CN102286592A - 一种猪肺蛋白肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪肺蛋白肽的制备方法，以猪肺提取肝素钠后的废液为原料，包括步骤：脱盐、酶解、超滤膜分离、干燥。本发明还公开了所述方法获得的猪肺蛋白肽及其用途。本发明不但解决了猪肺提取肝素钠后废液的生物资源浪费及环境污染等问题，而且通过连续的加工工艺，极大提升了产品的利用价值，所制备的猪肺蛋白肽易于吸收，具备特殊的生理活性，应用于高档饲料，可提高动物产能；也可用于制备提高免疫力的组合物，或用于制备增强外周血淋巴细胞的组合物。

Description

一种猪肺蛋白肽的制备方法

技术领域

本发明涉及多肽的制备，尤其涉及一种猪肺蛋白肽的制备方法。

背景技术

畜牧业是农业的重要组成部分，在我国国民经济发展中的地位日益显著。由于人们生活水平的提高，以及传统饮食习惯的影响，作为生猪屠宰的副产品——猪肺被视为下品，少有人问津。

目前，生猪屠宰量大，2009年我国生猪出栏6.4亿头，比2008年增长5.7％，猪肺约为60万吨，由于产业结构的不合理，仅有少量的猪肺得到综合利用，大部分被弃之浪费，造成了巨大的生物资源浪费，同时又造成严重的环境污染，且存在极大的生物污染的风险。因此，寻找一条有效途径对猪肺进行综合利用，提高其经济价值，减少对环境的污染，降低生物污染的风险已成为一项重要任务。

对猪肺进行深加工，折分其中的软骨提取软件骨素，肺实质部分提取肝素钠是一种方案。然而剩余的废液却未能充分利用。将提取肝素钠后的废液进行分析，其蛋白质含量占干重的24.10％，人体必需的8种氨基酸(异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸)全都具备，且含有多种微量元素、维生素等营养素。因此可将提取肝素钠后的废渣和废液进行深加工，制备成蛋白多肽粉，用作饲料原料及添加剂，提高猪肺的加工利用水平。

发明内容

本发明旨在提供一种猪肺蛋白肽的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述方法获得的猪肺蛋白肽。

本发明的再一个目的是提供所述方法获得的猪肺蛋白肽的用途。

在本发明的第一方面，提供一种猪肺蛋白肽的制备方法，包括步骤：

(a)脱盐：将猪肺提取肝素钠后的废液过滤后，经树脂吸附脱盐，得到滤液I；

(b)酶解：添加蛋白酶到所述滤液I中进行酶解反应，得到酶解溶液II；

(c)超滤膜分离：将所述酶解溶液II通过超滤膜分离处理，得到滤出液III；

(d)干燥：将所述滤出液III干燥，得到所述猪肺蛋白肽。

在另一优选例中，所述提取肝素钠的方法，包括：

(1)将猪肺经高速粉碎后与水混合，添加氯化钠，搅拌混匀，使得氯化钠的浓度为3～5w/w％，室温盐解浸提1～2小时，得到盐解后的猪肺溶液；

(2)将所述盐解后的猪肺溶液的pH值调节至9～10后，与动物蛋白水解酶在40～58℃混合8～12小时，得到酶解猪肺溶液；

(3)将所述酶解猪肺溶液经过吸附肝素钠树脂吸附得到肝素钠，吸附后的滤液即为所述剩余的液体；

其中，所述猪肺和水的质量比为1∶0.8～1.2；所述动物蛋白水解酶为复合酶，由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶按重量比0.5～1.5∶1.5～2.5∶1.5～2.5配制而成，所述动物蛋白水解酶的添加量为猪肺重量的1～3％。

在另一优选例中，所述猪肺进行清洗和去除肺软管后再进行高速粉碎处理。

在另一优选例中，所述动物蛋白水解酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶按0.8～1.2∶1.8～2.2∶1.8～2.2配制而成，更佳地，所述动物蛋白水解酶由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶按1∶2∶2配制而成。

