CN103747793A

CN103747793A - 含有大豆蛋白质的水解物的组合物

Info

Publication number: CN103747793A
Application number: CN201280040545.4A
Authority: CN
Inventors: 阿部正通; 熊泽益德; 松本康助
Original assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd
Current assignee: SAATSU PHARMECEUTICAL Manufacturing Co Ltd; Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2011-09-12
Filing date: 2012-09-11
Publication date: 2014-04-23
Also published as: WO2013039056A1; JPWO2013039056A1; JP6153469B2

Abstract

本发明的目的在于提供一种具有促进细胞和胶原间的粘附的活性的新型物质。本发明涉及使用大豆蛋白质的水解物，调制用于促进细胞和胶原间的粘附的组合物。

Description

含有大豆蛋白质的水解物的组合物

技术领域

本发明涉及一种用于促进细胞和胶原间的粘附和/或用于促进胶原凝胶的收缩的组合物、以及与其相关的发明。

背景技术

在以人为代表的哺乳动物生物体的真皮内，成纤维细胞与细胞外基质中的胶原粘附是强化并稳定化胶原纤维束的格子状立体结构，并保持肌肤的张力及弹性的原因之一。而且，已知由于老化等原因，如果成纤维细胞对胶原的粘附能力降低，会引起肌肤的张力及弹力的降低。而且已知如果未与胶原纤维粘附而获得支架（足場），成纤维细胞自身的动作（例如各种因子的产生等）也会变得迟钝。而且认为，这些理由引起的真皮细胞功能的降低不仅停留于真皮现象，还会对从真皮向表皮的营养供给及增殖因子的移动等产生不良影响，结果还会影响表皮的细胞功能。根据以上理由，探索促进成纤维细胞和胶原间的粘附的成分。

另外，在皮肤组织中，存在于表皮和真皮的临界线上的基底膜中含有IV型胶原及VII型胶原作为主要成分。而且，如果基底膜和表皮角质细胞间的粘附因紫外线或年龄增加等原因而逐渐减弱松缓，不仅会引起松弛（例如，毛孔的松弛）或皱纹，由于角质细胞无法良好获得贴壁，会降低角质细胞的增殖能力，由此，新陈代谢变差，引起色斑（黑色素的沉积）或暗沉。而且，如果在这样的基底膜和角质细胞之间产生松缓，从作为基底膜的起重要作用的真皮向表皮的营养供给或生长因子的移动变差，皮肤整体的健康状态不良，可能还会导致表皮的变薄等。因此，促进基底膜中的胶原和表皮角质细胞的粘附，使基底膜和表皮角质细胞牢固地粘合，对预防/改善松弛或皱纹、新陈代谢不良以及伴随这些不良的色斑或暗沉、进而表皮的变薄等尤为重要。根据该理由，需要对促进角质细胞和胶原间的粘附的成分进行探索。

而且，近年，作为一种老化现象，生物体内蛋白质的糖化受到关注。而且，也逐渐明确了在生物体内，通过胶原蛋白质糖化而产生的糖化胶原（也称为AGE化胶原）难以与细胞粘附。

而且，至今，作为促进皮肤细胞和胶原间的粘附的材料，已知的是具有特定序列的肽（专利文献1）等。

但是，需要开发更实用的具有促进细胞和胶原间的粘附的活性的材料。特别是需要开发来源于天然材料，能够安全用于生物体且具有高活性的新型材料。

现有技术文献

专利文献

专利文献：国际公开第03/008438号小册子

发明内容

发明所要解决的课题

本发明鉴于上述技术研制而成，其目的在于，提供一种实用的新型材料，其源自天然物，对生物体安全，且能够高度发挥促进细胞和胶原间的粘附的活性。

用于解决课题的技术方案

本发明人等为了解决上述课题而潜心研究，其结果发现，大豆蛋白质的水解物可作为高度促进细胞和胶原间的粘附，具有促进胶原凝胶收缩的活性的、实用的新型材料使用，直至完成本发明。

即，本发明提供以下内容。

[1]含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进细胞和胶原间的粘附的组合物。

[2]含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进含有细胞的胶原凝胶的收缩的组合物。

[3]如[1]或[2]的组合物，其中，所述水解物为通过对大豆蛋白质进行蛋白酶处理而获得的分解物。

[4]如[1]～[3]中任一种的组合物，其中，大豆蛋白质的水解物的平均分子量为300～50000。

本发明书包含作为本申请优先权的基础的日本国专利申请2011-198718号的说明书和/或附图中所述的内容。

发明效果

根据本发明，提供一种实用的新型材料，其能够有效地促进细胞与胶原的粘附，具有较高的促进胶原凝胶收缩的活性。因此，根据本发明，提供一种新型材料，其能够有效防止老化等引起的细胞（特别是成纤维细胞和/或角质细胞）和胶原间的粘附能力降低，强化成纤维细胞和细胞外基质的结合，增加两者的拉伸强度，使真皮紧缩，改善皮肤的皱纹及松弛，恢复肌肤的张力及弹性，进而，强化表皮角质细胞和基底膜的粘附，不仅能够预防/改善松弛或皱纹，还有助于预防/改善新陈代谢降低、色斑、暗沉、表皮的变薄。

