CN111875671A - 一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物试剂技术领域，具体涉及到一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法。所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。从SH中分离的对细胞生长有促进作用的P1、LC组分中，含有6种共有肽段，这6个肽段是大豆蛋白水解物中对动物细胞起促生长作用的重要肽段。打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，时可作为无血清培养基添加物应用于实际生产。

Description

一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法
技术领域
本发明涉及生物试剂技术领域，具体涉及到一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法。
背景技术
随着生物制药技术的飞速发展，用于疫苗生产的动物细胞培养迫切需要无动物源性成分的无血清培养基，相继开发出多种植物蛋白水解物应用于无血清培养基中。大豆蛋白来源广泛，经水解后能为动物细胞生长提供所需的多种必需氨基酸、非必需氨基酸和多肽，而这些多肽可能是用于动物细胞无血清培养基的添加物。我国无血清培养基及蛋白水解产物的应用研究相对滞后，国内无血清培养基添加的蛋白水解物主要依赖进口，目前的研究大多集中于对不同蛋白的水解工艺探索。但是还并没有能够打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，作为无血清培养基添加物应用于实际生产。
发明内容
针对上述技术问题，本发明优化大豆蛋白水解物制备工艺的同时，通过分离纯化的方法获得了不同特性组分，应用于MDCK悬浮细胞培养，通过检测鉴定寻找到6种肽段，这6种肽段是促细胞增殖的主要肽段。突破了大豆蛋白水解物依赖进口的技术瓶颈，同时为无血清培养基的开发找到新思路。
具体的，本发明的第一方面提供了一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；
所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；
所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；
所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。
作为本发明一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅳ，所述多肽Ⅳ具有如下氨基酸序列：LTEVGPDDDEK。
作为本发明一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅴ，所述多肽Ⅴ具有如下氨基酸序列：GPTVTDPNTEK。
作为本发明一种优选的技术方案，所述添加物中还包含多肽Ⅵ，所述多肽Ⅵ具有如下氨基酸序列：EEQEWPR。
本发明的第二个方面提供了如上所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取大豆蛋白粉置于反应釜，并加入纯水搅拌溶解得到8～12wt％的底物溶液；
(2)在上述反应釜中加入胰酶，充分搅拌，然后调节体系的pH值至碱性7.5～8.5，调节体系的温度至40～60℃，搅拌条件下反应3～5小时得到酶解液；
(3)将上述酶解液升温至95℃以上，维持10～30min，冷却至室温，然后在3000～4000rpm离心15～45min，收集上清液，然后进行后处理即得。
作为本发明一种优选的技术方案，所述胰酶的体积用量与大豆蛋白粉质量用量比例为a：1，其中a不低于900。
作为本发明一种优选的技术方案，所述后处理包括超滤、干燥、凝胶过滤层析和离子交换层析步骤；所述超滤步骤中采用的超滤膜孔径不高于20纳米。
作为本发明一种优选的技术方案，步骤2中，体系的pH值为7.5～8.5。
本发明的第三个方面提供了如上所述的方法制备得到的大豆蛋白水解添加物的应用，应用于无血清培养基细胞培养。
作为本发明一种优选的技术方案，所述无血清培养基细胞培养中所述大豆蛋白水解添加物的用量为1.5～4.5g/L。
有益效果：本发明建立了大豆蛋白水解物制备的最佳工艺参数：E/S＝1800:1，pH8.0，水解温度50℃，水解时间4h。在此条件下，大豆蛋白的水解度最高，可达37.86％。本研究制备的大豆蛋白水解物SH促MDCK悬浮细胞增殖的效果与进口的1510、S204效果基本一致；SH的最佳添加浓度为2.5g/L；SH不同组分中，P1、LC对细胞有促生长作用，P2促细胞生长作用不明显，而P3、XT对细胞生长有抑制作用。从SH中分离的对细胞生长有促进作用的P1、LC组分中，含有6种共有肽段：分别是IMENQSEELEEKQK、IMENQSEELEEK、KLQGENEEEEK、LTEVGPDDDEK、GPTVTDPNTEK和EEQEWPR，这6个肽段是大豆蛋白水解物中对动物细胞起促生长作用的重要肽段。打破大豆蛋白水解物国外技术垄断，时可作为无血清培养基添加物应用于实际生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为时间对大豆蛋白水解度影响实验结果图。
图2为酶与底物比对大豆蛋白水解度影响实验结果图。
图3为pH值对大豆蛋白水解度影响实验结果图。
图4为温度为大豆蛋白水解度影响实验结果图。
