CN109280630A - 一种嗜酸乳酸杆菌活菌制剂的生产方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制剂领域，涉及一种益生菌制剂生产方法，具体涉及一种嗜酸乳酸杆菌固态制剂生产方法，通过优化菌种活化、培养的条件，并将活化后的菌种与相应的含琼脂固体培养基混合、凝固后进行保存，保证固态制剂中菌种的活力，避免长期储存过程中嗜酸乳酸杆菌因干燥而逐渐失活。本发明提供的嗜酸乳杆菌固态制剂制备方法制备得到的嗜酸乳杆菌活菌制剂具有更高的活性，在制备提高人体免疫力的产品中具有广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于生物制剂领域，涉及一种益生菌制剂生产方法及其应用，具体涉及一种嗜酸乳酸杆菌固态制剂生产方法及其应用。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制，是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)。处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。正常机体在免疫系统的作用下，突变的细胞会被抑制和分解。但对于免疫力低下的人群来说，由于免疫活性细胞不能识别突变细胞，致使突变细胞无序繁殖，最终导致疾病产生。特别是儿童，由于其生理结构和功能发育的不完善，更容易受到环境病原体及家长为了“预防感染”而给孩子使用抗生素所带来的不良影响，需要借助外来的免疫制剂来提高对某些疾病的抵抗能力。因此，提高身体免疫力，预防生物性因子或变态反应感染，找到副作用少的较安全的微生态食品，已成为当今迫切解决的一个话题。
益生菌是利用葡萄糖等碳水化合物时能产生乳酸的一类细菌。益生菌有一个共同特征，就是在有氧和无氧条件下都能生长，即它们多是兼性厌氧菌。益生菌与人类关系十分密切，其是人体肠道中最重要的有益菌群，对人体的营养、免疫、保健，甚至抗衰老、长寿都有重要作用。人体肠道内益生菌的比例越高，微生态环境就越好，肠道就越显年轻有活力。正常情况下，儿童体内益生菌占优势，控制住坏菌处于健康状态，若生病、滥用药物等，益生菌的优势地位就要受到威胁，导致食欲下降、消化吸收功能差、体弱消瘦、抵抗力下降，若肠道内有益菌数量不能及时恢复，有害菌就会乘机繁殖，使儿童反复生病。因此，及时补充益生菌，可以帮助提高抵抗力。合理有效的益生菌制剂能够有效修复肠道菌群生态系统平衡。
嗜酸乳酸杆菌是一类G+杆菌，杆的末端呈圆形，大小为0.6-0.9×1.5×1.6μm，以单个、成对或短链形式存在，不运动，无鞭毛，无芽孢，过氧化氢酶阴性，不产生细胞色素。嗜酸乳酸杆菌是微需氧菌，无氧或较低的氧分压环境下在固态基质表面生长，5％-10％的二氧化碳可促进嗜酸乳酸杆菌的增殖。1922年Cheplin和Rettger报道了嗜酸乳酸杆菌可以在肠道中存活和定植，是人体肠道重要的益生菌。研究表明嗜酸乳杆菌对食物中滋生的肠道病原菌有拮抗作用，可以稳定正常的肠道微生物区系，具有抗癌作用，能降低血清胆固醇。
传统的固态益生菌制剂中益生菌由于干燥极易死亡，且不能长期保存，从而丧失利用价值。而且其价格昂贵，生产工艺要求高，制作方法复杂，保存条件要求较高。嗜酸乳酸杆菌对胃肠道菌群生态平衡具有重要意义，是生命健康保证的润滑剂，因此，提供一种制作简单、储存使用方便、成本低廉、不含任何有害添加成分的嗜酸乳酸杆菌固态制剂是其推广应用的基本要求和保障。
专利申请CN107752040A公开了一种促进婴幼儿机体免疫力的复合益生菌粉制剂，筛选出5种益生菌婴儿双歧杆菌、动物双歧杆菌V9、保加利亚乳杆菌PZLB5、植物乳杆菌PP12和嗜热链球菌QH，并分别对其培养基和培养条件进行优化，利用菌种之间的独特协同作用，实现增强免疫细胞活性，提高婴幼儿免疫力的目的。但是该专利使用的上述5种菌种分离筛选过程复杂，生产成本高，给消费者带来极大的经济负担。专利申请CN105641209A公开了一种提高免疫力的益生菌组合物，其包括益生菌干粉、黄芪提取物粉、枸杞提取物粉，并辅以维生素K，维生素B12、吡哆醇、生物素、叶酸、烟酸和硫胺素等营养成分，利用传统中药与益生菌合理配伍用药，协同发挥作用，显著提高免疫力，促进机体健康。但是中药中成分复杂，不免存在一些成分会导致益生菌失活而降低疗效。
益生元是指不易被消化的食品成分，通过选择性的刺激一种或几种细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响，从而改善寄主健康的物质。益生元给益生菌提供“食物”,能够被肠道内有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖。专利申请CN105707863A公开了一种降血脂医学配方食品，将中药提取物精华及新资源食品、益生菌、短肽为主要原料，以益生元、碳水化合物、氨基酸、有保健功能的油脂、多种维生素、多种矿物质为辅料制成的医学配方食品，能够显著降低患者血脂水平。
