CN105648013A - 一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。本发明工艺条件下制备得到的胶原蛋白肽产品，不仅水解度、DPPH清除率、多肽转化率等均较为理想，而且97.63％胶原蛋白肽分子量小于2000Da，具有较好的品质和较高的利用价值；本发明对鱿鱼皮胶原蛋白肽后期进一步的分离纯化及应用具有较高的理论指导意义。

Description

一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法
技术领域
本发明涉及一种制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，尤其是涉及一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法。
背景技术
随着我国水产品加工业的迅猛发展，加工过程中产生大量的废弃物，包括鱼皮、鱼鳞和鱼骨等，约占鱼体总重的50～70％。但是水产品原料利用率低，大量水产品边角料和废弃料被加工成饲料，没有进行精深加工，造成资源的极大浪费，更严重的是导致环境污染。同时，水产加工原料利用率低、高附加值产品稀少等成为了水产加工业面临的最为突出的问题，严重限制了水产加工业产业链的延伸和可持续发展。
水产品加工副产物胶原含量很高，且与陆生动物来源的胶原蛋白相比，水产胶原蛋白具有更高的安全性。胶原蛋白肽在消化、吸收、营养等方面具有很多优势，且由于活性中心的暴露而具有很多独特的生理活性，如抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、预防关节炎、降血压、促进伤口愈合、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能。当前，胶原蛋白肽已经被广泛的用于食品、生物医药及美容化妆品、饲料添加剂以及其他领域。
胶原蛋白肽的研究与开发已成为近年来的热点，如何快速高效的提取纯化胶原蛋白肽成为关键。
发明内容
本发明提供了一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，通过该工艺方法可以得到较好品质的胶原蛋白肽产品。
一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。
作为优选，原料预处理的步骤为：将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5％NaOH溶液浸泡12h，清水洗净之后，切碎，真空包装后贮藏于-20℃冰箱。
作为优选，碱性蛋白酶的加酶量为0.2～0.4％，碱性蛋白酶水解pH为9.5～10.5，碱性蛋白酶水解温度为47.5～52.5℃，碱性蛋白酶水解时间为3～5h。pH、酶解时间、酶解温度、蛋白酶加酶量对酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽转化率均会产生不同影响。
作为优选，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1：0.5～3。木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比不同，其酶解液抗氧化活性、水解度、多肽转化率均会有所不同。
作为优选，复合蛋白酶的加酶量为0.2～0.4％，复合蛋白酶水解pH为7～8，复合蛋白酶水解温度为50～55℃，复合蛋白酶水解时间为2～5h。pH、酶解时间、酶解温度、蛋白酶加酶量对酶解液抗氧化活性、酶解液水解度、多肽转化率均会产生不同影响。
作为优选，先用0.3％碱性蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4h，再用0.4％复合蛋白酶在pH7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5h，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1：2。结果酶解液的水解度可达28.89％、DPPH清除率为88.24％，多肽转化率为49.74％，同时84.56％的胶原蛋白肽分子量分布介于180Da～2000Da之间，可以得到较好品质的胶原蛋白肽产品。
作为优选，水解后得到的胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤、二级纳滤膜过滤后，再经过反渗透纳滤，最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤，其主要除去活性炭、大分子、悬浮物等杂质，二级纳滤膜过滤，其主要用于胶原蛋白肽的分子量分级，根据不同需要，可将绝大多数的胶原蛋白肽集中在某一分子量区间，更易于人体的吸收；再经过反渗透纳滤，其用于产品的脱盐与浓缩，在常温下，使得胶原蛋白肽成为低盐母液，并可同时浓缩胶原蛋白肽；最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。
本发明工艺条件下制备得到的胶原蛋白肽产品，不仅水解度、DPPH清除率、多肽转化率等均较为理想，而且97.63％胶原蛋白肽分子量小于2000Da，具有较好的品质和较高的利用价值；本发明对鱿鱼皮胶原蛋白肽后期进一步的分离纯化及应用具有较高的的理论指导意义。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并不限于此。