在另一优选例中，在所述步骤(3)前还包括将所述酶解猪肺溶液升温80～90℃保持0.5～2小时使酶失活的步骤。

在另一优选例中，所述树脂为阴离子交换树脂，所述树脂的添加量为料液体积的0.5～2％(w/v)。

在另一优选例中，所述阴离子交换树脂以苯乙烯为骨架，为强碱型、弱碱型或大孔型。

在另一优选例中，所述蛋白酶为2709碱性蛋白酶，所述2709碱性蛋白酶的添加量为所述滤液I体积的0.1～1w/v％，酶解温度为45～60℃，酶解时间6～10小时。

在另一优选例中，所述超滤膜为1000分子量的超滤膜，为卷式膜或管式膜。

在另一优选例中，所述制备方法还包括将所述步骤(c)中未通过超滤膜的滞留液进行5倍体积水透析处理，透析出的滤液与滤出液III合并。

在另一优选例中，所述步骤(d)包括：

(d1)：将所述滤出液III通过多效蒸发器进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至35w/v％～55w/v％；

(d2)：将经浓缩后的滤出液III经高压喷雾干燥处理，获得所述猪肺蛋白肽。

本发明的第二方面，提供一种猪肺蛋白肽，由本发明第一方面所述的制备方法制得。

本发明提供的猪肺蛋白肽，分子量在1000Da以内。

本发明的第三方面，提供猪肺蛋白肽的用途，用作高档饲料；或用于制备提高免疫力的组合物，或用于制备增强外周血淋巴细胞的组合物。

本发明不但解决了猪肺提取肝素钠后废液的生物资源浪费及环境污染等问题，而且通过连续的加工工艺，极大提升了产品的利用价值，所制备的猪肺蛋白肽易于吸收，具备特殊的生理活性，应用于高档饲料，可提高动物产能；也可用于制备提高免疫力的组合物，或用于制备增强外周血淋巴细胞的组合物。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的试验研究，发现经树脂脱盐、碱性蛋白酶酶解、超滤膜分离、干燥等一系列步骤可以从猪肺提取肝素钠的废液中制备猪肺蛋白肽，其分子量在1000Da以下，可以直接被动物吸收利用，因此具有较好的生理活性。

定义

如本文所用，“碱性蛋白酶”是指经细菌原生质体诱变方法造育的地衣芽孢杆菌发酵而得的一种蛋白水解酶，其主要成分为枯草杆菌蛋白酶，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为27300。

如本文所用，“离子交换树脂”是指人工合成的固相介质，一般以聚苯乙烯为基质，经修饰后用于物质的吸附。可选强碱型或弱碱型，或选大孔型，苯乙烯骨架。

如本文所用，“超滤膜”是一种孔径规格一致，额定孔径范围为0.001-0.02微米，在膜的一侧施以适当压力，就能筛出小于孔径的溶质分子的微孔过滤膜。由高分子材料制得。根据配置外形可分为管式膜、卷式膜等。根据额定孔径大小可分为多种超滤膜型号。本文选用分离分子量大于1000道尔顿的超滤膜。

制备方法

本发明提供了一种猪肺蛋白肽的制备方法，即利用猪肺提取肝素钠后的废液为原料，采用树脂脱盐、酶解、超滤膜分离、喷雾干燥等现代生物技术，获得猪肺蛋白肽。

本发明的猪肺蛋白肽的制备方法，包括步骤：

(a)脱盐：将猪肺提取肝素钠后的废液过滤后，经树脂吸附脱盐，得到滤液I；

(b)酶解：添加蛋白酶到所述滤液I中进行酶解反应，得到酶解溶液II；

(c)超滤膜分离：将所述酶解溶液II通过超滤膜分离处理，得到滤出液III；

(d)干燥：将所述滤出液III干燥，得到所述猪肺蛋白肽。

在另一优选实施方式中，制备方法包括步骤：

(a)脱盐：将从猪肺中提取肝素钠后废液上离子交换树脂，通过吸附对所述液体进行脱盐处理，得到滤液I；

(b)酶解：将所述滤液I和2709碱性蛋白酶在45～60℃混合6～10小时，得到酶解溶液II，所述碱性蛋白酶的添加量为所述滤液I体积的0.1～1％；

(c)超滤膜分离：将所述酶解溶液II通过1000分子量的超滤膜分离得到滤出液III；

(d)干燥：将所述滤出液III干燥，得到所述猪肺蛋白肽。

所述方法中使用的超滤膜，其孔隙大小为1000Da，酶解溶液经超滤膜分离后，分子量1000Da以下的猪肺蛋白肽可通过超滤膜，1000Da以上的猪肺蛋白肽则被分离开来。通过超滤膜的酶解溶液必须经过特殊的酶解工艺，使酶解溶液中分子量低于1000Da的寡肽含量达到最多。