附图说明

图1是通过GPC法获得的、表示实施例1的大豆蛋白质水解物的分子量分布的色谱图；

图2是通过GPC法得到的、表示实施例2的大豆蛋白质水解物的分子量分布的色谱图；

图3是通过GPC法得到的、表示实施例3的大豆蛋白质水解物的分子量分布的色谱图。

具体实施方式

以下，详细地说明本发明。在本说明书的全文中，除特别说明外，应理解单数形式的表现也包含其多数形式的概念。另外，除特别说明外，本说明书中使用的用语应理解以在该领域中通常使用的意思所使用的。

本发明提供一种含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进细胞和胶原间的粘附的组合物。

另外，本发明提供一种含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进胶原凝胶的收缩的组合物。

大豆（Glycine max）是一种高约60～70cm的豆科一年生草本植物。公知的是，其种子多作为毛豆等，或加工成豆腐、豆酱（味噌）、酱油等供食用。

用于本发明的大豆蛋白质可以为来源于上述大豆植物的任意的蛋白质，优选的是，可以是来源于大豆植物的种子的任意的蛋白质。在此，来源于大豆植物的蛋白质、或来源于大豆植物的种子的蛋白质是指在大豆植物体或大豆植物的种子中含有的蛋白质，能够以任意的方法提取、分离或提纯的蛋白质。作为大豆植物体，可以举出植物整体或叶、茎、根等各个器官。另外，还可使用由组织培养获得的大豆植物的组织或大豆的培养细胞中所含的蛋白质。作为大豆蛋白质，没有限定，例如可举出，大豆球蛋白、伴大豆球蛋白（优选β伴大豆球蛋白）等。

因此，在本发明中，虽也可使用大豆植物的种子其本身或该种子的碎片物或粉碎物等作为大豆蛋白质，但优选使用从大豆植物中的所有成分分离、提纯而得的蛋白质成分，更优选使用从大豆植物的种子中的所有成分分离、提纯而得的蛋白质成分。这样分离、提纯而得的大豆蛋白质只要其水解物具有促进细胞和胶原间的粘附的功能、和/或具有促进胶原凝胶收缩的功能，可包含有大豆植物或大豆植物的种子中所含的实质上全部种类的蛋白质，另外，也可含有一部分种类的蛋白质。

大豆蛋白质从大豆植物体或大豆植物的种子的分离、提纯可通过公知的蛋白质的分离、提纯方法进行。

作为大豆蛋白质，也可适合使用市售品，例如，可容易地从日清 cosmo-foods（株）、ADM FAR EAST（株）、昭和产业（株）、不二制油（株）、（株）光洋商会等制造商或供应商购得。大豆蛋白质可作为例如脱脂大豆粉末等购得。

此外，在本说明书中，大豆植物的种子不仅指通常称为大豆种子的结构物整体，也包含例如，脱皮大豆种子、脱脂大豆种子（粉末）、由大豆种子整体得到的豆渣（豆腐渣）等。

水解大豆蛋白质的方法可以使用在该领域中公知的任意的方法，例如，可以举出通过用蛋白酶处理而水解的方法、通过用酸或碱处理而水解的方法等，但不限于此。从容易地高效得到希望的分解物这一观点考虑，可优选使用用蛋白酶处理大豆蛋白质的方法。

在通过用蛋白酶处理的方法获得本发明的大豆蛋白质的水解物的情况下，作为在该方法中使用的蛋白酶，没有特别限定，可使用源自动物、植物、微生物的蛋白酶。例如，可以举出嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胱天蛋白酶、菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、组织蛋白酶D、胰蛋白酶、糜蛋白酶、胰酶、枯草杆菌蛋白酶等。另外，也可使用市售的含有蛋白酶的酶制剂。作为酶制剂，可以举出：Sumizyme FL-G、Sumizyme AP、Sumizyme-LP、Sumizyme-FP、Sumizyme-LPL（以上为新日本化学工业制）、蛋白酶A、蛋白酶N、蛋白酶S、Newlase F3G、Newlase A、木瓜蛋白酶W-40、菠萝蛋白酶F、Protin SD-NY10、Protin SD-PC10F（以上为天野酶制）、PROTEX7L、PROTEX14L、Promod223LP、木瓜蛋白酶（以上为Genencor协和制）、Aroase AP-10、Aroase NP-10、Aroase NS、Aroase XA-10、蛋白酶YP-SS、Panchdase NP-2、Panchdase P（以上为Yakult药品工业制）、Papain F、TRYPSIN4.0T、COROLASE N、COROLASE L10、COROLASE7089、VERON L10（以上为樋口商会制）、Orientase20A、Orientase10NL、Orientase90N、Orientase ONS、Tetradze S、Nucleicin（以上为HBI制）、Molsin F（以上为Kikkoman食品制）、Brewers Clarex、Brewers蛋白酶、Varidase AFP、Varidase FP60、Acceleration Enzyme NP50.000（以上为DSM日本制）、Denapsin2P、食品用提纯木瓜蛋白酶、Denatyme AP（以上为Nagasechemtex制）、Neutrase（以上为Novozymes制）、提纯木瓜蛋白酶（以上为三菱化学食品制）、ENZYLON NBS（以上为洛东化成工业制）等，但不限于此。优选为酸性蛋白酶和/或中性蛋白酶。用于本发明的蛋白酶可以仅使用一种，也可两种以上组合使用。另外，在组合使用的情况下，可以同时组合使用两种以上的酶进行水解，也可用两种以上的酶中的某种酶水解后，进而用其它酶水解等依次使用不同的酶。蛋白酶可适合使用市售品。