材料与试剂
鱿鱼皮：购于舟山鱿鱼加工厂，清洗沥干后贮藏于-20℃冰箱。
碱性蛋白酶(2.4AU/g)、风味蛋白酶(500LAPU/g)：诺维信公司；木瓜蛋白酶(200000U/g)：广西南宁庞博生物工程有限公司；Gly-Gly-Tyr-Arg：Sigma公司；二苯代苦味酰基自由基(DPPH)、硫酸铜、浓硫酸、硫酸钾、茚三酮、果糖、甘氨酸、三氯乙酸、无水乙醇、氢氧化钠、浓盐酸等均为分析纯。
仪器与设备
HH2型数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；RE-52型旋转蒸发仪：上海嘉鹏科技有限公司；UV-2550紫外可见分光光度计：日本SHIMADZU公司；FD1.0-60型冷冻干燥机：丹麦Heto公司；台式冷冻高速离心机：美国ThermoScientific公司；Milli-Q超纯水装置：美国MILLIPORE公司；Kjeltec2300全自动凯氏定氮仪：瑞典FOSS公司；Waters600高效液相色谱仪，美国Waters公司；DELTA320pH计：瑞士METTLERTOLEDO公司；JOYN-8000T喷雾干燥机：上海乔跃实业有限公司。
参照图1，一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。
具体步骤如下：
原料预处理
将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5％NaOH溶液浸泡12h，去除鱿鱼皮上的杂蛋白。清水洗净之后，切碎，真空包装后贮藏于-20℃冰箱，用于后期试验。
酶解过程
取20g鱿鱼皮置于锥形瓶中，按1：4(质量比)的比例加水，调节至合适pH，按适当的比例添加蛋白酶，封住瓶口后置于水浴锅中磁力搅拌水解一定时间，取出置沸水中灭酶10min，冷却摇匀后离心(4000r/min，10min)，得到胶原蛋白水解液，贮藏于4℃冰箱；其中，添加蛋白酶的过程为：先经一定量(0.2～0.4％)的碱性蛋白酶在一定pH(9.5～10.5)及温度条件(47.5～52.5℃)下水解一段时间(3～5h)后，再经一定量(0.2～0.4％)的复合蛋白酶在一定pH(7～8)及温度条件(50～55℃)下继续水解一段时间(2～5h)得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1：0.5～3。即风味蛋白酶与木瓜蛋白酶在碱性蛋白酶酶解液基础上进行。
胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤，其主要除去活性炭、大分子、悬浮物等杂质，二级纳滤膜过滤，其主要用于胶原蛋白肽的分子量分级，根据不同需要，可将绝大多数的胶原蛋白肽集中在某一分子量区间，更易于人体的吸收；再经过反渗透纳滤，其用于产品的脱盐与浓缩，在常温下，使得胶原蛋白肽成为低盐母液，并可同时浓缩胶原蛋白肽；最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。
水解度的测定
总氮的测定：凯氏定氮法，参照GB5009.5-2010《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》；
游离氨基氮的测定：取0.1000g干燥过的甘氨酸定容至100mL，取此液分别稀释成2μg/mL～20μg/mL的溶液用于标准曲线绘制。取2mL稀释液加入1.0mL茚三酮显色剂，摇匀后于沸水浴中加热15min，冷却后加入5mL40％乙醇溶液混匀，静置15min后于570nm处测定吸光值A，得到的回归方程为y＝0.03382x+0.11274，R2＝0.992，甘氨酸的分子量为75.07Da，所以换算成-NH2基的μmol数的A-C关系为：C＝0.3939A-0.0444。测定样品中-NH2基时，先将水解蛋白液稀释100倍，取0.40mL稀释液于试管中并加1.60mL超纯水、1.0mL显色剂，以后操作同标准曲线。水解度计算公式为：水解度(DH)＝(酶解液中总氮量/氨基态氮含量)×100％。
多肽转化率的测定
先制作标准曲线，用5％TCA溶液配制不同浓度的Gly-Gly-Tyr-Arg四肽标准溶液，取4.8mL标准溶液，加入3.2mL双缩脲试剂，混匀后静置10min，2000r/min离心10min，取上清液于540nm处测定吸光值，得到回归方程y＝0.3596x+0.0012，R2＝0.998。测定样品中的多肽含量时，先取2.5mL样品溶液，加入2.5mL10％的三氯乙酸溶液，混匀后静置10min，4000r/min下离心15min，将上清液转移到50mL容量瓶中，并用5％TCA定容，摇匀，以后操作同标准曲线。多肽转化率(％)＝(原料总蛋白含量/多肽含量)×100％。
DPPH清除率测定
取蛋白酶解液浓缩，喷雾干燥得鱿鱼皮胶原蛋白肽粉末。配制5mg/mL胶原蛋白肽溶液，测定其DPPH清除率。取2mLDPPH溶液与同体积样品液混合摇匀在黑暗处反应30min，于517nm波长处测定其吸光值。抑制率计算公式如下：
DPPH清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)/A0]×100％
式中：Ai为DPPH与样品的混合液的吸光度：Aj为乙醇与样品的混合液的吸光度；A0为DPPH与水的混合液的吸光度。
胶原蛋白肽分子量分布测定
通过Waters600高效液相色谱仪测量胶原蛋白肽分子量分布，色谱柱是TSKgel2000SWXL300mm×7.8nm。吸取2mL样品于容量瓶中，用流动相乙腈/水/三氟乙酸(45/55/0.1)定容，微孔过滤膜过滤后进样，柱温为30℃，流速为0.5mL/min，在220nm下检测。
