CN105273051A - 一种利用双酶协同水解制备章鱼钙螯合蛋白肽的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用双酶协同水解制备章鱼钙螯合蛋白肽的方法，以章鱼蛋白为原料，通过碱性蛋白酶及风味蛋白酶酶解，再经过分离纯化得到纯化的特异性金属Ca螯合肽，氨基酸全序列为：vevd。本发明制备的金属螯合肽可用于生产新型的金属Ca补充剂—蛋白肽－钙，其具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充氨基酸和钙，是钙补充剂的首选。本发明为章鱼蛋白的应用提供了一条新思路。

Description

一种利用双酶协同水解制备章鱼钙螯合蛋白肽的方法

技术领域

本发明涉及一种金属Ca螯合肽，更具体地涉及了一种利用碱性蛋白酶和风味蛋白酶二步分别酶解章鱼蛋白制备的Ca螯合肽，属于生物技术领域。

背景技术

在章鱼的养殖和加工过程中，大量的章鱼下脚料被作为垃圾废弃堆积，腐烂发臭，甚至变质，而造成经济的损失，并引起严重的环境污染等问题。章鱼作为一种高档海产，在进行加工过程中，其废弃下脚料的比例可占达45%以上，包括内脏、软骨、眼球、脖子等，而这些下脚料中含有丰富的蛋白质、氨基酸及一些活性成分如牛磺酸、肉碱等，却都未得到充分利用。目前，国内外多是关于章鱼的生命体征及信息物质等方面的研究，而关于章鱼下脚料的开发利用，及其副产品的研发探究的报道甚少。随着活性肽研究与产品开发的兴起，我们发现章鱼蛋白源生物活性肽具有极高的营养价值、食用安全性及生理保健功能，可作为功能性食品或食品添加剂乃至药品应用到人们日常生活中。

目前，钙元素缺乏是全球性的营养问题，我国人民由于以植物性膳食为主，缺钙的现象更加严重，因此补钙成为我国膳食营养研究中的重要课题。传统的无机钙盐，如碳酸钙、磷酸钙、氯化钙等，对维生素有一定破坏作用，生物学效价较低；有机钙盐，如柠檬酸钙、乳酸钙、葡萄糖钙等，虽然钙吸收率有所提高，但其溶解度大易溶失，且价格高。研究表明，蛋白肽螯合钙由于其独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、安全无毒、价格低、可同时补充多肽和钙，而成为补钙首选。

因此，如何获得具有金属螯合钙活性的肽，就成为制备新型钙补充剂迫切的研究方向。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种利用碱性蛋白酶及风味蛋白酶二步酶解章鱼蛋白制备的金属螯合肽，使金属Ca螯合活性得以高效地实现。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种金属Ca螯合肽，是由4个氨基酸所构成的四肽。所述多肽的氨基酸序列为：vevd。

一种金属Ca螯合肽的制备方法，以章鱼蛋白为原料，采用碱性蛋白酶及风味蛋白酶复配对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。

所述酶解条件为：酶解章鱼下脚料的最适酶解条件为料液比1:6，酶解时间5.5h，温度51℃；在碱性蛋白酶酶解的基础上，再添加风味蛋白酶进一步酶解。

所述酶为碱性蛋白酶和风味蛋白酶，双酶分步水解的最优条件是：在碱性蛋白酶酶解5.5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3.5h。

所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5MNaCl的0.02mol/LpH9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，洗脱峰在214nm下进行测量；收集具有最高Ca螯合活性的峰，再用SephadexG-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高Ca螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-90%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为45min，流速为2mL/min，收集具有最高金属Ca螯合活性的峰即保留时间为31.212min的洗脱峰,具有最高金属Ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。