用于用蛋白酶水解大豆蛋白质的情况下的反应条件没有特别限定，可按照技术常识由本领域技术人员适当选择。例如，在使用市售的蛋白酶的情况下，可以按照其使用说明书使用。作为具体例子，可以列举出如下方式，按照大豆蛋白质浓度一般为0.1～30%（w/v），优选1～10%（w/v）程度的方式在水等溶剂中悬浮（懸濁）含有大豆蛋白质或大豆蛋白质的原料，在该悬浮液（懸濁液）中通常按照0.001～5%（w/v）、优选0.005～3%（w/v）、更优选0.01～1%（w/v）程度的方式添加蛋白酶，进行水解反应。通常可使用30～80℃、优选40～70℃、更优选50～60℃的反应温度。另外，通常可使用2～30小时、优选3～24小时、更优选10～20小时的反应时间。作为反应液的pH，优选为使用的蛋白酶的最佳pH附近。

对于反应的停止方法也没有特别限定，可使用公知的方法。作为该方法，例如可举出加热处理等。例如，通过将上述反应物在80～100℃程度的温度下进行3～20分钟、优选5～15分钟的加热处理，使反应物中所含的蛋白酶失活，可停止酶反应。具体而言，可举出在85℃下15分钟的加热处理或在100℃下5分钟的加热处理等。

通过上述那样的水解反应而得的水解物可根据需要通过本领域技术人员公知的任意方法进一步处理。例如，优选通过过滤等处理，除去该水解物中较大的固体颗粒。过滤条件等没有特别限定，可按照技术常识由本领域技术人员适当选择。例如，在容易引起滤纸堵塞的情况下等，还可优选使用过滤助剂等。

另外，还可减压浓缩上述水解物，接着，通过冷冻干燥，进行粉末化。另外，还可通过喷雾干燥等方法进行粉末化。对减压浓缩及冷冻干燥、喷雾干燥等时使用的条件及机器种类没有特别限定，按照技术常识，可由本领域技术人员适当选择。这样，粉末化后的水解物可直接使用，或溶解于水等溶剂使用。

在大豆蛋白质的水解物中含有分子量或氨基酸序列不同的多种多样的肽。用于本发明的水解物可以是实质上全部含有通过水解大豆蛋白质产生的多种多样的肽的状态，或者，还可以是以是否具有促进细胞和胶原间的粘附的功能为指标，和/或以是否具有促进胶原凝胶收缩的功能为指标，用公知的方法进一步区分、提纯该多种多样的肽而得到的一部分（例如，去除（除く）几乎不影响上述促进粘附功能的肽和/或几乎不影响上述促进收缩功能的肽等）。但为了简便，在实质上全部含有水解大豆蛋白质而得的多种多样的肽的状态下直接使用。此外，是否具有促进成纤维细胞和胶原间的粘附功能例如可如后述的实施例5及7所示的方式进行确认。另外，是否具有促进角质细胞和胶原间的粘附功能例如可如后述实施例6所示的方式进行确认。而且，是否具有胶原凝胶收缩的功能例如可如后述实施例8所示的方式进行确认。

用于本发明的大豆蛋白质的水解物的平均分子量优选为300～50000。从提高对皮肤的渗透性，而得到更高效果的观点考虑，该平均分子量更优选为500～30000，进一步优选为700～20000，进一步更优选为1000～10000，特别优选为2000～10000。还可以根据分子量区分大豆蛋白质的水解物，回收上述分子量范围内含有的水解物，将上述分子量范围的肽区分作为本发明的大豆蛋白质的水解物使用。水解物的平均分子量可通过本领域技术人员公知的任意方法测定，例如，可通过下述实施例所述的凝胶渗透色谱（GPC）法容易地测定。在本说明书中，通过GPC法测定的平均分子量是指“峰值平均分子量”，“峰值平均分子量”是指与色谱图的峰顶(最强强度的峰值)的洗脱时间对应的分子量。

另外，用于本发明的大豆蛋白质的水解物的分子量分布没有特别限定，从能够提高对皮肤的渗透性，得到更高效果的观点考虑，优选为70000以下、更优选100～70000、进一步优选100～50000、特别优选100～30000。此外，水解物的分子量分布可通过本领域技术人员公知的任意的方法测定，例如，可由根据GPC法得到的洗脱曲线容易算出。

