CN105596370A - 一种驼血多肽的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种驼血多肽的制备方法。该方法以驼血为原料，预处理后，经酶解，离心后得到驼血多肽酶解液。利用大孔吸附树脂柱进行吸附，弃去吸附残液。待吸附饱和后，用洗脱液进行洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，干燥后得到驼血多肽产品。其特征在于以驼血为原料，利用酶切技术和大孔树脂混合模拟移动床技术从驼血中制备驼血多肽的方法。制备得到的驼血多肽产品含量＞55％，回收率＞65％。本发明特点在于提供了一种具有特定功能驼血多肽的制备工艺；整个生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好；工艺路线简单，可为食品、保健品、药品等提供驼血多肽。本发明可进一步促进驼血多肽的产业化开发。

Description

一种驼血多肽的制备方法

技术领域

本发明涉及一种驼血多肽的制备方法，即利用酶切技术和大孔树脂混合模拟移动床技术从驼血中制备驼血多肽的方法。

背景技术

骆驼(Camel)是偶蹄目骆驼科骆驼属两种大型反刍哺乳动物的统称，分单峰驼和双峰驼。我国是世界上双峰骆驼主要产地之一。全国约有骆驼29.5万峰左右，主要分布在内蒙古、新疆、青海、甘肃、宁夏等省区约110万平方公里的干旱荒漠草原上。从数量看，以新疆维吾尔族自治区为最多，约占47.5％左右，内蒙古自治区次之，约占全国骆驼总数的41.7％。

由于骆驼生存在严酷的恶劣环境条件下，特殊的环境使其血液与其它动物的血液相比，具有特殊的生理、营养功能。现代研究表明：骆驼血中的白蛋白不仅明显高于其它动物，而且具有异常高的生理活性。双峰驼血清蛋白质共有白蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白等5个组分。双峰驼血清的蛋白质总量中，白蛋白含量高达73.20％，明显高于绵羊、牛、马等哺乳类动物中血液的白蛋白。

驼血含有丰富的蛋白质，是制备多肽的理想原料。驼血多肽市场尚处萌芽阶段，目前主要应用于食品领域。随着研究的不断深入，驼血多肽的应用领域不断加大，消费的上升潜力很大，产品价格未来将相对稳定。随着人民生活水平的提高，国内大中城市的高端消费群体对驼血多肽产品的需求还在不断增加，驼血多肽产品市场短期内尚供不应求。

目前，驼血多肽的制备工艺已经开始相关的研究，并取得了一定的研究成果。现阶段而言，驼血多肽的制备工艺主要通过膜过滤法，该方法基本工艺为：驼血加水稀释后，加入适量的酶进行酶解，酶解液进行膜过滤，得到一定分子量范围的物质。该方法优点是工艺简单，得到的多肽分子量区间相对集中，缺点是仅以筛分原理按照分子尺寸进行筛分，驼血多肽的纯度和活性较低；产品中含杂质太多，纯度不高，而且对滤膜的消耗量太大，成本较高。大孔吸附树脂的分离富集原理是筛分作用和吸附作用相结合的新型材料，因此，利用大孔吸附树脂技术进行驼血多肽的分离富集，可以得到更高纯度和活性的产品。

驼血多肽纯度高低，直接决定了产品的品质和用途。因此，制备高纯度的驼血多肽成为本领域目前迫切需要解决的技术难题。现代研究表明，人类对蛋白质的利用是将蛋白质酶解成小分子多肽吸收利用。小分子多肽具有不需消化直接吸收、不需消耗人体能量、吸收速度快、优先吸收、在人体中合成蛋白质的速率较氨基酸快等诸多优点。如以驼血为原料，制备驼血多肽及相关产品，开发出抗疲劳、抗衰老、增强免疫力等功能的保健品、药品，将会极大提高驼血的附加值，可推动骆驼养殖业的发展，具有重要的经济效益和社会效益。

然而，目前国内外对于驼血的研究与开发尚处于起步阶段，国内还没有将驼血进行产业化开发，极大地浪费这一宝贵的资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以驼血为原料，利用酶切技术和大孔树脂混合模拟移动床技术制备驼血多肽的方法。