利用益生菌开发的产品日益增多，多以提高免疫力为主要功效，甚至有降低血脂、治疗高血压等多种作用，但是如何保证益生菌的活力以及在体内的定植效率，并从根本上解决炎症引起的免疫力低下的问题，是目前亟需解决的问题。
发明内容
基于上述现有技术的缺陷，本发明通过优化菌种活化、培养的条件，并将活化后的菌种与相应的含琼脂固体培养基混合、凝固后进行保存，保证固态制剂中菌种的活力，避免长期储存过程中嗜酸乳酸杆菌因干燥而逐渐失活。
本发明提供一种嗜酸乳酸杆菌的固态制剂制备方法，包括以下步骤：
(1)配制含琼脂MRS培养基：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、琼脂，加蒸馏水定容，分装于试管中，高压灭菌后倾斜防止，形成斜面培养基，备用；
(2)制作牛肉疱肉管：称取碎牛肉，加蒸馏水和氢氧化钠煮沸，冷却后过滤，碎肉渣备用；上清液加入牛肉浸液、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钠、葡萄糖、可溶性淀粉，得液体培养基；碎肉渣分装于试管中，加入还原铁粉，将液体培养基分装至试管管内，覆盖溶化的凡士林或液体石蜡，高压灭菌，备用；
(3)配制番茄汁培养基：番茄汁、酵母抽提液、肉膏、乳糖、葡萄糖、K2HPO4、吐温80、乙酸钠；另制置番茄汁固体培养基中加入琼脂；
(4)嗜酸乳杆菌活化及培养：嗜酸乳杆菌SL9404接种于琼脂MRS斜面培养基上划线传代培养，然后转种接入牛肉疱肉管，再转入番茄汁培养基发酵培养，逐步放大，最后转入番茄汁固体培养基，并分装至不同形状的固体制剂模具，室温冷却，即得。
进一步地，所述嗜酸乳杆菌固体制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)配制含琼脂MRS培养基：按照重量份数计，称取蛋白胨8-12份、牛肉膏8-12份、酵母膏4-6份、柠檬酸氢二铵1-3份、葡萄糖18-23份、吐温80 0.5-2份、乙酸钠4-6份、磷酸氢二钾1-3份、硫酸镁0.4-0.6份、硫酸锰0.2-0.3份、琼脂16-20份，加蒸馏水至800-1200份，分装于试管中，高压灭菌后倾斜防止，形成斜面培养基，备用；
(2)制作牛肉疱肉管：按照重量份数计，称取碎牛肉400-600份，加蒸馏水800-1200份和氢氧化钠溶液20-30份，煮沸10-20min，冷却后过滤，碎肉渣备用；上清液加入牛肉浸液800-1200份、蛋白胨25-35份、酵母膏4-6份、磷酸二氢钠4-6份、葡萄糖2-4份、可溶性淀粉1-3份，调节pH7.6-8.0，得液体培养基；碎肉渣分装于试管中，加入还原铁粉0.1-0.2份，将液体培养基分装至试管管内，超过肉渣表面0.8-1.5cm，覆盖溶化的凡士林或液体石蜡0.3-0.4cm，高压灭菌，备用；
(3)配制番茄汁培养基：按照重量份数计，番茄汁40-60份、酵母抽提液4-6份、肉膏8-12份、乳糖18-23份、葡萄糖1.5-2.5份、K2HPO4 1.5-2.5份、吐温80 0.5-1.5份、乙酸钠4-6份，水加至800-1200份，调节pH至6.6-7.0；另配置番茄汁固体培养基中加入14-18份琼脂；
(4)嗜酸乳杆菌活化及培养：嗜酸乳杆菌SL9404接种于琼脂MRS斜面培养基上划线传代培养2-3次，经37±1℃培养46-50h，然后转种接入牛肉疱肉管，37±1℃培养20-50h。取1-4支疱肉管转入番茄汁培养基，37±1℃培养8-48h发酵培养，逐步放大培养，转入番茄汁固体培养基，并分装至不同形状的固体制剂模具，室温冷却，即得。
本发明进一步提供上述嗜酸乳杆菌固态制剂制备方法制备得到的嗜酸乳杆菌固态制剂。
本发明进一步提供上述嗜酸乳杆菌制剂在制备提高免疫力的食品中的应用。
基于上述现有技术的缺陷，本发明将益生菌、益生元、中药、真菌、免疫球蛋白、肽类物质、维生素有机地结合到一起，利用益生元增强益生菌的生长繁殖，同时起到保护益生菌的作用，防止中药中多种成分对益生菌活性的破坏作用，而免疫球蛋白、真菌及肽类物质三者起效快，优先起效，初步提高儿童免疫力，有利于益生菌、益生元和中药更快、更有效的发挥作用，最后再辅以维生素巩固，实现长效、从根本上提高儿童免疫力。
本发明提供一种提高儿童免疫力的益生菌组合物，由益生菌、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、甘草、酸浆、茯苓、香菇、牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、脱脂乳粉、木糖醇组成。
