CN111234007A - 一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，所述胶原蛋白活性肽的分子量为200‑600道尔顿。本发明还公开了上述的胶原蛋白活性肽在生产外用和/或内服促进伤口愈合的药品中的应用。本发明通过膜分离技术制备出分子量为200‑600道尔顿的胶原蛋白活性肽，通过动物实验验证能迅速止血止痛，且参与修复愈合过程中的原材料作用，加速伤口愈合，且愈合后的伤口无疤痕。

Description

一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽。

背景技术

胶原蛋白是一类在生物体中广泛存在的大分子结构蛋白，主要分布于动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌键、韧带和血管中，是结缔组织中最重要的结构蛋白质，起着支撑器官、保护机体的作用。胶原蛋白肽是胶原蛋白经蛋白酶水解后获得的一系列小分子肽，它们分子量小、易吸收，具有多种生理活性功能。胶原蛋白及其水解制品已广泛应用于医药、功能食品、化妆品等领域。

相对于动物来源的胶原蛋白，水产来源的胶原蛋白制品因更加安全且氨基酸配比更适合人类、更便于吸收而受到消费者青睐。随着水产品加工业的快速发展，产生了大量的鱼皮、鱼鳞、鱼骨等废弃物，如不加以充分利用，不仅会污染环境，也浪费了资源。

因此，加强对水产品的废弃鱼鳞鱼皮的加工利用和实现渔业生产的可持续发展具有重要的意义。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，用以解决现有水产品的废弃鱼鳞鱼皮得不到合理利用的问题。

为实现上述目的，本发明实施例的第一方面提供了一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，所述胶原蛋白活性肽的分子量为200-600道尔顿。

进一步地，所述胶原蛋白活性肽的制备方法为：

在质量分数为10～35％的胶原蛋白水溶液中，加入蛋白水解酶，在50-70℃、pH为6-7的条件下酶解6-12h，然后80-90℃水浴灭酶5-20min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

进一步地，所述胶原蛋白水溶液的制备方法：收集鲜活鱼鳞或鱼皮，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮而成。

外缘软膜是粘附在鱼鳞或鱼皮表面的一层软膜，因为直接接触水域，含大量菌类、重金属及灰分，且腥气大，严重影响产品的色泽与味觉。

现有技术中，通常采用盐酸等浓酸或浓碱对鱼鳞、鱼皮、猪牛羊皮骨进行浸泡处理，该处理方法简单，易于掌控，成本低，但是对原料表面的氨基酸组织烧伤性极大，故不符合食品的生产要求，且对环境污染影响较大。

本申请采用自主研发的清洗设备，通过仅添加清水即可彻底有效除去附在鱼鳞或鱼皮表面的粘着物，同时还能避免鱼鳞或鱼皮表面的氨基酸组织受到浓酸浓碱的损伤，且有利于环境保护。

进一步地，所述胶原蛋白为淡水鱼和/或海鱼胶原蛋白。进一步地，所述胶原蛋白以鲤鱼、草鱼或罗非鱼的鲜活鱼鳞、深海鳕鱼的鲜活鱼皮为原料提取得到。

现有技术中，通常采用盐酸等浓酸或浓碱对清洗好的鱼鳞、鱼皮、猪牛羊皮骨等进行二次浸泡处理，释放出胶原蛋白，作为提取物。但是通过上述方法提取得到的胶原蛋白，远比第一次清洗对氨基酸的损伤大得多，且对环境造成二次污染，故不可取。

本申请采用自主研发的不锈钢恒温锅，添加纯净水蒸煮，水温在不同时间段控制在60-80℃范围，对胶原蛋白肽的基础组织氨基酸无损伤，全面保护了胶原蛋白肽的活性，因此是最具活力的胶原蛋白肽。

进一步地，所述蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的0.8-1.5％wt。

进一步地，所述蛋白水解酶是由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和葡萄糖组成的复合物。

现有技术中，胶原蛋白肽的干燥过程多采用高温喷雾干燥，对氨基酸造成第三次损伤，致使该技术制作的胶原蛋白肽基本失去活性。

本申请采用最新低温喷雾干燥技术，再次保护了氨基酸不受损伤。由以上技术制作的胶原蛋白肽，全面保护了胶原蛋白肽的活性，被称为胶原蛋白小分子活性肽(简称胶原蛋白活性肽)。

进一步地，所述伤口包括由外力损伤和烧烫伤导致的创面。

本发明实施例的第二方面提供上述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽在生产外用和/或内服药品中的应用。

进一步地，所述外用药品为创口贴，创口贴以促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽为药效成分。

进一步地，所述内服药品可以以上述促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽为活性成分，加上药学上可接受的载体或稀释剂制成制剂，所述制剂为喷雾剂、胶囊剂、片剂、颗粒剂、丸剂中的任一种。