本发明采取的具体步骤如下：

(1)章鱼蛋白酶解条件的优化

本技术所采用的章鱼蛋白来自东山博广天兴食品股份有限公司（中国·福建），酶购自诺维信生物技术有限公司（中国·天津）。采用单因素实验，分别对四个酶解因素进行考察，分别为底物浓度（1%，3%，5%和7%）、酶解温度（40，50，55和60℃）、料液比（1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7，w/v）以及酶解时间（1,3,5,7,9小时）。称取一定质量章鱼蛋白溶解于蒸馏水中，然后用2mol/LNaOH将其pH调节至8.0。先将该溶液水浴加热到需要温度，接着再按不同的酶-底物配比加入相应量的酶，按照预定的反应时间开始反应。接着再在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟。上清液收集后，分别对金属Ca螯合活性进行测定，以确定最佳酶解条件。得到具有最大金属螯合活性的酶解液的酶解条件是：底物浓度5%,酶解pH为8.0、最适酶解条件为料液比1:6，酶解时间5.5h，温度51℃。在碱性蛋白酶酶解5.5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3.5h，底物浓度5%,酶解pH为8.0、最适酶解条件为料液比1:6，温度51℃。

(2)酶解产物的分离、纯化

先在最佳酶解条件下进行酶解，得到的酶解产物先经过TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱（长100cm，外径2.0cm）进行分离，洗脱液为浓度梯度为0-0.5M的NaCl的0.02mol/LpH9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，洗脱峰在214nm下进行测量；收集具有最高Ca螯合活性的峰，再用SephadexG-25凝胶过滤色谱（长50cm，外径1.6cm）进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高Ca螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-90%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为45min，流速为2mL/min，收集具有最高金属Ca螯合活性的峰即保留时间为31.212min的洗脱峰,具有最高金属Ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。

(3)金属螯合活性的测试

钙螯合活性的测试是金属螯合肽对钙离子的螯合作用。本发明将1mL5mmol/L的CaCl₂和2mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH8.0）加入具塞试管中，再加入1mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃温育2h，取出后10000r/min常温离心10min。取1mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5mL，摇匀。放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。

标准曲线的制作：分别取标准Ca工作液（10ug/mL）0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL于10mL试管中，分别加去离子水1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0mL，加入邻-甲酚酞显色液5mL，摇匀，放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值。以可溶性钙含量（ug/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标做图，得标准曲线公式为：y=0.0973x-0.0401，R2=0.9996。

（4）氨基酸序列测定

利用ESI质谱仪(WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS,WatersCo.,U.S.A)测定特异性金属Ca螯合肽的氨基酸全序列为：vevd。

本发明立足于多肽具备与金属钙离子螯合的作用位点，能够与其形成稳定的化合物，且多肽-金属Ca螯合物具有独特的螯合体制和转运机制，易被吸收、可同时补充氨基酸和金属的理论基础，以来自于章鱼的章鱼蛋白为原材料，通过碱性蛋白酶及风味蛋白酶的切割条件控制，切割制备具有高金属Ca螯合活性的肽，而使金属Ca螯合活性得以高效地实现。本发明为章鱼蛋白的应用提供了一条新思路。

附图说明

图1纯化章鱼蛋白源金属螯合肽的RP-HPLC-C18色谱图。

具体实施方式

实施例1

制备方法如下：

称取5.0克章鱼蛋白溶解于100ml蒸馏水中，然后用2mol/LNaOH将其pH调节至8.0。先将该溶液水浴加热到51℃，接着再按照底物浓度5%,料液比1:6的条件酶解5.5h。在碱性蛋白酶酶解5.5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3.5h，底物浓度5%,酶解pH为8.0、最适酶解条件为料液比1:6，温度51℃。

碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为2:1，酶解时间为7小时。接着在沸水浴中灭酶10分钟，冷却后再10000rpm离心10分钟，收集上清液备用。

将上清液用TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱（长50cm，外径1.6cm）进行分离，洗脱液为浓度梯度含有0-0.5M的NaCl的0.02mol/LpH9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，收集各峰样品并测定金属Ca螯合活性。

对TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱分离的具有最高金属Ca螯合活性的洗脱峰再进行下一步的分离，用SepadexG-25凝胶过滤色谱（长100cm，外径2.0cm）收集具有最高金属Ca螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-90%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为45min，流速为2mL/min，收集具有最高金属Ca螯合活性的峰即保留时间为31.212min的洗脱峰，具有最高金属Ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。

采用邻-甲酚酞比色法，测定金属螯合肽对钙离子的螯合作用。将1mL5mmol/L的CaCl₂和2mL0.2mol/L的磷酸盐缓冲液（pH8.0）加入具塞试管中，再加入1mL清蛋白肽溶液，置于恒温加热水浴摇床中37℃温育2h，取出后10000r/min常温离心10min。取1mL上清液，加入邻-甲酚酞显色液5mL，摇匀。放置10min后于分光光度计570nm处测定吸光值，将数值代入标准曲线中计算出可溶性钙结合量。

应用TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱、SephadexG-25分子筛、RP-HPLC反相高效液相色谱等分离纯化手段，实现显著活性的章鱼蛋白金属螯合肽的高效分离纯化。

纯化得到的特异性金属螯合肽具有很高的金属Ca螯合活性，由表1可以看出，与酶解液相比，d峰的金属螯合力有了很大提高。

表1纯化的特异性金属螯合肽的金属螯合力

对纯化的特异性金属螯合肽利用ESI质谱仪((WATERSMALDISYNAPTQ-TOFMS,WatersCo.,U.S.A)测定特异性金属螯合肽的氨基酸序列。所述金属螯合肽的氨基酸序列为：vevd。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>东山博广天兴食品股份有限公司

<120>一种利用双酶协同水解制备章鱼钙螯合蛋白肽的方法

<130>1

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>4

<212>PRT

<213>金属螯合肽

<400>1

ValGluValAsp

1

Claims (6)

1.一种具有金属钙螯合能力的蛋白肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为：vevd。

2.根据权利要求1所述的一种具有金属钙螯合能力的蛋白肽，其特征在于：所述金属为Ca。

3.一种如权利要求1所述的一种具有金属钙螯合能力的蛋白肽的制备方法，其特征在于：以章鱼蛋白为原料，分别采用碱性蛋白酶及风味蛋白酶二步对其进行酶解，分离纯化、冷冻干燥得到金属螯合肽。

4.根据权利要求3所述的一种具有金属钙螯合能力的蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述酶解条件为酶解章鱼下脚料的最适酶解条件为料液比1:6，酶解时间5.5h，温度51℃；在碱性蛋白酶酶解的基础上，再添加风味蛋白酶进一步酶解。

5.根据权利要求3所述的一种金属螯合肽的制备方法，其特征在于：所述酶为碱性蛋白酶和风味蛋白酶，双酶分步水解的最优条件是：在碱性蛋白酶酶解5.5h后，加入风味蛋白酶继续酶解3.5h。

6.根据权利要求3所述的一种具有金属钙螯合能力的蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述分离纯化的具体步骤为：酶解产物首先利用TOYOPEARLDEAE-650M阴离子交换色谱进行分离，洗脱液为浓度梯度为含有0-0.5MNaCl的0.02mol/LpH9.0的磷酸缓冲液，流速为0.5mL/min，洗脱峰在214nm下进行测量；收集具有最高金属螯合活性的峰，再用SephadexG-25凝胶过滤色谱进行分离，洗脱液为去离子水，流速为0.3mL/min，洗脱峰在214nm下进行测定；收集具有最高金属螯合活性的峰，利用半制备RP-HPLC-C18反相高效液相色谱再进行进一步分离，分离条件是用0-90%（v/v）乙腈溶液作为洗脱液梯度洗脱，至90%乙腈和10%水（v/v）的混合液结束，进行梯度洗脱，洗脱时间为45min，流速为2mL/min，收集具有最高金属Ca螯合活性的峰即保留时间为31.212min的洗脱峰,具有最高金属Ca螯合活性，得到所述的金属螯合肽。