进一步地，所述益生菌选自嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的一种或多种。
进一步地，所述益生菌组合物，由下述重量重量份的原料组成，嗜热链球菌0.5-1份、嗜酸乳杆菌0.5-5份、保加利亚乳杆菌0.5-1份、鼠李糖乳杆菌0.5-5份、乳双歧杆菌0.5-5份、长双歧杆菌0.5-1份、甘草1-5份、酸浆1-5份、茯苓5-10份、香菇5-10份、牛初乳粉2-10份、清蛋白多肽2-10份、针叶樱桃粉1-5份、低聚异麦芽糖5-15份、低聚果糖1-5份、水苏糖1-10份、木糖醇1-15份、脱脂乳粉10-30份。
更进一步地，所述益生菌组合物，由下述重量份的原料组成，嗜热链球菌0.5-1份、嗜酸乳杆菌1-3份、保加利亚乳杆菌0.5-1份、鼠李糖乳杆菌1-3份、乳双歧杆菌2-4份、长双歧杆菌0.5-1份、甘草1-3份、酸浆2-4份、茯苓5-8份、香菇5-10份、牛初乳粉3-8份、清蛋白多肽4-8份、针叶樱桃粉3-5份、低聚异麦芽糖10-15份、低聚果糖1-5份、水苏糖3-10份、木糖醇5-15份、脱脂乳粉17-25份。
更进一步地，所述益生菌组合物，由下述重量百分含量的原料组成，嗜热链球菌1份、嗜酸乳杆菌2份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌2份、乳双歧杆菌3份、长双歧杆菌0.5份、甘草2份、酸浆4份、茯苓6份、香菇6份、牛初乳粉5份、清蛋白多肽6份、针叶樱桃粉5份、低聚异麦芽糖15份、低聚果糖5份、水苏糖10份、木糖醇10份、脱脂乳粉17份。
本发明进一步提供上述组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别提取甘草、酸浆、茯苓和香菇；
(2)将嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、脱脂乳粉、木糖醇与步骤(1)得到的提取物混合，即得。
进一步地，所述甘草、酸浆、茯苓和香菇的提取方法包括以下步骤：甘草、酸浆、茯苓和香菇分别加水回流浸提，提取液浓缩、干燥即得甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物。
进一步地，所述甘草的提取方法包括以下步骤：甘草加13-18倍水，于50-60℃回流浸提2-4h，提取2-4次，合并提取液，浓缩，干燥即得甘草提取物。
进一步地，所述茯苓的提取方法包括以下步骤：茯苓加18-23倍水，于50-60℃回流浸提2-4h，提取2-4次，合并提取液，浓缩，干燥即得茯苓提取物。
进一步地，所述酸浆的提取方法包括以下步骤：酸浆加50-60倍水，于80-100℃回流浸提2-4h，提取2-4次，合并提取液，浓缩，干燥即得酸浆提取物。
进一步地，所述香菇的提取方法包括以下步骤：香菇加18-23倍水，于80-100℃回流浸提1-3h，提取1-3次，合并提取液，浓缩，干燥即得香菇提取物。
更进一步地，所述甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物混合，粉碎，过60-80目筛。
更进一步地，所述甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物混合膏粉的含水量为3.5-4.0％。
进一步地，将甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物进行微粉化处理后再与其他组分混合。
更进一步地，所述微粉化处理采用超微粉碎技术进行微粉化，将甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物制成粒径为5-15μm细粉。
进一步地，所述超微粉碎技术选自机械粉碎、振动粉碎、气流粉碎、超声粉碎、高压研磨。
更进一步地，所述超微粉碎技术为气流粉碎技术。
进一步地，将步骤(2)中嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌5种益生菌制备为混悬液后进行微胶囊化处理，可以避免胃酸以及中药提取物中的有机酸等成分破坏益生菌的活性。
所述益生菌混悬液按照常规方法制备得到。
更进一步地，所述微胶囊化的制备方法包括以下步骤：
(1)海藻酸钠与麦芽糊精溶解在去离子水中，与益生菌混悬液混合均匀，形成第一层微胶囊；
(2)水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精混合后，与步骤(1)的第一层微胶囊混合均匀，形成第二层微胶囊，即得。