如后述实施例所示，大豆蛋白质的水解物能够促进细胞和胶原间的粘附。优选细胞为皮肤细胞，更优选为成纤维细胞及/或角质细胞。现在已知在胶原中有I～XIX型等各种类型的胶原，也指其任一类型的胶原。另外，胶原也可为糖化而AGE化的胶原。本发明的大豆蛋白质的水解物主要促进皮肤的真皮中多含有的I型胶原（胶原类型I)和成纤维细胞间的粘附、或皮肤的基底膜中多含有的IV型胶原（胶原类型IV）和角质细胞间的粘附。另外，本发明的大豆蛋白质的水解物通常也可促进已知的难以与细胞粘附的AGE化胶原和细胞间的粘附。通过在生物体的真皮内，成纤维细胞与细胞外基质中的胶原粘附，胶原形成纤维束构造，由此，强化成纤维细胞和细胞外基质的结合，增加两者的拉伸强度，使真皮紧缩，保持肌肤的张力及弹性。因此，使用大豆蛋白质的水解物可有助于改善上述成纤维细胞和胶原间的粘附能力降低引起的皮肤的皱纹或松弛，或者，用于恢复肌肤的张力或弹性。而且，由于通过表皮角质细胞与基底膜的胶原粘附，并牢固地使表皮和基底膜附着，抑制松弛（例如，毛孔的松弛）或皱纹，还促进了角质细胞的增殖，因此，促进了新陈代谢，并随之可期待改善色斑、暗沉。在此，新陈代谢是指，在皮肤中，在皮肤的基底层产生表皮的角质细胞后，形成角质层，最终脱落。通过新陈代谢，皮肤的细胞重新变为新的细胞。通过促进新陈代谢，缩短新陈代谢所需的时间。另外，通过促进表皮和基底膜的粘附，对表皮的营养供给或转录因子的移动等变得顺利，可接近更健康的皮肤状态（例如，不产生表皮变薄的状态）。因此，使用大豆蛋白质的水解物有助于改善因角质细胞和胶原间的粘附能力降低引起的松弛或皱纹、新陈代谢降低、色斑、暗沉、表皮的变薄。促进细胞和胶原间的粘附的作用可通过如下方法进行测定，例如，在由胶原被覆的培养板中，使用包含上述水解物的培养基培养细胞（例如，皮肤成纤维细胞或皮肤角质细胞）后，清洗板，测量洗不掉而残留于板上的胶原涂层上的细胞数，相对不添加大豆蛋白质的水解物的情况，在残留于胶原涂层上的细胞数显著较多时，可判断促进了各细胞和胶原间的粘附。

另外，大豆蛋白质的水解物具有胶原凝胶收缩作用，能够促进胶原凝胶的收缩。本发明的大豆蛋白质的水解物主要促进包含皮肤的真皮中多含有的I型胶原（胶原类型I)的凝胶的收缩。在此，胶原凝胶是指含有细胞（特别是成纤维细胞）的胶原凝胶。为了在更接近生物体内的环境下进行评价，例如通过使用包埋有成纤维细胞的固化的胶原凝胶，在含有上述水解物的培养基中培养，并在培养前后比较该胶原凝胶的直径，能够评价该水解物的胶原凝胶收缩作用，在与培养前相比，培养后的胶原凝胶的直径显著降低时，可判断促进了胶原凝胶的收缩。在该评价方法中，包埋有成纤维细胞的胶原凝胶作为生物体的真皮的模型使用。能够促进包含成纤维细胞的胶原凝胶的收缩的、本发明的大豆蛋白质的水解物在生物体的真皮结缔组织中，能够促进由成纤维细胞和胶原形成的胶原凝胶的收缩。

如为本领域技术人员则可理解，通过该种方法，能够促进成纤维细胞和胶原间的粘附的水解物和/或能够促进胶原凝胶的收缩的水解物具有如下效果，强化成纤维细胞和细胞外基质的结合，增加两者的拉伸强度，使真皮紧缩，改善皮肤的皱纹或松弛，或者恢复肌肤的张力及弹性。

本发明的组合物为上述含有大豆蛋白质的水解物。由于该组合物含有具有上述特征的水解物，因此，可作为用于促进细胞和胶原间的粘附的细胞和胶原间的粘附的促进剂，或用于促进胶原凝胶的收缩的胶原凝胶收缩促进剂有益地使用。该组合物例如，可作为医药组合物、化妆品组合物、食品组合物或饲料组合物，进而作为用于阐明与细胞和胶原间的粘附性相关的生理状态、或阐明与胶原凝胶收缩相关的状态的研究试药适当地使用。

作为医药组合物，例如，可以举出以人为代表的哺乳动物中细胞和胶原间的粘附能力降低引起的疾患的预防剂和/或治疗剂等。具体而言，本发明的医药组合物例如，可作为因年龄增加等产生的成纤维细胞或角质细胞和胶原间的粘附能力降低引起的皮肤的皱纹或松弛的预防剂和/或治疗剂，对上述粘附能力降低引起的皮肤的张力或弹力性的降低的预防剂和/或治疗剂，或肌肤的紧缩剂，上述粘附能力降低引起的皮肤的新陈代谢不良及与之相伴的色斑或暗沉的预防剂和/或治疗剂，或者上述粘附能力降低引起的表皮变薄的预防剂和/或治疗剂等使用。而且，由于本发明的医药组合物含有作为创伤治愈的模型系统也显示公知的高胶原凝胶收缩评价较高的收缩效果的含有大豆蛋白质的水解物，因此，也可作为用于促进创伤治愈、或皮肤溃疡及瘢痕瘤等的治疗、或皮肤移植时移植片的定着的药剂等有益地使用。