本发明实施例具有如下优点：

本发明通过膜分离技术制备出分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白活性肽，通过动物实验验证胶原蛋白活性肽能迅速止血止痛，且参与修复愈合过程中的原材料作用，加速伤口愈合，且愈合后的伤口无疤痕。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中蛋白水解酶是由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和葡萄糖组成的复合物。

实施例1

本实施例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法为：

收集鲤鱼鱼鳞，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮，得到质量分数为10～30％的鲤鱼鱼鳞胶原蛋白水溶液，加入蛋白水解酶，蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的1％wt，在60℃、pH为6的条件下酶解10h，然后90℃水浴灭酶15min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

实施例2

本实施例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法为：

收集草鱼鱼鳞，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮，得到质量分数为15～30％的草鱼鱼鳞胶原蛋白水溶液，加入蛋白水解酶，蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的1.2％wt，在50℃、pH为6.5的条件下酶解8h，然后85℃水浴灭酶8min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

实施例3

本实施例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法为：

收集罗非鱼鱼鳞，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮，得到质量分数为10～35％的罗非鱼鱼鳞胶原蛋白水溶液，加入蛋白水解酶，蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的0.8％wt，在50℃、pH为7的条件下酶解10h，然后80℃水浴灭酶20min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

实施例4

本实施例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法为：

收集深海鳕鱼鱼皮，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮，得到质量分数为20～30％的深海鳕鱼鱼皮胶原蛋白水溶液，加入蛋白水解酶，蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的1.4％wt，在55℃、pH为6.8的条件下酶解12h，然后85℃水浴灭酶10min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

实施例5

本实施例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法为：

收集鲤鱼鱼鳞，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮，得到质量分数为10～30％的鲤鱼鱼鳞胶原蛋白水溶液，加入蛋白水解酶，蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的1.2％wt，在65℃、pH为6.2的条件下酶解10h，然后90℃水浴灭酶12min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

对比例1

本对比例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法与实施例1的不同之处仅在于：得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为2000-2500道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

对比例2

本对比例的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽的制备方法与实施例1的不同之处仅在于：得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为2500-3000道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

实验例1

本实验例用于说明本发明实施例的胶原蛋白活性肽对外力损伤导致的创面具有促进伤口愈合的作用。

1材料

样品：本发明实施例1、3、5及对比例1-2制得的胶原蛋白活性肽。

实验动物：选择成年健康雄性新西兰兔72只，体质量2.0-2.5kg，标准动物饲料喂养，清洁饮水，自由取食，由广东省医学实验动物中心提供。

2实验方法

将所有兔随机分为试验1-3组、对比例1-2组和模型对照组，每组12只。

动物模型的制作：实验前2d将动物单笼喂养，自由饮水及摄食，术前禁食12h，采用复合速眠新肌肉注射麻醉，背部去毛，面积为15cm×10cm，该区域用碘伏消毒、铺巾后，用特制打孔器在背部脊柱左侧1.5cm处切割1个圆形创面，直径为1.5cm，面积1.77cm²，深至皮下浅筋膜，术后动物自由进食、水。

试验1-3组：在伤口处以1mm-1.5mm的厚度超范围外覆本发明实施例1、3、5制得的胶原蛋白活性肽，间隔12小时给药一次，同时将胶原蛋白活性肽配制成10mg/ml的水溶液，每天灌胃5ml。

对比1-2组：在伤口处以1mm-1.5mm的厚度超范围外覆本发明对比例1制得的胶原蛋白活性肽，间隔12小时给药一次，同时将胶原蛋白活性肽配制成10mg/ml的水溶液，每天灌胃5ml。

模型对照组：造模后不作任何处理。

3评价指标及方法

伤口及其周围组织的创伤反应评定：①Ⅰ期反应。伤口有轻度肿胀。②Ⅱ期反应。伤口及周围组织轻度水肿，皮下有散在淤血斑。③Ⅲ期反应。切口有少量血痂附着，伤口及周围组织明显水肿。

伤口恢复情况评定：①优。伤口组织无肿胀，皮肤青紫现象消失。②良。伤口组织轻度肿胀，皮下淤血斑消失，青紫现象逐渐消退。③差。伤口及周围组织肿胀。

4结果

治疗第3天，各组兔的伤口愈合的肉眼观察结果见表1。

表1

组别	例数	Ⅰ期	Ⅱ期	Ⅲ期
					试验1组	12	5	4	3
试验2组	12	6	3	3
					试验3组	12	6	4	2
对比1组	12	3	4	5
					对比2组	12	2	3	7
模型对照组	12	0	1	11