更进一步地，所述微胶囊化的制备方法包括以下步骤：
(1)将海藻酸钠与麦芽糊精按照质量比为1:8-9溶解于去离子水中，形成质量百分浓度为22-30％的溶液，然后与益生菌混悬液按照体积比为2-3:1混合均匀，搅拌反应5-8h，喷雾干燥，形成第一层微胶囊；
(2)将水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精按照质量比为1:2-4:8-9混合均匀后，加入步骤(1)的第一层微胶囊，搅拌反应5-8h，喷雾干燥，形成第二层微胶囊，即得。
本发明还提供上述益生菌组合物在制备提高免疫力食品中的应用。
进一步地，所述食品为益生菌固态饮料。
本发明的有益效果是：
(1)本发明将益生菌、益生元、中药、真菌、免疫球蛋白、肽类物质、维生素有机地结合到一起，建立了一种增强人体免疫力的新方法，开发出了具有抗感染作用的儿童益生菌新产品。其中益生菌可促进肠道消化，加速新陈代谢，以菌治菌，而益生元可促进益生菌增殖，保护益生元不被外界因素破坏，进一步提高人体免疫力；免疫球蛋白、真菌及肽类物质三者起效快，具有免疫活性，能够精准调节免疫系统；中药是重要的免疫调节剂，能够有效的预防及治疗机体气血不足或脏器虚损所引起的各种症状，“治未病”的保健长效机能充分显现出来；最后辅以针叶樱桃中富含的维生素C巩固，充分发挥协同增效作用，相得益彰，大大提高了人体免疫力，预防儿童感染类疾病，消除炎症因子所带给身体的不良反应，提高身体抵抗能力。
(2)本发明在制备过程中将中药和真菌提取后进行微粉化，大大提高了机体对其的吸收利用。同时由于中药提取物中成分复杂，存在的有机酸等物质会破话益生菌的活性，因此，本发明还将益生菌进行微胶囊化制备，同时辅以益生元保护，有效避免胃酸以及中药中有机酸物质破坏益生菌活性，同时在益生元的保护下，进一步促进益生菌在肠道内的繁殖与定植能力。
具体实施方式
实施例1甘草、香菇、酸浆、茯苓的提取
甘草加15倍水，于55℃回流浸提3h，提取3次，合并提取液，浓缩，干燥即得甘草提取物。
茯苓加20倍水，于60℃回流浸提3h，提取3次，合并提取液，浓缩，干燥即得茯苓提取物。
酸浆加55倍水，于90℃回流浸提3h，提取3次，合并提取液，浓缩，干燥即得酸浆提取物。
香菇加20倍水，于90℃回流浸提2h，提取2次，合并提取液，浓缩，干燥即得香菇提取物。
实施例2甘草、香菇、酸浆、茯苓的提取
甘草加13倍水，于50℃回流浸提4h，提取4次，合并提取液，浓缩，干燥即得甘草提取物。
茯苓加23倍水，于50℃回流浸提2h，提取2次，合并提取液，浓缩，干燥即得茯苓提取物。
酸浆加60倍水，于100℃回流浸提4h，提取4次，合并提取液，浓缩，干燥即得酸浆提取物。
香菇加18倍水，于80℃回流浸提1h，提取3次，合并提取液，浓缩，干燥即得香菇提取物。
实施例3甘草、香菇、酸浆、茯苓的提取
甘草加18倍水，于60℃回流浸提2h，提取2次，合并提取液，浓缩，干燥即得甘草提取物。
茯苓加18倍水，于55℃回流浸提4h，提取4次，合并提取液，浓缩，干燥即得茯苓提取物。
酸浆加50倍水，于80℃回流浸提2h，提取2次，合并提取液，浓缩，干燥即得酸浆提取物。
香菇加18倍水，于100℃回流浸提3h，提取1次，合并提取液，浓缩，干燥即得香菇提取物。
实施例4益生菌组合物及其制备
所述益生菌组合物由下述重量份组分组成：嗜热链球菌1份、嗜酸乳杆菌2份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌2份、乳双歧杆菌3份、长双歧杆菌0.5份、甘草2份、酸浆4份、茯苓6份、香菇6份、牛初乳粉5份、清蛋白多肽6份、针叶樱桃粉5份、低聚异麦芽糖15份、低聚果糖5份、水苏糖10份、木糖醇10份、脱脂乳粉17份。
具体制备方法为：
(1)将实施例1制备得到的甘草、香菇、酸浆、茯苓提取物混合、粉碎、过80目筛、然后通过流粉碎技术制成粒径为5-15μm细粉；
(2)将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌分别制成混悬液；将海藻酸钠与麦芽糊精按照质量比为1:8溶解于去离子水中，形成质量百分浓度为25％的溶液，然后与益生菌混悬液按照体积比为3:1分别混合均匀，搅拌反应5h，喷雾干燥，形成第一层微胶囊；将水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精按照质量比为1:3:8混合均匀后，分别加入各益生菌的第一层微胶囊，搅拌反应5h，喷雾干燥，形成第二层微胶囊，即得嗜热链球菌微胶囊、嗜酸乳杆菌微胶囊、保加利亚乳杆菌微胶囊、鼠李糖乳杆菌微胶囊、乳双歧杆菌微胶囊、长双歧杆菌微胶囊，混合即得益生菌微胶囊；