作为化妆品组合物，例如，还可作为用于以人为代表的哺乳动物中细胞和胶原间的粘附能力降低引起的状态的预防和/或改善的化妆品使用。具体而言，本发明的化妆品组合物例如，可作为用于因年龄增加等产生的成纤维细胞或角质细胞和胶原间的粘附能力降低引起的皮肤的皱纹或松弛的预防和/或改善的化妆品，用于对上述粘附能力降低引起的皮肤的张力或弹力性的降低的预防和/或改善的化妆品，或用于肌肤的紧缩的化妆品，用于上述粘附能力降低引起的皮肤的新陈代谢不良及与其相伴的色斑或暗沉的预防和/或改善的化妆品，或用于上述粘附能力降低引起的表皮变薄的预防和/或改善的化妆品等使用。而且，使用本发明的化妆品组合物有助于改善创伤治愈、皮肤溃疡及瘢痕瘤等状态、或促进皮肤移植后的移植片的定着。

作为食品组合物，例如还可作为用于以人为代表的哺乳动物中细胞和胶原间的粘附能力降低引起的状态的预防和/或改善的食品使用。具体而言，本发明的食品组合物例如，可以作为，用于因年龄增加等产生的成纤维细胞或角质细胞和胶原间的粘附能力降低引起的皮肤的皱纹或松弛的预防和/或改善的食品，用于对上述粘附能力降低引起的皮肤的张力或弹力性的降低的预防和/或改善的食品，或用于肌肤的紧缩的食品，用于上述粘附能力降低引起的皮肤的新陈代谢不良及与之相伴的色斑或暗沉的预防和/或改善的食品，或用于上述粘附能力降低引起的表皮变薄的预防和/或改善的食品等使用。而且，使用本发明的食品组合物有助于改善创伤治愈、皮肤溃疡及瘢痕瘤等状态、或用于促进皮肤移植后的移植片的定着。

本发明的食品组合物含有健康食品、特定保健用食品、营养功能食品、健康辅助食品等。这些组合物包含美容健康食品。特定保健用食品是指，在饮食生活中，以特定的保健目的进行摄取，通过对其的摄取，显示了可期待该保健的目的效果的食品。在这些食品中，在特定的实施方式中，可作为显示了用于上述用途的食品效果的食品而提供。即，可作为显示如下效果的食品提供，用于美容、具有美肌作用、用于改善肌质、用于恢复皮肤的张力或弹性、用于皮肤的皱纹或松弛的预防或改善、用于紧缩肌肤、用于皮肤的新陈代谢不良及与之相伴的色斑或暗沉的预防或改善、用于表皮变薄的预防或改善、用于创伤治愈、用于皮肤溃疡及瘢痕瘤等状态的改善、或用于促进皮肤移植后的移植片的定着等。

作为饲料，例如，可以举出牛、猪、鸡、羊、马等家畜、及狗、猫等宠物动物中细胞和胶原间的粘附能力降低引起的状态的预防用和/或改善用的饲料、以及用于改善创伤治愈、皮肤溃疡及瘢痕瘤等状态的饲料等。

本组合物中的上述大豆蛋白质的水解物的含量因组合物的剂型等而不同，通常，从得到高的促进细胞和胶原间的粘附的效果的观点、和/或得到高的促进胶原凝胶收缩的效果的观点考虑，优选为0.00001～100重量%，更优选为0.0001～95重量%，进一步优选为0.001～90重量%，特别优选为0.01～80重量%。

本发明的组合物除上述大豆蛋白质的水解物之外，在实现本发明的目的的范围内，可适当配合制剂领域或食品领域等领域中通常使用的载体、基质（基剤）、和/或添加剂等进行调制。

作为载体，例如，可使用一种或组合两种以上使用糖类、纤维素类、水难溶性胶类、交联乙烯基聚合物、脂质类等。

作为基质，例如，可使用一种或组合两种以上使用水、油脂类、矿物油类、石蜡类、脂肪酸类、硅油类、甾醇类、酯类、金属皂类、醇等。

作为添加剂，例如，可使用一种或组合两种以上使用表面活性剂、可溶成分、乳化剂、油分、稳定剂、增粘剂、防腐剂、结合剂、润滑剂、分散剂、pH调节剂、保湿剂、紫外线吸收剂、螯合剂、经皮吸收促进剂、抗氧化剂、崩解剂、增塑剂、缓冲剂、维生素类、氨基酸类、着色剂、香料等。

进而，为了对本发明的组合物根据需要附加其它实用的作用，可组合一种或两种以上美白成分、消炎成分、抗菌成分、细胞活性成分、收敛成分（収斂成分）、抗氧化成分、痤疮改善成分、胶原等促进生物体成分合成的成分、促进血液循环成分、保湿成分、防老化成分等各种成分进行配合。

本发明的组合物可以是内服剂（包含食品及饲料）或外用剂(包含化妆品)等任意的剂型。

作为内服剂（包含食品及饲料），例如可以使用片剂、丸剂、颗粒剂、细粒剂、粉剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液剂(包含营养剂、悬浮剂、糖浆剂)、凝胶剂、脂质剂、浸膏剂、酊剂、柠檬水剂、果冻剂等任意的形式。

