CN1661038A - 牛乳酶解蛋白多肽的制作方法 - Google Patents

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Abstract

一种牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，先对正常牛乳进行脱脂，并使奶液中的蛋白充分溶解，再分别加入曲霉蛋白酶和胰蛋白酶作二步骤酶解，之后酶解生成液经超滤提取蛋白多肽制成口服液或最后经干燥步骤制成粉末。使用本发明方法生产的蛋白多肽产品具有调节免疫和抗疲劳效果。

Description

牛乳酶解蛋白多肽的制作方法
技术领域
本发明涉及一种通过曲霉蛋白酶和胰蛋白酶二步骤酶解及超滤工艺，以脱脂牛乳为原料制作多肽类物质，此类多肽可制成固体干粉或口服液，具有补充营养，调节免疫和抗疲劳功效。
背景技术
牛乳通常指母牛正常分娩后分泌挤得的乳汁，因营养齐全，蛋白质丰富而受到欢迎。然而牛乳蛋白理化特性又不同于人乳蛋白，服用后遇酸易凝固，不易被婴幼儿消化吸收，此外部分牛乳蛋白对人体有过敏不良后果。已有生产工艺，通过将牛乳蛋白彻底酶解为多肽和氨基酸以解决这一问题。但是近来科学发现牛乳中的乳球蛋白、乳白蛋白和乳酪蛋白的某些肽链片段有重要的生物学功能，提示着牛乳的某些生物学作用是通过活性多肽体现的。显然，现行的脱脂牛乳的彻底酶解方案不够完美。本发明技术，不仅将牛乳中的蛋白改造成低抗原，可充分利用吸收的蛋白多肽，也能最大限度地保留牛乳的生物活性。同时本发明技术易于工业化生产，使得牛乳的产品质量和利用价值均得到提高。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合牛乳的酶解蛋白多肽制作方法。
根据本发明人最近几年对牛乳和现有酶解方法的研究发现：
1、在整个泌乳过程中牛乳的蛋白组分十分复杂，且其含量随时间不断地改变，单一的蛋白酶难以有效地将绝大部分蛋白分解。采用多种不同切割位点的酶先后实施分解可较完全的将大分子乳蛋白改造低分子多肽，从而有利于机体消化道的吸收和利用。
2、牛乳蛋白链中存在着大量的生物活性肽，这些链片段可通过胰蛋白酶酶解方式获得，但是牛乳蛋白分子量高则达百万，有的呈聚合状，非加以足量的酶始不能完全酶解。而胰蛋白酶的大量投入会产生过量不适的苦味肽。先以较温和的曲霉蛋白酶将大部分蛋白解离，再以胰蛋白酶对蛋白肽链进行功能性切割，将起到事半功倍的效果。
3、牛乳的稳定性较弱，加热、遇酸易沉淀凝固，产品质量较难控制。将牛乳中的蛋白改变为小分子多肽后，不仅牛乳生物活性得到保持，乳的稳定性也得到改善，最终能延长产品保质期。
所以本发明的技术方案是：
采用碱制剂调整脱脂牛乳的pH值和加热，逐步使乳液中的蛋白微粒充分溶解，然后依次加入曲霉蛋白酶和胰蛋白酶，进行蛋白酶解。待酶加热失活后，酶解多肽生成液作超滤提纯和浓缩，截留超滤液(牛乳多肽纯化液)。高温灭菌后制成牛乳酶解多肽口服液，或干燥制成牛乳酶解多肽粉末。
即，根据本发明的一种牛乳酶解蛋白多肽制作方法，其步骤依次如下：1、先将正常牛乳脱脂，制成脱脂牛乳液，2、用碱制剂将脱脂牛乳pH值调到8.0～8.5，加热使乳液蛋白质全部溶解，制成材料牛乳液，3、对材料牛乳液加入曲霉蛋白酶作第一步酶反应，制成一次牛乳酶解液，4、再对一次牛乳酶解液加入胰蛋白酶作第二步酶反应，制成牛乳酶解多肽生成液，5、对牛乳酶解多肽生成液超滤分离纯化和浓缩制成牛乳多肽纯化液，6、对牛乳多肽纯化液高温灭菌，制成牛乳酶解多肽口服液；或7、最后把牛乳多肽纯化液高温灭菌后进行干燥制成牛乳酶解多肽粉末。
本发明方法适用于整个泌乳期牛乳的酶解蛋白多肽的制作。
本发明的优点是：1、将以大分子蛋白为主的牛乳蛋白，酶解成分子量低于20000的多肽，使得牛乳理化特性变得较稳定，易于加工处理和质量控制；2、采用此二种酶二步骤酶解可加快大分子蛋白的分解，在保证多肽质量的前提下，胰蛋白酶用量减少，大幅度降低生产成本，同时减少酶解过程中苦味肽的产生，3、由于对酶解液采用超滤技术分离，使得原牛乳中的无机盐，乳糖浓度降低；4、酶解所得的多肽容易被机体吸收利用。实验表明此类多肽对于调节机体免疫力和抵抗疲劳有显著效果。
具体实施方式
下面我们列举本发明的四个实施例，并分别予以详细描述，以便更进一步提供本发明的技术细节或其性能。
实施例1
取母牛泌乳第45天的乳汁100公斤，离心脱脂后，边搅拌，边缓慢加入4N NaOH使初乳料液pH在8.0～8.5，同时加温达50～55℃，直至料液呈均匀无颗粒。接着将100克曲霉蛋白酶(活力按10000单位/克计)溶解液均匀加入料液中，继续保持以上条件，酶反应2小时，或至少1小时。曲霉蛋白酶解反应结束后，料液迅速降温至45℃，将稀释的5克胰蛋白酶(活力按2500单位/毫克计)液均匀混入作第二步酶反应，酶反应1小时。接着加热至80℃，15分钟。整个酶反应结束后，取酶解生成液作超滤提纯和浓缩，超滤后的多肽液pH＜7.5。然后收集超滤截留液，加热灭菌，干燥成粉末。此多肽干粉经SDS--PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定，其条带集中在分子量4000～20000。