(3)将步骤(2)的益生菌微胶囊与牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇、脱脂乳粉以及步骤(1)的甘草、香菇、酸浆、茯苓微粉化粉末混合，即得。
实施例5益生菌组合物及其制备
所述益生菌组合物由下述重量份组分组成：嗜热链球菌0.5份、嗜酸乳杆菌0.5份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌0.5份、乳双歧杆菌0.5份、长双歧杆菌1份、甘草1份、酸浆1份、茯苓5份、香菇5份、牛初乳粉2份、清蛋白多肽4份、针叶樱桃粉3份、低聚异麦芽糖10份、低聚果糖1份、水苏糖3份、木糖醇15份、脱脂乳粉46.5份。
具体制备方法为：
(1)将实施例2制备得到的甘草、香菇、酸浆、茯苓提取物混合、粉碎、过80目筛、然后通过流粉碎技术制成粒径为5-15μm细粉；
(2)将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌分别制成混悬液；将海藻酸钠与麦芽糊精按照质量比为1:9溶解于去离子水中，形成质量百分浓度为22％的溶液，然后与益生菌混悬液按照体积比为2:1分别混合均匀，搅拌反应8h，喷雾干燥，形成第一层微胶囊；将水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精按照质量比为1:2:9混合均匀后，分别加入各益生菌的第一层微胶囊，搅拌反应8h，喷雾干燥，形成第二层微胶囊，即得嗜热链球菌微胶囊、嗜酸乳杆菌微胶囊、保加利亚乳杆菌微胶囊、鼠李糖乳杆菌微胶囊、乳双歧杆菌微胶囊、长双歧杆菌微胶囊，混合即得益生菌微胶囊；
(3)将步骤(2)的益生菌微胶囊与牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇、脱脂乳粉以及步骤(1)的甘草、香菇、酸浆、茯苓微粉化粉末混合，即得。
实施例6益生菌组合物及其制备
所述益生菌组合物由下述重量份组分组成：嗜热链球菌0.8份、嗜酸乳杆菌5份、保加利亚乳杆菌1份、鼠李糖乳杆菌3份、乳双歧杆菌4份、长双歧杆菌0.8份、甘草5份、酸浆2份、茯苓10份、香菇10份、牛初乳粉10份、清蛋白多肽10份、针叶樱桃粉1份、低聚异麦芽糖5份、低聚果糖5份、水苏糖10份、木糖醇5份、脱脂乳粉12.4份。
具体制备方法为：
(1)将实施例1制备得到的甘草、香菇、酸浆、茯苓提取物混合、粉碎、过80目筛、然后通过流粉碎技术制成粒径为5-15μm细粉；
(2)将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌分别制成混悬液；将海藻酸钠与麦芽糊精按照质量比为1:8溶解于去离子水中，形成质量百分浓度为30％的溶液，然后与益生菌混悬液按照体积比为2:1分别混合均匀，搅拌反应6h，喷雾干燥，形成第一层微胶囊；将水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精按照质量比为1:4:8混合均匀后，分别加入各益生菌的第一层微胶囊，搅拌反应7h，喷雾干燥，形成第二层微胶囊，即得嗜热链球菌微胶囊、嗜酸乳杆菌微胶囊、保加利亚乳杆菌微胶囊、鼠李糖乳杆菌微胶囊、乳双歧杆菌微胶囊、长双歧杆菌微胶囊，混合即得益生菌微胶囊；
(3)将步骤(2)的益生菌微胶囊与牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇、脱脂乳粉以及步骤(1)的甘草、香菇、酸浆、茯苓微粉化粉末混合，即得。
实施例7益生菌组合物及其制备
所述益生菌组合物由下述重量份组分组成：嗜热链球菌1份、嗜酸乳杆菌3份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌5份、乳双歧杆菌2份、长双歧杆菌0.5份、甘草3份、酸浆5份、茯苓8份、香菇6份、牛初乳粉8份、清蛋白多肽2份、针叶樱桃粉4份、低聚异麦芽糖12份、低聚果糖3份、水苏糖1份、木糖醇1份、脱脂乳粉35份。
具体制备方法为：
(1)将实施例3制备得到的甘草、香菇、酸浆、茯苓提取物混合、粉碎、过60目筛、然后通过流粉碎技术制成粒径为5-15μm细粉；
(2)将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌分别制成混悬液；将海藻酸钠与麦芽糊精按照质量比为1:8溶解于去离子水中，形成质量百分浓度为30％的溶液，然后与益生菌混悬液按照体积比为3:1分别混合均匀，搅拌反应5h，喷雾干燥，形成第一层微胶囊；将水溶性变性淀粉、大豆蛋白和麦芽糊精按照质量比为1:3:8混合均匀后，分别加入各益生菌的第一层微胶囊，搅拌反应5h，喷雾干燥，形成第二层微胶囊，即得嗜热链球菌微胶囊、嗜酸乳杆菌微胶囊、保加利亚乳杆菌微胶囊、鼠李糖乳杆菌微胶囊、乳双歧杆菌微胶囊、长双歧杆菌微胶囊，混合即得益生菌微胶囊；