时间与加酶量的影响
先用碱性蛋白酶在酶解温度为47.5℃、pH为10.5的条件下进行酶解，在用1：2(质量比)的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶(复合蛋白酶)在pH7.5、温度50℃的条件下二次酶解，分别考察时间与加酶量的影响。结果如表1所示：由极差分析结果可以看出，以水解度为指标的因素影响程度依次为：C、D、A、B，即复合蛋白酶酶解时间＞复合蛋白酶加酶量＞碱性蛋白酶酶解时间＞碱性蛋白酶加酶量，其最佳组合为：A2B2C3D3；以酶解液抗氧化活性为指标的因素影响程度依次为：D、C、B、A，即复合蛋白酶加酶量＞复合蛋白酶酶解时间＞碱性蛋白酶加酶量＞碱性蛋白酶酶解时间，最佳组合为：A1B3C3D3；以多肽转化率为指标的因素影响程度依次为：A、B、C、D，即碱性蛋白酶酶解时间＞碱性蛋白酶加酶量＞复合蛋白酶酶解时间＞复合蛋白酶加酶量，最佳组合为：A1B2C2D2。
表1
注：时间a：第一步酶解时间(碱性蛋白酶酶解时间)；时间b：第二步酶解时间(复合蛋白酶酶解时间)。
从结果可以看出，碱性蛋白酶第一步水解的时间对最终的酶解液多肽转化率影响很大，因此第一步水解时间选择4h；碱性蛋白酶加酶量对酶解液多肽转化率也是排在第二位的，因此选择0.3％；木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的第二步水解时间对水解度的影响是排在第一位的，所以选择4.5h；木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶的加酶量对酶解液抗氧化活性的影响是排第一位的，所以加酶量选择0.4％。经过综合分析可知，本试验的较优条件为A1B2C3D3，即先用0.3％碱性蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4h，再用总量为0.4％的木瓜蛋白酶复合风味蛋白酶按1：2(质量比)在pH7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5h。通过对工艺进行验证试验可知鱿鱼皮在该条件下酶解，其水解度可达28.89％、DPPH清除率为88.24％，多肽转化率为49.74％。
在上述优化后工艺条件下制备获得的胶原蛋白肽分子量分布情况如表2所示：
表2
由表2可以发现经过碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶的两步水解后制备获得的胶原蛋白肽分子量较低，97.63％胶原蛋白肽分子量小于2000Da，84.56％胶原蛋白肽分子量分布介于180Da～2000Da之间，其中，87.25％胶原蛋白肽分子量小于1000Da。表明碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风味蛋白酶3种酶复合酶解有利于小分子肽的形成。十个氨基酸组成的小肽是比较好的产品，分子量小于1500Da，而分子量越小，越容易被有效吸收。所以，通过此工艺提取的胶原蛋白肽品质较好，符合市场需求。另外，产品中分子量小于180Da的部分比例较高，这可能与风味蛋白酶的酶解机制有关。风味蛋白酶为一种端肽酶，易将蛋白水解成氨基酸，但它对产品风味的改善有很大的帮助。

Claims (7)

1.一种酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：原料鱿鱼皮预处理后，先经碱性蛋白酶水解后，再经复合蛋白酶继续水解得到胶原蛋白水解液，其中，复合蛋白酶由木瓜蛋白酶与风味蛋白酶组成。
2.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：原料预处理的步骤为：将鱿鱼皮解冻清洗干净，用0.5％NaOH溶液浸泡12h，清水洗净之后，切碎，真空包装后贮藏于-20℃冰箱。
3.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：碱性蛋白酶的加酶量为0.2～0.4％，碱性蛋白酶水解pH为9.5～10.5，碱性蛋白酶水解温度为47.5～52.5℃，碱性蛋白酶水解时间为3～5h。
4.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1：0.5～3。
5.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：复合蛋白酶的加酶量为0.2～0.4％，复合蛋白酶水解pH为7～8，复合蛋白酶水解温度为50～55℃，复合蛋白酶水解时间为2～5h。
6.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：先用0.3％碱性蛋白酶在pH10.5、温度47.5℃条件下水解4h，再用0.4％复合蛋白酶在pH7.5、温度50℃的条件下继续水解4.5h，复合蛋白酶中，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶的质量比为1：2。
7.根据权利要求1所述的酶法制备鱿鱼皮胶原蛋白肽的工艺方法，其特征在于：水解后得到的胶原蛋白水解液经活性炭过滤后，经过超滤、二级纳滤膜过滤后，再经过反渗透纳滤，最后经过喷雾干燥得到分级的胶原蛋白肽粉。
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