双歧杆菌的发酵促进作用。

以质量分数计，种子培养基包括：乳糖2％，蛋白胨1％，酵母浸膏0.5％，无水乙酸钠0.5％，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，吐温800.05％-0.1％、其余量为水，pH6.4～6.6；

以质量分数计，发酵培养基包括：10％的大豆蛋白酶解液，2％的乳糖，1％的蛋白胨，0.5％的酵母浸膏，0.5％的无水乙酸钠，0.06％的七水硫酸镁，0.02％的一水硫酸锰，0.1％的吐温-80，其余量为水；pH值为6.6-7.0；采用的大豆蛋白酶解液与实施例1相同。

对照发酵培养基：除不含有大豆蛋白酶解液外，其他均相同。

取长双歧杆菌菌种接种于装有种子培养基的试管中，在37℃厌氧条件下活化36h，得到活化种子液，该活化种子液中的活菌数为5×10⁹cfu/mL。按照接种量5％的比例将活化种子液分别接种于发酵培养基和对照发酵培养基中，作为实验组和对照组。35℃厌氧培养，每4h测定一次活菌数。

结果如图1所示，随着发酵时间的延长，实验组中的长双歧杆菌活菌数显著高于对照组，表明本发明在发酵培养基中添加蛋白酶解多肽有助于提高双歧杆菌的发酵速率，提高发酵活菌数，进而缩短发酵周期。

对比例

除发酵培养基和冻干保护剂中不含有大豆蛋白酶解多肽外，其他均与实施例1步骤相同，制备得到对照双歧杆菌菌剂。

实施例5

本次试验为了验证本发明提供的双歧杆菌复合剂的提高免疫力作用。

1)试验材料：

选取SPF级雌性BALB/c小鼠，购自中国食品药品检定研究院。

饲养条件：温度23℃±1℃，昼夜光照交替12h，自由饮食及摄水。

2)试验方法：

将BALB/c小鼠分为2个对照组及1个实验组，每组10只鼠，其中

对照组1：每天灌胃0.2mL无菌生理盐水，

对照组2：按照活菌数1×10⁸cfu:0.2mL的比例，将对比例1制备得到的对照双歧杆菌菌剂与无菌生理盐水混合，每日灌胃0.2mL；

实验组：按照活菌数1×10⁸cfu:0.2mL的比例，将实施例2制备得到的双歧杆菌复合剂与无菌生理盐水混合，每日灌胃0.2mL。

3)测定方法：

每组连续灌胃28天，并于灌胃结束后，处死小鼠，摘取胸腺和脾脏，并收集血液，分别测定小鼠免疫脏器指数、巨噬细胞吞噬能力及NK细胞活性。

①小鼠免疫脏器指数测定

于试验结束28天时处死小鼠，摘取胸腺和脾脏，吸取表面粘液后进行称重，试验结果以平均值表示。

胸腺指数＝m₁/M

脾脏指数＝m₂/M

其中：m₁:胸腺重量(mg)，m₂:脾脏重量(mg)，M:小鼠体重(g)。

②小鼠巨噬细胞吞噬能力测定

BALB/c小鼠灌胃28天后处死，摘取脾脏，制成脾脏悬液(浓度1×10⁶个/mL)，加入至96孔细胞培养板中，每孔加入200μL，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养2h，弃去上清及未贴壁细胞，PBS洗2次得巨噬细胞。加入RPMI1640培养液，每孔加入200μL，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养4h，弃去培养液，加入0.072％中性红溶液，每孔加入100μL，反应30min后弃去中性红溶液。PBS清洗2次后，加入细胞溶解，4℃过夜，待细胞完全溶解后，酶标仪570nm处测定吸光值。

③小鼠NK细胞活性测定

采用乳酸脱氢酶(LDH)测定法

靶细胞传代培养(YAC-1细胞)：实验前24h将靶细胞进行传代培养。用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。

脾细胞悬液的制备(效应细胞)：取小鼠脾脏，制备单细胞悬液，过滤洗涤离心去上清，重悬后用1％冰醋酸稀释后计数，用台酚蓝染色计数活细胞数，用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度2×10⁷个/mL。