(3)将步骤(2)的益生菌微胶囊与牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇、脱脂乳粉以及步骤(1)的甘草、香菇、酸浆、茯苓微粉化粉末混合，即得。
实施例8益生菌组合物及其制备
所述益生菌组合物由下述重量份组分组成：嗜热链球菌1份、嗜酸乳杆菌1份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌1份、乳双歧杆菌5份、长双歧杆菌0.5份、甘草2份、酸浆5份、茯苓8份、香菇6份、牛初乳粉3份、清蛋白多肽8份、针叶樱桃粉5份、低聚异麦芽糖15份、低聚果糖5份、水苏糖10份、木糖醇10份、脱脂乳粉14份。
具体制备方法为：
(1)将实施例1制备得到的甘草、香菇、酸浆、茯苓提取物混合、粉碎、过80目筛；
(2)将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌与牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇、脱脂乳粉以及步骤(1)的甘草、香菇、酸浆、茯苓粉末混合，即得。
对比例1不含有酸浆和茯苓的益生菌组合物及其制备
除不含有酸浆和茯苓外，其余同实施例4。
对比例2不含有酸浆和香菇的益生菌组合物及其制备
除不含有酸浆和香菇外，其余同实施例4。
对比例3不含有益生元的益生菌组合物及其制备
除不含有低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、木糖醇4种益生元成分外，其余同实施例4。
对比例4不含有牛初乳粉的益生菌组合物及其制备
除不含有牛初乳粉外，其余同实施例4。
对比例5不含有清蛋白多肽的益生菌组合物及其制备
除不含有清蛋白多肽外，其余同实施例4。
实验例1免疫球蛋白IgG和粗多糖含量测定
1.1免疫球蛋白IgG测定方法：
(1)流动相配置：
流动相A：0.05mol/L磷酸盐缓冲液：称取8.955g磷酸氢二钠，加水溶解并定容至250ml，得磷酸氢二钠溶液；称取7.802g磷酸二氢钠加水溶解并定容至500ml，得磷酸二氢钠溶液；分别量取160ml磷酸氢二钠溶液和340ml磷酸二氢钠溶液，加水定容至1000ml。
流动相B:0.05mol/L甘氨酸缓冲液：称取1.876g甘氨酸，加125ml水溶解，加入75ml0.2mol/L盐酸溶液，加水定容至500ml。
(2)标准品配置：称取IgG标准品0.0250g，用流动相A溶解并定容至25ml，配成1.0mg/ml标准品储备液；再用流动相A依次稀释为浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/ml的标准品溶液。
(3)样品配置：称取样品0.1g，用流动相A稀释至25ml，即得。
(4)检测条件：
色谱柱：Pharmacia HI-Trap Protein G柱，1ml
检测波长：280nm
流速：0.4ml/min
进样体积：20μL
流动相洗脱条件：
1.2粗多糖含量测定方法：参照NY/T1676标准进行测定
1.3实验结果
表1不同组合物免疫球蛋白含量和粗多糖含量
| 免疫球蛋白IgG含量 | 粗多糖含量 | |
| 实施例4 | 8.65±0.10％ | 0.64±0.13％ |
| 实施例5 | 9.12±0.05％ | 0.68±0.21％ |
| 实施例6 | 8.93±0.03％ | 0.73±0.16％ |
| 实施例7 | 8.98±0.05％ | 0.69±0.21％ |
| 实施例8 | 8.52±0.04％ | 0.63±0.16％ |
| 对比例1 | 8.21±0.11％ | 0.41±0.21％ |
| 对比例2 | 8.36±0.07％ | 0.37±0.19％ |
| 对比例3 | 8.19±0.08％ | 0.58±0.34％ |
| 对比例4 | 6.21±0.05％ | 0.51±0.18％ |
| 对比例5 | 5.89±0.04％ | 0.54±0.13％ |
免疫球蛋白IgG和粗多糖对于组合物的抗炎效果有很大影响，本申请中免疫球蛋白和粗多糖的含量均比对比例1-5要高，证明其良好的抗炎活性。
实验例2不同益生菌组合物的免疫活性研究
具体实验过程与评价标准参照《保健食品检验与评价技术规范》(2003年版)中第一部分“1.增强免疫力功能检测方法”。