猪肺蛋白肽

本发明提供的猪肺蛋白肽的分子量在1000Da以下，优选2-8个氨基酸的寡肽，其具有吸收速度快、耗能低、吸收率高等优势，可以直接被动物吸收利用。

本发明提供的猪肺蛋白肽具有如下功能特性：

1、猪肺蛋白肽具有免疫活性，调节机体免疫力。

猪肺蛋白肽具有免疫活性，其可促进淋巴细胞的增生，增强巨噬细胞的吞噬活性和杀伤能力，可显著增强人体外周血淋巴细胞增生。

在体外，猪肺蛋白肽对机体具有一定的免疫增强活性；在体内，针对T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞等3种主要的免疫细胞，通过淋巴细胞的凝集效价，证明猪肺蛋白肽对机体的免疫活性有明显的增强作用。

2、猪肺蛋白肽能够促进氨基酸的吸收和蛋白质的沉积率。

寡肽与游离氨基酸具有相互独立的吸收机制，二者互不干扰。这就有助于减轻由于游离氨基酸相互竞争共同吸收位点而产生的颉颃作用，从而促进氨基酸的吸收，加快蛋白质的合成。当蛋白质完全以寡肽形式供给，赖氨酸的吸收速度不再受精氨酸的影响。

3、猪肺蛋白肽促进矿物质元素的吸收利用

猪肺蛋白肽能提高铁离子的可溶性、吸收率。在日粮中添加猪肺蛋白肽，血浆中的铁离子、锌离子含量显著增加。

猪肺蛋白肽用途

本发明提供的具有优良特性及多种生物活性的猪肺蛋白肽可用于各种技术领域，包括饲料、食品等。

本发明提供的猪肺蛋白肽可应用于抗氧化、消除自由基方面；可应用于增强免疫力组合物的制备，或应用于增加外周血淋巴细胞组合物的制备。所述的组合物包括饲料组合物、食品组合物等。

将本发明提供的猪肺蛋白肽应用于以上各项时，可将猪肺蛋白肽和饲料或食品上可接受的载体混合得到的组合物。

对于本发明所述的组合物的剂型没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物服用的剂型；优选的，所述的剂型可选自：颗粒剂、粉末剂。

本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

本发明的主要优点在于：

1、本发明首次将酶解技术应用于猪肺产品中，确保生产产品的质量达到要求。

2、本发明首次将超滤膜分离技术应用到猪肺产品中，实现不同分子量肽的分离。

3、本发明首次将盐解、酶解技术、树脂吸附技术及超滤膜分离技术结合在一起，利用猪肺生产分子量1000Da以下的寡肽产品，解决了猪肺提取肝素钠后余液的生物资源浪费及环境污染等问题。

4、本发明利用现代生物技术对猪肺进行深加工，为农副产品高科技产业化开辟了新途径。

5、猪肺蛋白肽是一种高科技含量、高附加值、高经济效益的全新产品，具有广阔的市场前景，是新的经济增长点，可以创造出巨大的经济效益和社会效益。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率或份数按质量计。

本发明中的质量体积百分比中的单位是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的质量。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1

制备猪肺蛋白肽产品

步骤一：猪肺去除软管、清洗处理

取550kg猪肺，经机械去除软管、清水清洗去污、高速粉碎处理。

步骤二：盐解

粉碎后的猪肺加纯净水500kg，添加5％(w/w)氯化钠，常温盐解浸提1h，使肝素利于提取。

步骤三：复合酶酶解

添加动物蛋白水解酶(购自广西东恒华道生物科技有限责任公司，为复合酶，由木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶按1∶2∶2配比而成)，添加量为猪肺质量的2％，50℃反应10h，酶解反应结束后将溶液升温到85℃保持30min，使溶液中的酶失活。