本发明的方法，包括以下步骤：

1)向驼血中加入1～20倍质量的水，置入发酵罐中，然后向发酵罐中先加入的脂肪酶，控制温度为30～60℃，酶切时间为0.5～8h；然后加入蛋白酶进行酶切，控制温度为30～60℃，酶切时间为0.5～8h，酶切后进行高温灭酶灭菌获得驼血酶解液；

2)将驼血酶解液冷却至室温后，离心，收集上清液，得驼血多肽提取液；

3)将驼血多肽提取液直接加入大孔吸附树脂柱进行吸附，流速为5～15BV/h(柱体积，简称BV)，收集吸附残液；吸附结束后，用5～40BV的洗脱液进行洗脱，流速为5～20BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并；将溶液干燥后得到驼血多肽产品。

步骤1)中的蛋白酶为酸性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、枯草杆菌、血液蛋白专用酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中性蛋白酶中的一种或几种的复合酶。

步骤3)中大孔吸附树脂为苯乙烯系或丙烯酸系大孔吸附树脂中的一种或几种的混合物。

步骤3)中大孔吸附树脂与驼血多肽提取液的质量比为25～8:1，树脂柱径高比为1:4～15；

步骤3)中的干燥方法为喷雾干燥、微波干燥、真空干燥，鼓风干燥中的一种或几种。

为了获得更好的分离效果，其中步骤3)中的大孔吸附树脂为混合树脂，其中D312:HPD600:LX-10G的质量比为1:3:2；

步骤3)中的洗脱液中乙酸乙酯:乙醇:水的体积比为1:9:90。

本发明方法制备得到的驼血多肽的提取率大于65％，纯度均达到55％以上，而且大孔吸附树脂的再生性能好，可以再生重复使用，洗脱剂无毒无害，也可以回收多次利用。利用该法制备的驼血多肽可用于汤剂、丸剂、散剂、膏剂、丹剂、酒剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、片剂、注射剂等食品、保健食品、药品等的原料。本发明的特点在于提供了一种驼血多肽的制备工艺；生产过程中使用绿色溶剂，成本低、效率高、环境友好；工艺路线简单，可为食品、保健品、药品等提供驼血多肽。本发明可进一步促进驼血多肽的产业化开发。

具体实施方式

在驼血多肽的制备过程中，洗脱液的组分及配比对提取效果具有重要的影响，既要保证提取率，又要保证纯度。因此，经过长期的研究，申请人确定了驼血多肽制备的洗脱液的组分及配比；同时结合大孔吸附树脂的组分配比，制备较高纯度和提取率的驼血多肽。

本发明的驼血多肽参照国标GB/T22729-2008中液相色谱法进行测定。

色谱条件：

色谱柱：TSKgelG2000SWXL300mm×7.8mm或性能与此相近的同类型其它适用于测定蛋白质和多肽的凝胶柱。

流动相：乙腈:水:三氟乙酸＝45:55:0.1(v:v:v)；流速：0.5mL/min；检测波长：220nm；参比波长：360nm；柱温：30℃，进样量：20μL。

实施例1

称取驼血100g置于发酵罐中，加入800ml水稀释，搅拌均匀，然后向发酵罐中加入2.0g脂肪酶，在42℃下酶切1h，再分别加入1.2g酸性蛋白酶和0.8g胃蛋白酶的复合酶，在45℃下，酶切4h后，利用发酵罐在93℃下灭酶灭菌20min。将灭酶灭菌后的驼血酶解液冷却至室温后，4500r/min下离心15min，收集上清液，得驼血多肽提取液。

称取850gLSA-21型大孔吸附树脂(西安蓝晓科技有限公司)，均匀混合，湿法装入一根内径8cm、柱高100cm的玻璃柱中。利用泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为10BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用10BV的乙酸乙酯:乙醇:水(1:9:90,v/v)进行洗脱，流速为6BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，喷雾干燥后得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为75.3％，驼血多肽的提取率为76％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