另外，在作为食品的情况下，还可作为面包、面、家常菜、肉食加工食品（例如，火腿、香肠等）、水产加工食品、调料（例如，调味汁等）、乳制品、点心（例如，饼干、糖果、果冻、冰淇淋等）、汤、果汁等任意通常的食品中含有的食品形式提供。在形成该种形式的情况下，上述的水解物可根据作为目的的食品的性质等，通过本领域技术人员公知的方法适当配合。

作为外用剂，例如，可以以液状、乳液状、膏状、化妆水状、糊状、摩丝状、啫喱状、片状(负载基材)、气溶胶状、喷雾状等任意的形式使用。

作为化妆品，例如，可以化妆水、乳液、膏、油、润肤膏等基础化妆品，粉底霜、胭脂、口红等化妆用化妆品，洗面奶、洁面膏、沐浴露等清洁用品，沐浴粉等任意形式使用。

作为饲料，由于可以任意形式使用，没有特别限定。

本发明还提供一种促进细胞和胶原间的粘附的方法和/或促进胶原凝胶的收缩的方法，其特征在于使用上述大豆蛋白质的水解物。

在本发明的方法中，使用可获得促进细胞和胶原间的粘附的效果的有效量以上和/或可获得促进收缩胶原凝胶的效果的有效量以上的量的上述大豆蛋白质的水解物即可。

即，本发明的方法中上述大豆蛋白质的水解物的使用量通常在内服剂的情况下，每成人1人体重约50kg优选约0.001～10000mg/日、更优选约1～1000mg/日、进一步优选约1～100mg/日。外用剂时该使用量通常为每成人1人体重约50kg优选约1ng～2ｇ/日、更优选约0.01μｇ～2ｇ/日、进一步优选约0.1μg～2g/日。

而且，在作为外用剂使用的情况下，上述大豆蛋白质的水解物对皮肤的使用量优选为约0.01ng～500μg/cm²、更优选为约0.1ng～50μg/cm²、进一步优选为约1ng～10μg/cm²。

本发明还提供上述大豆蛋白质的水解物用于制造促进细胞和胶原间的粘附的组合物的应用。

另外，本发明提供上述大豆蛋白质的水解物用于制造促进胶原凝胶的收缩的组合物的应用。

上述大豆蛋白质的水解物的使用量按照成为上述组合物中的含量的方式使用即可。

本发明包含如下方法，将含有大豆蛋白质的水解物的组合物给与以人为代表的哺乳动物，促进该以人为代表的哺乳动物中细胞和胶原间的粘附的方法，及将含有大豆蛋白质的水解物的组合物给与以人为代表的哺乳动物，促进该以人为代表的哺乳动物中包含细胞的胶原凝胶的收缩的方法。另外，本发明包含，用于促进细胞和胶原间的粘附的大豆蛋白质的水解物、及用于促进包含细胞的胶原凝胶的收缩的大豆蛋白质的水解物。而且，本发明包含大豆蛋白质的水解物用于制造促进细胞和胶原间的粘附的药剂的应用、及大豆蛋白质的水解物用于制造促进包含细胞的胶原凝胶的收缩的药剂的应用。

实施例

以下，基于实施例详细地说明本发明，本发明不限于这些实施例。

实施例1：调制大豆蛋白质的水解物（1）

按照脱脂大豆粉末（商品名PROPHAM974、ADM FAR EAST有限公司制）的浓度成为5%（w/v）的方式悬浮大豆蛋白质，在该悬浮液中，按照成为0.05%（w/v）的方式添加作为胃蛋白酶的一种的Pepsibio1:10,000（日本Biocon公司制），在50℃下进行18小时分解反应。反应液的pH以该蛋白酶的最佳pH附近的pH3.5进行实施。

反应结束后，通过将上述反应物在85℃下经15分钟进行加热处理，使该反应物中含有的酶失活，其后用10N氢氧化钠中和。接着，在布氏漏斗上预涂硅藻土（扶桑化学、RADIOLITE＃200），进行抽吸过滤。接着，通过减压浓缩滤液，冷冻干燥，以42.8%的产量获得粉末化的大豆蛋白质水解物。

实施例2：调制大豆蛋白质的水解物（2）

按照脱脂大豆粉末（商品名PROPHAM974、ADM FAR EAST有限公司制）的浓度成为5%（w/v）的方式悬浮大豆蛋白质，在该悬浮液中以成为0.05%（w/v）的方式添加胰蛋白酶，在50℃下进行18小时分解反应。反应液的pH以在该蛋白酶的最佳pH附近的pH7.5进行实施。

反应结束后，通过将上述反应物在85℃下经15分钟进行加热处理，使该反应物中含有的酶失活。接着，在布氏漏斗上预涂硅藻土（扶桑化学、RADIOLITE＃200），进行抽吸过滤。接着，通过减压浓缩滤液，冷冻干燥，以33.8%的产量获得粉末化的大豆蛋白质水解物。