各组伤口恢复情况比较结果见表2。

表2

结果表明：术后第5和10天，试验组兔的伤口愈合效果明显好于对比例组，说明本发明实施例的胶原蛋白活性肽具有良好的促进伤口愈合的能力。

实验例2

本实验例用于说明本发明实施例的胶原蛋白活性肽对于烧烫伤导致的创面具有促进伤口愈合的作用。

1材料

样品：本发明实施例2、4及对比例1-2制得的胶原蛋白活性肽。

实验动物：选择清洁剂KM小鼠75只，6-8周，体质量18-22g，标准动物饲料喂养，清洁饮水，自由取食，由广东省医学实验动物中心提供。

2实验方法

将所有小鼠随机分为试验1-2组、对比1-2组和模型对照组，每组15只。

动物模型的制作：实验前24h以脱脂棉沾取10％硫化钠涂抹于小鼠背部，约10s后，以温水轻轻洗去药液及鼠毛，脱去小鼠背毛，面积略大于2×3cm²；实验时，取一10×10cm的硬纸板，中央以手术刀划出一个2×3cm的小孔，取一个500ml的烧杯，装入250ml蒸馏水。以AB胶将纸板沾在烧杯口上，纸板边缘超过烧杯口，以AB胶将接缝粘牢。将烧杯置于1000W电炉上加热，待水蒸汽从纸板孔喷出后开始实验。以乙醚麻醉小鼠后，以卵圆钳同定好小鼠，将小鼠脱毛部位正对小孔，利用水蒸汽灼烫小鼠背部，时间分别为2s，造成2×3cm²面积的烫伤，造模成功，术后动物自由进食、水。

试验1-2组：在伤口处以1mm-1.5mm的厚度超范围外覆本发明实施例2、4制得的胶原蛋白活性肽，间隔6小时给药一次，同时将胶原蛋白活性肽配制成10mg/ml的水溶液，每天灌胃2ml。

对比1-2组：在伤口处以1mm-1.5mm的厚度超范围外覆本发明对比例1制得的胶原蛋白活性肽，间隔6小时给药一次，同时将胶原蛋白活性肽配制成10mg/ml的水溶液，每天灌胃2ml。

模型对照组：造模后不作任何处理。

3评价指标及方法

结果判断标准：①愈合：烫伤处结痂完整脱落，修复后组织表面新鲜且较平坦。②基本愈合：烫伤处间断脱痂，新生组织表面不够平坦且有小范围的少许渗出物，但无明显感染灶。③感染：痂周出现明显红肿，痂下有脓液或溃烂面。

4结果

各组伤口恢复情况比较结果见表3。

表3

结果表明：相比于对比例组，本发明实施例的胶原蛋白活性肽具有良好的促进伤口愈合的能力，缩短愈合时间，提高伤口恢复质量。

本发明的胶原蛋白活性肽的临床使用情况：伤口不严重者(划伤口子小，深度浅)敷本发明的胶原蛋白肽后，不结痂，1～2天痊愈；伤口较严重者(划伤口子较大，深度较深)敷本发明的胶原蛋白肽，结痂厚度是其他创口贴结痂厚度的二分之一，恢复期缩短二分之一；伤口严重者(划伤口子大，深度深)，酒精消毒，敷本发明的胶原蛋白活性肽后，纱布包扎，第二天换药如未结痂，继续敷本品，如果结痂，可稀释后涂于伤口处。以上患者，尤其是伤口较严重、严重以及需要做手术的患者，可同时口服本品，加快愈合。

结果表明：本发明的胶原蛋白活性肽的皮肤渗透能力强、治愈效果显著。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述胶原蛋白活性肽的分子量为200-600道尔顿。

2.根据权利要求1所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述胶原蛋白活性肽的制备方法为：

在质量分数为10-35％的胶原蛋白水溶液中，加入蛋白水解酶，在50-70℃、pH为6-7的条件下酶解6-12h，然后80-90℃水浴灭酶5-20min，多重过滤，得到的上清液经超滤膜过滤截留，分离得到分子量为200-600道尔顿的胶原蛋白肽的水溶液，减压浓缩，低温喷雾干燥成粉末。

3.根据权利要求2所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述胶原蛋白水溶液的制备方法：收集鲜活鱼鳞或鱼皮，除去外缘软膜，清水洗净，置于不锈钢锅内，加水蒸煮而成。

4.根据权利要求2所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述胶原蛋白为淡水鱼和/或海鱼胶原蛋白。

5.根据权利要求2所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述蛋白水解酶的添加量为胶原蛋白的0.8-1.5％wt。

6.根据权利要求1所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述蛋白水解酶是由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶和葡萄糖组成的复合物。

7.根据权利要求1所述的促进伤口愈合的胶原蛋白活性肽，其特征在于，所述伤口包括由外力损伤和烧烫伤导致的创面。

8.权利要求1-7任一所述的胶原蛋白活性肽在生产外用和/或内服促进伤口愈合的药品中的应用。

9.根据权利要求8所述的胶原蛋白活性肽在生产外用和/或内服促进伤口愈合的药品中的应用，其特征在于，所述外用药品为创口贴和外用粉剂。