实施例2

称取驼血200g置于发酵罐中，加入3000ml水稀释，搅拌均匀，然后向发酵罐中加入3.5g脂肪酶，在45℃下酶切3h，再分别加入1.5g中性蛋白酶、0.5g菠萝蛋白酶和0.8g无花果蛋白酶组成的复合酶，在55℃下，酶切3h后，利用发酵罐在88℃下灭酶灭菌20min。将灭酶灭菌后的驼血酶解液冷却至室温后，4500r/min下离心15min，收集上清液，得驼血多肽提取液。

称取2300gYWD12G型大孔吸附树脂(沧州远威化工有限公司)，湿法装入一根内径12cm、柱高150cm的玻璃柱中。利用泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为13BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用15BV的乙酸乙酯:乙醇:水(4:8:88,v/v)进行洗脱，流速为9BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，喷雾干燥后得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为81.5％，驼血多肽的提取率为79％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

实施例3

称取驼血1Kg置于发酵罐中，加入20L水稀释，搅拌均匀，然后向发酵罐中加入18.0g脂肪酶，在50℃下酶切5h，再分别加入30g胰凝乳蛋白酶，在50℃下，酶切4.5h后，利用发酵罐在90℃下灭酶灭菌20min。将灭酶灭菌后的驼血酶解液冷却至室温后，4500r/min下离心15min，收集上清液，得驼血多肽提取液。

为了获得更高的纯度，申请人对大孔吸附树脂的组成进行了优化，选用D312(山东鲁抗立科药业有限公司)、HPD600(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)和LX-10G(西安蓝晓科技有限公司)来制成混合树脂，其中D312:HPD600:LX-10G的质量比为1:3:2。

称取2KgD312型大孔吸附树脂、6KgHPD600型大孔吸附树脂和4KgLX-10G型大孔吸附树脂(质量比为1:3:2)，混合均匀后，湿法装入一根内径35cm、柱高280cm的玻璃柱中。利用泵将驼血多肽提取液由下端泵入大孔树脂混合柱中进行反复吸附3次，流速为15BV/h，弃去吸附残液；吸附结束后，用30BV的乙酸乙酯:乙醇:水(3:11:86,v/v)进行洗脱，流速为15BV/h，收集洗脱液，回收溶剂，喷雾干燥后得到驼血多肽产品。

对本品进行高效液相色谱法(HPLC法)检验，驼血多肽的纯度为91.1％，驼血多肽的提取率为75％。树脂柱以70％乙醇除杂后，再以95％乙醇再生重复使用，并回收溶剂。

Claims (8)

1.一种驼血多肽的制备方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)向驼血中加入1～20倍质量的水，置入发酵罐中，然后向发酵罐中先加入的脂肪酶，控制温度为30～60℃，酶切时间为0.5～8h；然后加入蛋白酶进行酶切，控制温度为30～60℃，酶切时间为0.5～8h，酶切后进行高温灭酶灭菌获得驼血酶解液；

2)将驼血酶解液冷却至室温后，离心，收集上清液，得驼血多肽提取液；

3)将驼血多肽提取液直接加入大孔吸附树脂柱进行吸附，流速为5～15BV/h，收集吸附残液；吸附结束后，用5～40BV的洗脱液进行洗脱，流速为5～20BV/h，收集洗脱液，并与吸附残液合并；将溶液干燥后得到驼血多肽产品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的蛋白酶为酸性蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、风味蛋白酶、无花果蛋白酶、枯草杆菌、血液蛋白专用酶、胃蛋白酶、胰凝乳蛋白酶中性蛋白酶中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中大孔吸附树脂为苯乙烯系或丙烯酸系大孔吸附树脂中的一种或几种。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的大孔吸附树脂为混合树脂为D312、HPD600和LX-10G的混合树脂，其中D312:HPD600:LX-10G的质量比为1:3:2。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中的洗脱液中乙酸乙酯:乙醇:水的体积比为1:9:90。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中大孔吸附树脂与驼血多肽提取液的质量比为25～8:1。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中大孔吸附树脂的树脂柱径高比为1:4～15。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的干燥方法为喷雾干燥、微波干燥、真空干燥，鼓风干燥中的任一种。