步骤四：树脂吸附

将酶解溶液经过滤，去除油脂及块状物后，经肝素钠树脂吸附，将猪肺提取肝素钠后的废液经80目筛过滤，再经离子交换树脂(703(D311)型大孔弱碱性丙烯酸系阴离子交换树脂，购自上海开平树脂有限公司)吸附脱盐处理，树脂的添加量为料液体积的2％(w/v)。

步骤五：碱性蛋白酶酶解

于经脱盐处理后的滤液添加碱性蛋白酶((2709碱性蛋白酶，酶活性：20万IU，购自南宁庞博生物工程有限公司)，添加量为滤液体积的0.4w/v％，55℃酶解6h。

步骤六：超滤膜分离

将酶解溶液经过分子量1000Da的超滤膜分离膜过滤，将滤出液进入下一工艺环节。将未通过分子量1000Da的超滤膜分离膜的滞留液用于其他用途；或者进行5倍体积水透析处理，透析出的滤液与经过分子量1000Da的超滤膜的滤出液进入下一工艺环节。

步骤七：三效蒸发浓缩

将滤出液通过三效蒸发器进行浓缩，使滤出液固含量提升至35％至55％，以降低能耗。

步骤八：高压喷雾干燥

将滤出液经高压喷雾干燥工艺处理，喷雾压力15-20MP、进风温度220-240℃、出风温度90-110℃。

步骤九：包装成型。

采用HPLC检测肽分子量分布，结果如表1所示。

表1HPLC检测结果

实施例2

制备猪肺蛋白肽产品

步骤一：树脂吸附

将提取肝素钠后的猪肺蛋白液10m³经80目筛过滤，获得9.2m³透过液。将92公斤离子交换树脂703(D311)添加到透过液中，反应12小时，获得9.0m³滤液I。

步骤二：碱性蛋白酶酶解

向滤液I中添加碱性蛋白酶(2709碱性蛋白酶，酶活性：20万IU，购自南宁庞博生物工程有限公司)46公斤，55℃酶解6h，获得溶液II。

步骤三：超滤膜分离

将获得溶液II经过分子量1000Da的超滤膜分离，获得滤出液III，将滤出液III进入下一工艺环节。将未通过分子量1000Da的超滤膜的滞留液用于其他用途；或者进行5倍体积水透析处理，透析出的滤液与经过分子量1000Da的超滤膜的滤出液进入下一工艺环节。

步骤四：三效蒸发浓缩

将溶液III通过三效蒸发器进行浓缩，使滤出液固含量提升至35w/v％至55w/v％，以降低能耗。

步骤五：高压喷雾干燥

将经浓缩后的滤出液III经高压喷雾干燥工艺处理，喷雾压力15-20MP、进风温度220-240℃、出风温度90-110℃。

步骤六：包装成型。

经检测，猪肺蛋白肽的分子量＜1000Da。

实施例3

饲喂试验-生长性能

选取健康、28日龄断奶、平均体重为(7.20±0.55)Kg的杜×长×大三元杂交仔猪160头，按照公母比例一致的原则随机分成4个处理组，即对照组、试验组1、试验组2和试验组3，每个处理组4个重复，每个重复10头猪，对照组饲喂不含猪肺蛋白肽的基础日粮，试验组1、试验组2和试验组3分别饲喂用猪肺蛋白肽添加量为1％、2％、3％的三种试验日粮。试验期14天。分别在试验开始、第8天及试验结束时清晨对仔猪进行空腹称重，以重复栏为单位统计采食量，计算试验前期(1-7天)、试验后期(8-14天)及试验全期的平均日增重、平均日采食量、料肉比，试验结果见表2。