取此牛乳酶解多肽粉作血清溶血素试验，结果如下：
  组别 动物数(只) 时间(天)   抗体积数
  对照     10     28   120±10.5
  实验     10     28   149±14.9*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳酶解多肽粉促进机体抗体的生成。
取此牛乳酶解多肽粉作NK细胞活性测定，结果如下：
  组别 动物数(只) 时间(天)  NK细胞活性
  对照     10     28     29±3
  实验     10     28     42±3*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳酶解多肽粉提高NK细胞活性。
实施例2
收集母牛第三日分泌的乳汁100公斤。离心脱脂后，边搅拌，边缓慢加入4N NaOH使初乳料液pH在8.0～8.5，同时加温达50～55℃，直至料液呈均匀黄色。接着将200克曲霉蛋白酶(活力按10000单位/克计)溶解液均匀混入料液中，保持以上条件，酶反应2小时，或至少1小时。曲霉蛋白酶解反应结束后，料液迅速降温至45℃，将稀释的10克胰蛋白酶(活力按2500单位/毫克计)液均匀混入作第二步酶反应，酶反应至少1小时。接着加热至80℃，15分钟。整个酶反应结束后，取料液作超滤提纯和浓缩，超滤后的料液pH＜7.5。然后收集超滤截留液，加热灭菌，干燥成粉末。此干粉经AKTAFPLC柱快速蛋白液体色谱仪(superdex-75)测试干粉蛋白多肽含量在80％，分子量＜15000。
取此牛乳酶解多肽粉作血清溶血素试验和NK细胞活性测定，结果显示牛乳多肽粉有促进机体抗体的生成，提高NK细胞活性，表明有调节免疫力的功效。
实施例3
收集母牛第十日分泌的乳汁100公斤。脱脂后，加6N HCl使初乳酸化至pH4.7，倾去上清液，收集白色的酪蛋白沉淀物。接着以清水洗涤沉淀物三遍，恢复原体积，再加入4N NaOH将酪蛋白彻底溶解。接着将100克曲霉蛋白酶(活力按10000单位/克计)溶解液均匀混入料液中，酶反应条件：常压、pH8.0～8.5、温度50～55℃、时间2小时，或至少1小时。曲霉蛋白酶解反应后，料液迅速降温至45℃，将5克胰蛋白酶(活力按2500单位/毫克计)溶液均匀混入作第二步酶反应，酶反应至少1小时。接着加热至80℃，15分钟。整个酶反应结束后，酶解多肽生成液作超滤提纯和浓缩，超滤结束时的牛乳酶解多肽纯化液pH＜7.5。然后收集超滤截留液，加热灭菌，干燥成粉末。
取此牛乳酶解多肽粉作小鼠负重游泳试验，结果如下：
    组别 动物数(只) 负重游泳时间(秒)
    对照     10     179±57
    实验     10     273±90*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳酶解多肽粉可延长小鼠负重游泳时间。
取此牛乳酶解多肽粉作小鼠运动后肝糖元测定，结果如下：
  组别 动物数(只) 肝糖元(mg/100g)
  对照     10     630±213
  实验     10     1160±200*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳酶解多肽粉提高小鼠运动后肝糖元，有抗疲劳效果。
实施例4
按实施例1或2或3所示酶解方法，获得的牛乳酶解多肽纯化液可直接消毒灭菌，配制成牛乳酶解多肽口服液。
取此牛乳酶解多肽口服液对小鼠运动后血清尿素氮测定，结果如下：
    组别   动物数(只)  血清尿素氮(mmol/l)
    对照     10     8.2±1.9
    实验     10     5.2±2.0*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳酶解多肽口服液降低小鼠运动后血清尿素氮水平。
取此牛乳酶解多肽口服液对小鼠运动后血乳酸的影响测定，结果如下：
  组别   动物数(只)     血乳酸(mmol/L)
    实验前 实验后0分钟 实验后60分钟
  对照     10     6.68±2.1     14.8±1.9     8.7±1.9
  实验     10     6.68±2.1     13.6±2.1     6.6±1.1*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别，此牛乳多肽口服液降低小鼠运动后血乳酸浓度。
取此牛乳酶解多肽口服液作小鼠巨噬细胞吞噬试验，结果如下：
    组别 动物数(只)     吞噬％   吞噬指数
    对照     10     40±4.0   0.50±0.10
    实验     10     59±5.5*   0.77±0.10*
*P＜0.05，经统计学处理两组别间有显著性差别。此牛乳酶解多肽口服液提高小鼠巨噬细胞吞噬能力，有调节机体免疫力的效果。