实施例3：调制大豆蛋白质的水解物（3）

按照脱脂大豆粉末（商品名PROPHAM974、ADM FAR EAST有限公司制）的浓度成为5%（w/v）的方式悬浮大豆蛋白质，在该悬浮液中按照成为5%（w/v）的方式添加胰蛋白酶，以该蛋白酶的最佳pH附近的pH7.5在50℃下反应18小时，接着，进而添加Sumizyme FL-G（新日本化学公司制）0.05%（w/v），以该蛋白酶的最佳pH附近的7.0在60℃下进行18小时分解反应。

反应结束后，通过将上述反应物在85℃下经15分钟进行加热处理，使该反应物中含有的酶失活。接着，在布氏漏斗上预涂硅藻土（扶桑化学、RADIOLITE＃200），进行抽吸过滤。接着，通过减压浓缩滤液，冷冻干燥，以43.9%的产量获得粉末化的大豆蛋白质水解物。

实施例4：测定大豆蛋白质的水解物的分子量

通过凝胶渗透色谱（GPC）法测定实施例1～3中获得的大豆蛋白质的水解物的平均分子量。

具体而言，将各实施例的大豆蛋白质水解物溶解在25mM Tris-HCl缓冲液(含有150mM NaCl、pH7.5)，调制2mg/mL的试验溶液。将HPLC色谱柱Superdex peptide HR(10mm I.D.×30cm，GE Healthcare日本公司制)在相同的缓冲液下平衡化，在该色谱柱中注入试验溶液50μL。在色谱柱的流速为0.5mL/分、色谱柱温度为室温、肽的检测为214nm下进行，从洗脱时间推测分子量分布及峰值平均分子量。此外，作为已知分子量的肽制剂，使用了细胞色素C(sigma公司制，分子量12327)、抑肽酶（Aprotinin）(Roche制，分子量6518)、六甘氨酸(sigma公司制，分子量360)、三甘氨酸(sigma公司制，分子量189)、及甘氨酸(和光纯药公司制，分子量75)。

该结果，可确认实施例1～3的大豆蛋白质水解物的平均分子量（峰值平均分子量）分别为2233（实施例1）、9274（实施例2）、及3407（实施例3）。此外，图1～3是表示各水解物的分子量分布的色谱图。

实施例5：评价成纤维细胞对胶原涂层的粘附

使用上述实施例1～3中调制的各种大豆蛋白质水解物，关于促进成纤维细胞对胶原涂层的粘附的效果进行评价。

具体而言，首先，将来自人的正常皮肤的成纤维细胞（仓敷纺绩：KF-4009），在用I型胶原的胶原被覆的细胞培养板(96孔)上以2×10⁴细胞/孔浓度接种。接着，将各大豆蛋白质水解物被稀释成0.5mg/ml浓度的Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM；含有AB1%）逐一添加200μl到各孔中，在37℃、5%二氧化碳及95%空气的环境下培养4小时。另外，作为对照，准备了添加未添加大豆蛋白质水解物的D-MEM培养基200μl的孔。在开始培养4小时后，用PBS冲洗各孔的上清液，使用细胞计数试剂盒-8试剂盒（（有限公司）同仁化学研究所制），测量各孔中与胶原涂层粘附，未洗掉而残留的活细胞数。以测定结果为基础，将对照中的活细胞数为100%，算出各实施例的添加了水解物的组的活细胞数（%）。将该结果示于下表。

表1

受验分解物活细胞数(％	)
		实施例例	129
实施例2	121
		实施例3	127

如上述结果所示，可知无论添加三种中哪一种受验分解物，均可促进成纤维细胞对胶原涂层的粘附。从该结果可知，通过使用大豆蛋白质的水解物，提供一种新型材料，其促进成纤维细胞和胶原间的粘附，强化成纤维细胞和细胞外基质的结合，增加两者的拉伸强度，使真皮紧缩，改善伴随老化等的皮肤的皱纹或松弛，有效改善肌肤的张力及弹性，通过进一步提高真皮的细胞功能，还可有助于表皮状态的改善。

实施例6：评价角质细胞对胶原涂层的粘附

使用上述实施例2中调制的大豆蛋白质水解物，关于促进表皮角质细胞对胶原涂层的粘附的效果进行评价。

具体而言，首先，将来自人的正常皮肤的角质细胞（仓敷纺绩：kk-4009），在用IV型胶原的胶原被覆的细胞培养板(96孔)中以7.5×10⁴细胞/孔浓度进行接种。接着，将大豆蛋白质水解物被稀释成5μg/ml浓度的表皮角质细胞基本培养基（仓敷纺绩：kk-2350S）逐一添加200μl到各孔中，在37℃、5%二氧化碳及95%空气的环境下培养4小时。另外，作为对照，准备了添加未添加大豆蛋白质水解物的表皮角质细胞基本培养基200μl的孔。在开始培养4小时后，用PBS冲洗各孔的上清液，通过NR（Neutral red）染色法，测量各孔中与胶原涂层粘附，未洗掉而残留的活细胞数。以测定结果为基础的，将对照中的活细胞数为100%，算出实施例2的添加了水解物的组的活细胞数（%）。将该结果示于下表。