表2猪肺蛋白肽对仔猪生长性能的影响

表2表明在整个试验期间，试验组的平均日增重、平均日采食量、料肉比等生长性能指标均优于对照组，其中试验后期(8-14天)，试验组2、试验组3的平均日增重、平均日采食量均较对照组显著提高(p＜0.05)；试验组间随着猪肺蛋白肽添加量的增加，仔猪的采食量和日增重有一定增高趋势，其中试验后期(8-14天)，试验组2、试验组3的平均日增重显著高于试验组1(p＜0.05)，在试验全期，试验组2、试验组3的各生长性能指标均无明显差异(p＞0.05)。本试验条件下，猪肺蛋白肽对仔猪有一定促生长作用。

实施例4

饲喂试验-血液生化指标

在实施例3中，在试验结束时清晨，从每重复栏中随机选取2头仔猪，空腹前腔颈静脉采血5ml，置4℃冰箱冷藏1小时，3000r/min离心5min，取上清血清，冷藏供分析。测定谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清总蛋白、白蛋白、球蛋白等血液指标，试验结果见表3。

表3表明试验组与对照组之间谷丙转氨酶酶活、谷草转氨酶酶活无显著差异(p＞0.05)，猪肺蛋白肽对仔猪肝脏、心脏生理功能无影响；各试验组的血清总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量均高于对照组，其中试验组2、试验组3的效果较明显，其血清总蛋白含量、白蛋白含量、球蛋白含量均显著高于对照组(p＜0.05)，试验组1各血清蛋白指标与对照组之间差异不显著(p＞0.05)。

表3猪肺蛋白肽对仔猪血液生化指标的影响

实施例5

饲喂试验-免疫性能

选取80头30日龄仔猪，随机分成4组，每组2个重复，每个重复10头，第1组-第3组为试验组，分别饲喂猪肺蛋白肽添加量为1％，1.5％，2％的的试验日粮，第4组为对照组，饲喂不含猪肺蛋白肽的常规日粮。在试验开始时，各组仔猪同时免疫猪瘟兔化弱度疫苗，分别在免疫接种后的第2周、第4周、第6周时，清晨空腹，每头仔猪采血5ml，分离血清，测定猪瘟病毒抗体效价。

试验结果见表4。表4表明试验组2、试验组3的猪瘟病毒抗体效价在第4周、第6周较对照组显著提高(p＜0.05)，在饲料中添加1.5％，2％的猪肺蛋白肽可以提高接种猪猪瘟特异性抗体的效价，并能够延长猪瘟抗体在体内的作用时间。

表4猪肺蛋白肽对仔猪猪瘟病毒抗体效价的影响

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于该权利要求范围之中。

Claims (10)

1.一种猪肺蛋白肽的制备方法，其特征在于，包括步骤：

(a)脱盐：将猪肺提取肝素钠后的废液过滤后，经树脂吸附脱盐，得到滤液I；

(b)酶解：添加蛋白酶到所述滤液I中进行酶解反应，得到酶解溶液II；

(c)超滤膜分离：将所述酶解溶液II通过超滤膜分离处理，得到滤出液III；

(d)干燥：将所述滤出液III干燥，得到所述猪肺蛋白肽。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述树脂为阴离子交换树脂，所述树脂的添加量为料液体积的0.5～2％(w/v)。

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子交换树脂以苯乙烯为骨架，为强碱型、弱碱型或大孔型。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶为2709碱性蛋白酶，所述2709碱性蛋白酶的添加量为所述滤液I体积的0.1～1w/v％，酶解温度为45～60℃，酶解时间6～10小时。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超滤膜为1000分子量的超滤膜，为卷式膜或管式膜。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将所述步骤(c)中未通过超滤膜的滞留液进行5倍体积水透析处理，透析出的滤液与滤出液III合并。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(d)包括：

(d1)：将所述滤出液III通过多效蒸发器进行浓缩，使滤出液中的固含量提升至35w/v％～55w/v％；

(d2)：将经浓缩后的滤出液III经高压喷雾干燥处理，获得所述猪肺蛋白肽。

8.如权利要求1～7任一项所述的制备方法得到的猪肺蛋白肽。

9.如权利要求8所述的猪肺蛋白肽，其特征在于，所述的猪肺蛋白肽的分子量在1000Da以内。

10.一种如权利要求8所述的猪肺蛋白肽的用途，其特征在于，用作高档饲料；或用于制备提高免疫力的组合物，或用于制备增强外周血淋巴细胞的组合物。