Claims (8)

1、一种牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，包括依次进行步骤：
(1)先对正常牛乳进行脱脂，制成脱脂牛乳液，
(2)将脱脂牛乳液的蛋白质作充分溶解，制成材料牛乳液，
(3)对材料牛乳液加入曲霉蛋白酶稀释液进行第一次酶解反应，制成一次牛乳酶解液，
(4)对一次牛乳酶解液加入胰蛋白酶稀释液进行第二次酶解反应，制成牛乳酶解多肽生成液，
(5)对牛乳酶解多肽生成液作超滤分离和浓缩，制成牛乳多肽纯化液，
(6)对牛乳多肽纯化液高温灭菌制成牛乳酶解蛋白多肽口服液，或(7)最后把牛乳多肽纯化液高温灭菌后再进行干燥制成牛乳酶解多肽粉末。
2、根据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(2)中对所述材料牛乳液是通过先用碱制剂pH值调整到8.0～8.5，后加热至55℃左右，逐步将其中的蛋白质充分溶解获得。
3、根据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(3)中曲霉蛋白酶的反应条件是：pH值8.0～8.5，温度50～55℃，时间≥1小时。
4、根据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(4)中胰蛋白酶的反应条件是：pH值7.5～8.0，温度40～45℃，时间≥1小时。
5、据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(5)中牛乳对酶解多肽生成液作超滤分离和浓缩，超滤膜分子量≤4000。
6、据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(6)中制成的牛乳酶解蛋白多肽口服液中的多肽＜20000。
7、据权利要求1所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述步骤(7)中制成的牛乳酶解蛋白多肽粉末的多肽分子量＜20000。
8、根据权利要求1～7中的任一项所述的牛乳酶解蛋白多肽的制作方法，其特征在于，所述牛乳包括牛成熟乳或牛初乳。
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