表2

受验分解物	活细胞数(％)
		实施例2	114

如上述结果所示，可知通过使用大豆蛋白质的水解物，也促进了角质细胞对由IV型胶原被覆的胶原涂层的粘附。从该结果可知，通过使用大豆蛋白质的水解物，促进了在基底膜中网眼状分散的IV型胶原和角质细胞间的粘附，且能够抑制因紫外线或年龄增加等产生的角质细胞和基底膜的结合的松缓，因此，除松弛或皱纹外，还能够有效预防或改善新陈代谢的不良及与之相伴的色斑或暗沉（肌肤色彩改善）、以及表皮的变薄。

实施例7：评价成纤维细胞对AGE化胶原涂层的粘附

使用上述实施例2中调制的大豆蛋白质水解物，关于促进成纤维细胞对AGE化的胶原的粘附的效果进行了评价。

首先，在使用I型胶原的胶原被覆的细胞培养板（96孔）中添加乙二醛（Glyoxal）至2mM/PBS的浓度，在37℃下培养9日，使胶原AGE化。

接着，将来自人的正常皮肤的成纤维细胞（仓敷纺绩：KF-4009）在使用上述的AGE化I型胶原的胶原被覆的细胞培养板中以2×10⁴细胞/孔的浓度进行接种。接着，将实施例2的大豆蛋白质水解物稀释为10μg/ml、100μg/ml、1mg/ml、10mg/ml浓度的Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM;含有AB1%)逐一添加200μl到各孔中，在37℃、5%二氧化碳及95%空气的环境下培养4小时。另外，作为对照，准备了添加未添加大豆蛋白质水解物的D-MEM培养基200μl的孔。在开始培养4小时后，用PBS冲洗各孔的上清液，通过NR（Neutral Red）染色法，测量各孔中与AGE化的胶原涂层粘附，未洗掉而残留的活细胞数。以测定结果为基础，将对照中的活细胞数设为100%，算出添加了大豆蛋白质水解物的各浓度的组的活细胞数（%）。将该结果示于以下的表3。

表3

受验分解物(浓度)	活细胞数(％)
		实施例2(10μg/ml)	105
实施例(100μg/ml)	109
		实施例2(1mg/ml)	118
实施例(10mg/ml)	123

如上述结果所示可知，即使是难以与细胞粘附的AGE化的胶原，通过添加大豆蛋白质的水解物，也可有效促进对成纤维细胞的粘附。

实施例8：评价促进胶原凝胶收缩

使用上述实施例2～3中调制的各种大豆蛋白质水解物，关于促进胶原凝胶收缩的效果进行了评价。

对促进胶原凝胶收缩的评价使用胶原凝胶培养试剂盒（新田明胶制）进行。具体而言，首先，在冰上，将30ml的胶原类型I－A溶液分别分配到50ml的瓶中。另外，调制添加了成纤维细胞的最终浓度成5×10⁴细胞/ml的不含NaHCO₃的10倍浓缩液（MEM），缓慢地进行了移液。接着，将添加了该成纤维细胞的MEM溶液添加到上述胶原类型I－A溶液中，缓慢地进行移液，其后，添加重组缓冲液，并快速进行了移液。在24孔板的各孔中，为了不产生气泡，滴入添加了该成纤维细胞的胶原类型I－A溶液，在37℃下放置1小时，使胶原凝胶固化。其后，将凝胶转移至12孔板，逐一添加1ml含有各大豆蛋白质水解物的DMEM培养基（含有AB1%）。接着，将胶原凝胶放入板中的状态下，使用方格纸测定各凝胶的初始值的直径。在2日后及5日后，用添加了各大豆蛋白质水解物的培养基进行培养基交换。1周后，在将胶原凝胶放入板中的状态下，使用方格纸测定该凝胶的直径。接着，按照下式，算出相对胶原凝胶的初始值的胶原凝胶收缩率（%）。将该结果示于以下的表4。

胶原凝胶收缩率（%）＝（培养1周后的胶原凝胶的直径/胶原凝胶直径的初始值）×100

表4

如上述结果所示，可确认，通过使用大豆蛋白质的水解物，包埋了成纤维细胞的胶原凝胶显著收缩。对于使用包埋了该种成纤维细胞的胶原凝胶的评价作为真皮模型的评价系统是公知的。上述的胶原凝胶的收缩证实了大豆蛋白质的水解物促进了成纤维细胞和胶原间的粘附，而且，这些受验水解物显示了，能够使真皮紧缩，改善皮肤的皱纹及松弛，能够有效改善肌肤的张力及弹性。

工业上应用的可能性

本发明的含有大豆蛋白质的水解物的组合物可作为改善皮肤的皱纹及松弛，恢复肌肤的张力及弹性的新型材料使用。

本说明书中引用的全部的刊行物、专利及专利申请直接作为参考引用到本说明书中。

Claims

1.一种组合物，其中，所述组合物为含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进细胞和胶原间的粘附的组合物。

2.一种组合物，其中，所述组合物为含有大豆蛋白质的水解物的、用于促进包含细胞的胶原凝胶的收缩的组合物。

3.如权利要求1或2所述的组合物，其中，所述水解物为通过对大豆蛋白质进行蛋白酶处理而获得的分解物。

4.如权利要求1～3中任一项所述的组合物，其中，大豆蛋白质的水解物的平均分子量为300～50000。