受试样品为本发明实施例4-9，对比例1-5，受试样品剂量为0.33g/(kg·d)，受试样品给予时间为30天，结果具体如下。
2.1小鼠碳廓清试验
注：同列不同字母之间有显著性差异(P<0.05)。
2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
| 吞噬指数 | 吞噬率(％) | |
| 实施例4 | 0.876±0.021<sup>a</sup> | 74.20±1.35<sup>a</sup> |
| 实施例5 | 0.798±0.023<sup>a</sup> | 64.38±2.50<sup>a</sup> |
| 实施例6 | 0.803±0.025<sup>a</sup> | 68.16±2.51<sup>a</sup> |
| 实施例7 | 0.843±0.030<sup>a</sup> | 69.57±2.06<sup>a</sup> |
| 实施例8 | 0.813±0.041<sup>a</sup> | 72.21±3.01<sup>a</sup> |
| 对比例1 | 0.557±0.021<sup>c</sup> | 44.30±2.05<sup>c</sup> |
| 对比例2 | 0.559±0.032<sup>c</sup> | 40.21±3.55<sup>c</sup> |
| 对比例3 | 0.601±0.015<sup>c</sup> | 41.56±1.97<sup>c</sup> |
| 对比例4 | 0.583±0.049<sup>c</sup> | 41.65±2.05<sup>c</sup> |
| 对比例5 | 0.527±0.034<sup>c</sup> | 46.50±2.57<sup>c</sup> |
注：同列不同字母之间有显著性差异(P<0.05)。
2.3自然杀伤(NK)细胞活性测定试验
注：同列不同字母之间有显著性差异(P<0.05)。
2.4小鼠脾淋巴细胞转化试验
| ConA+ | ConA- | |
| 实施例4 | 1.512±0.031 | 1.321±0.006 |
| 实施例5 | 1.491±0.016 | 1.331±0.011 |
| 实施例6 | 1.504±0.009 | 1.321±0.010 |
| 实施例7 | 1.498±0.015 | 1.332±0.013 |
| 实施例8 | 1.490±0.008 | 1.327±0.021 |
| 对比例1 | 1.413±0.018 | 1.311±0.024 |
| 对比例2 | 1.408±0.007 | 1.309±0.021 |
| 对比例3 | 1.422±0.005 | 1.317±0.007 |
| 对比例4 | 1.419±0.019 | 1.316±0.005 |
| 对比例5 | 1.418±0.020 | 1.313±0.009 |
2.5迟发型变态反应试验
注：同列不同字母之间有显著性差异(P<0.05)。
2.6生成抗体的浆细胞数检测试验
| 溶血空斑数(×10<sup>3</sup>个/全脾) | |
| 实施例4 | 5.44±0.38<sup>a</sup> |
| 实施例5 | 4.87±0.39<sup>a</sup> |
| 实施例6 | 5.32±0.37<sup>a</sup> |
| 实施例7 | 5.03±0.41<sup>a</sup> |
| 实施例8 | 5.11±0.24<sup>a</sup> |
| 对比例1 | 3.32±0.19<sup>c</sup> |
| 对比例2 | 3.39±0.25<sup>c</sup> |
| 对比例3 | 3.62±0.31<sup>c</sup> |
| 对比例4 | 3.08±0.20<sup>c</sup> |
| 对比例5 | 3.00±0.18<sup>c</sup> |
注：同列不同字母之间有显著性差异(P<0.05)。
由2.1-2.6的实验效果表明，本发明实施例4-8提供的组合物在提高免疫力方面具有显著的效果，实施例8在制备本发明组合物的过程中没有对中药和真菌进行微粉化，也没有对益生菌进行微胶囊化，最终得到的产品在疗效上相对较差。更重要的是，如果缺少其中益生元、香菇、乳清蛋白、清蛋白多肽等成分(对比例1-5)均会显著降低本申请提高免疫力的效果，由此充分证明本发明组合物之间能够协同发挥用，在提高免疫力方面具有显著的效果。
上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.一种嗜酸乳酸杆菌的固态制剂制备方法，包括以下步骤：