NK细胞活性检验：取靶细胞和效应细胞各100μL，加入96孔培养板，靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100μL，设3各平行孔于37℃，5％CO₂培养箱中4h，96孔板以1500r离心5min，每孔吸取上清100μL置平底96孔培养板中，加LDH基质液100μL，根据室温不同反应3-10min，每孔加1mol/L盐酸30μL，酶标仪490nm处测吸光值。

NK细胞活性％＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100％。

4)实验结果

①小鼠免疫脏器指数测定结果

表1 小鼠免疫脏器指数测定结果

注：与空白对照组比，*表示p＜0.05

由表1可以看出，与对照组1、2相比，BALB/c小鼠在灌胃本发明提供的双歧杆菌复合剂后能显著提高小鼠免疫器官胸腺指数与脾脏指数。

②小鼠巨噬细胞吞噬能力测定结果

测定结果如图2所示，可以看出，与对照组1相比，对照组2、实验组小鼠的脾脏巨噬细胞吞噬能力有显著提高，表明双歧杆菌菌粉以及本发明制备的双歧杆菌复合剂均具有显著提高脾脏巨噬细胞吞噬能力的作用。还可以看出，实验组的脾脏巨噬细胞吞噬能力相对于对照组2有显著提升，表明本发明将双歧杆菌与蛋白酶解多肽复配能够有效提高双歧杆菌的提高免疫作用，增强益生活性。

③小鼠NK细胞活性测定

测定结果如图3所示，可以看出，与对照组1、2相比，实验组小鼠的NK细胞杀伤活力有显著提高，表明，本发明提供的双歧杆菌复合剂具有显著提高NK细胞杀伤活力的作用，进而能够提高机体的非特异性免疫功能。

综上，本发明提供的双歧杆菌复合剂具有显著的提高机体非特异性免疫作用，本发明将双歧杆菌与蛋白酶解多肽复配后具有协同作用，能够增强双歧杆菌的提高免疫作用。

综合实施例4～5可以看出，本发明提供的双歧杆菌复合剂的提高免疫力作用更为显著，即双歧杆菌与本发明所述蛋白酶解多肽复配后起到了协同增效作用，有效提高了双歧杆菌复合剂的益生作用。还可以看出，蛋白酶解多肽具有提高双歧杆菌发酵时的活菌数、降低发酵时间的作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种双歧杆菌复合剂，制备原料包括以下重量份的组分：双歧杆菌85～90份和蛋白酶解多肽0.6～16.2份；所述蛋白酶解多肽的重量以干重计；

所述双歧杆菌复合剂中所含活菌数在10¹⁰cfu/g以上；

2.根据权利要求1所述的双歧杆菌复合剂，其特征在于，所述双歧杆菌选自乳双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌或青春双歧杆菌中的一种。

3.根据权利要求1所述的双歧杆菌复合剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自蛋白酶解液或蛋白酶解多肽干粉。

4.根据权利要求1或3所述的双歧杆菌复合剂，其特征在于，所述蛋白酶解多肽选自碱性蛋白酶、中性蛋白酶和胰蛋白酶中一种或多种酶解蛋白的产物。

5.根据权利要求4所述的双歧杆菌复合剂，其特征在于，所述用于制备蛋白酶解多肽的蛋白选自大豆、玉米、豌豆、小麦、鸡蛋清和鱼胶原蛋白中的一种或多种。

6.权利要求1～5任意一项所述双歧杆菌复合剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)将双歧杆菌接种至种子培养基中活化，得到一级种子液；

(6)将得到的乳化液冷冻干燥，粉碎，得到双歧杆菌复合剂。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)～(3)中，所述种子培养基独立包括以下质量百分含量的组分：1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.1％吐温80和余量的水，pH值独立为6.2～6.8。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述含有蛋白酶解多肽的发酵培养基，按质量百分数计，包括0.15～0.6％蛋白酶解多肽、1～3％乳糖、1～3％蛋白胨、0.5～3％酵母浸膏、0.2～1％无水乙酸钠、0.02～0.08％硫酸镁、0.02～0.08％硫酸锰、0.05～0.15％吐温80和余量的水，pH值为6.2～7.0。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述菌泥与冻干保护剂中的蛋白酶解多肽的质量比为1:0.0075～0.15；所述乳化包埋时间为15～50min。

10.一种食品、药品、保健品或发酵剂，包括权利要求1～5任意一项所述双歧杆菌复合剂和辅料。