(1)配制含琼脂MRS培养基：称取蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、琼脂，加蒸馏水定容，分装于试管中，高压灭菌后倾斜防止，形成斜面培养基，备用；
(2)制作牛肉疱肉管：称取碎牛肉，加蒸馏水和氢氧化钠煮沸，冷却后过滤，碎肉渣备用；上清液加入牛肉浸液、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钠、葡萄糖、可溶性淀粉，得液体培养基；碎肉渣分装于试管中，加入还原铁粉，将液体培养基分装至试管管内，覆盖溶化的凡士林或液体石蜡，高压灭菌，备用；
(3)配制番茄汁培养基：番茄汁、酵母抽提液、肉膏、乳糖、葡萄糖、K2HPO4、吐温80、乙酸钠；另配制的番茄汁固体培养基中加入琼脂；
(4)嗜酸乳杆菌活化及培养：嗜酸乳杆菌SL9404接种于琼脂MRS斜面培养基上划线传代培养，然后转种接入牛肉疱肉管，再转入番茄汁培养基发酵培养，逐步放大，最后转入番茄汁固体培养基，并分装至不同形状的固体制剂模具，室温冷却，即得。
2.一种权利要求1所述嗜酸乳酸杆菌的固态制剂制备方法制备得到的嗜酸乳酸杆菌的固态制剂。
3.权利要求2所述的嗜酸乳酸杆菌的固态制剂在制备提高免疫力食品中的应用。
4.一种提高儿童免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物由益生菌、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、甘草、酸浆、茯苓、香菇、牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、脱脂乳粉、木糖醇组成。
5.根据权利要求4所述的提高儿童免疫力的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌选自嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物，由下述重量份的原料组成，嗜热链球菌0.5-1份、嗜酸乳杆菌0.5-5份、保加利亚乳杆菌0.5-1份、鼠李糖乳杆菌0.5-5份、乳双歧杆菌0.5-5份、长双歧杆菌0.5-1份、甘草1-5份、酸浆1-5份、茯苓5-10份、香菇5-10份、牛初乳粉2-10份、清蛋白多肽2-10份、针叶樱桃粉1-5份、低聚异麦芽糖5-15份、低聚果糖1-5份、水苏糖1-10份、木糖醇1-15份、脱脂乳粉10-30份；优选地，所述益生菌组合物，由下述重量份的原料组成，嗜热链球菌0.5-1份、嗜酸乳杆菌1-3份、保加利亚乳杆菌0.5-1份、鼠李糖乳杆菌1-3份、乳双歧杆菌2-4份、长双歧杆菌0.5-1份、甘草1-3份、酸浆2-4份、茯苓5-8份、香菇5-10份、牛初乳粉3-8份、清蛋白多肽4-8份、针叶樱桃粉3-5份、低聚异麦芽糖10-15份、低聚果糖1-5份、水苏糖3-10份、木糖醇5-15份、脱脂乳粉17-25份；更优选地，所述益生菌组合物，由下述重量份的原料组成，嗜热链球菌1份、嗜酸乳杆菌2份、保加利亚乳杆菌0.5份、鼠李糖乳杆菌2份、乳双歧杆菌3份、长双歧杆菌0.5份、甘草2份、酸浆4份、茯苓6份、香菇6份、牛初乳粉5份、清蛋白多肽6份、针叶樱桃粉5份、低聚异麦芽糖15份、低聚果糖5份、水苏糖10份、木糖醇10份、脱脂乳粉17份。
7.一种权利要求4-6任一项所述的益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)分别提取甘草、酸浆、茯苓和香菇，得到甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物；
(2)将嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、乳双歧杆菌、低聚异麦芽糖、低聚果糖、水苏糖、牛初乳粉、清蛋白多肽、针叶樱桃粉、脱脂乳粉、木糖醇与步骤(1)得到的提取物混合，即得。
8.根据权利要求7所述的益生菌组合物制备方法，其特征在于，所述甘草、酸浆、茯苓和香菇的提取方法包括以下步骤：甘草、酸浆、茯苓和香菇分别加水回流浸提，提取液浓缩、干燥即得甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物。
9.根据权利要求7所述的益生菌组合物制备方法，其特征在于，将甘草提取物、酸浆提取物、茯苓提取物和香菇提取物混合后粉碎，过60-80目筛，得混合膏粉；所述膏粉的含水量为3.0-4.5％；优选地，所述膏粉的含水量为3.5-4.0％。
10.权利要求4-6任一项所述的益生菌组合物在制备提高免疫力食品中的应用。
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