图5为大豆蛋白水解物SH的凝胶过滤层析试验结果图。
图6为大豆蛋白水解物SH的离子交换层析试验结果。
图7为细胞连续传代培养的形态观察，其中A为商品化1510组，B为本申请大豆蛋白水解物SH组，C为商品化S204组，D为空白组。
图8为细胞连续传代培养第3代细胞生长特性分析结果图。
图9为细胞连续传代培养第7代细胞生长特性分析结果图。
图10为细胞连续传代培养第11代细胞生长特性分析结果图。
图11为细胞连续传代培养第15代细胞生长特性分析结果图。
图12为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第3代细胞生长曲线图。
图13为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第7代细胞生长曲线图。
图14为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分第9代细胞生长曲线图。
图15为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第3代细胞生长曲线图，其中流穿即为LC，洗脱即为XT。
图16为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第7代细胞生长曲线图。
图17为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分第9代细胞生长曲线图。
图18为大豆蛋白水解物SH的SDS-PAGE凝胶电泳结果图。
图19为大豆蛋白水解物SH的高效液相色谱结果图。
图20为商品化1510的高效液相色谱结果图。
图21为商品化S204的高效液相色谱结果图。
图22为大豆蛋白水解物SH的液相色谱-串联质谱分析结果图。
图23为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P1的液相色谱-串联质谱分析结果图。
图24为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P2的液相色谱-串联质谱分析结果图。
图25为大豆蛋白水解物SH中不同分子量组分P3的液相色谱-串联质谱分析结果图。
图26为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分LC的液相色谱-串联质谱分析结果图。
图27为大豆蛋白水解物SH中不同电荷组分XT的液相色谱-串联质谱分析结果图。
具体实施方式
参选以下本发明的优选实施方法的详述以及包括的实施例可更容易地理解本发明的内容。除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。
本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1至5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
此外，本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求(即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个，并且单数形式的要素或组分也包括复数形式，除非所述数量明显旨指单数形式。
本发明中的词语“优选的”、“优选地”、“进一步地”、“更优选的”等是指，在某些情况下可提供某些有益效果的本发明实施方案。然而，在相同的情况下或其他情况下，其他实施方案也可能是优选的。此外，对一个或多个优选实施方案的表述并不暗示其他实施方案不可用，也并非旨在将其他实施方案排除在本发明的范围之外。
为了解决现有技术中的问题，本发明中通过酶水解制备大豆蛋白水解物，分别收集不同肽段组分进行MDCK细胞无血清悬浮培养的测试和鉴定分析，主要包括以下主要研究内容：
(1)以水解度为指标，优化大豆蛋白水解物的制备工艺。
(2)应用凝胶过滤层析和离子交换层析分离大豆蛋白水解物的组分。
(3)制备大豆蛋白水解物及其不同肽段组分进行MDCK细胞悬浮培养测试，研究其对动物细胞的促生长作用。
(4)应用凝胶电泳、游离氨基酸检测、高效液相色谱、液相色谱-串联质谱对大豆蛋白水解物及其不同组分进行鉴定分析。
具体的，本发明的第一方面提供了一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；
所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK(SEQ ID No：1)；
所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK(SEQ ID No：2)；
所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK(SEQ ID No：3)。
在一些优选的实施方式中，所述添加物中还包含多肽Ⅳ，所述多肽Ⅳ具有如下氨基酸序列：LTEVGPDDDEK(SEQ ID No：4)。
优选的，所述添加物中还包含多肽Ⅴ，所述多肽Ⅴ具有如下氨基酸序列：GPTVTDPNTEK(SEQ ID No：5)。
优选的，所述添加物中还包含多肽Ⅵ，所述多肽Ⅵ具有如下氨基酸序列：EEQEWPR(SEQ ID No：6)。
本发明的第二个方面提供了如上所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)取大豆蛋白粉置于反应釜，并加入纯水搅拌溶解得到8～12wt％的底物溶液；
(2)在上述反应釜中加入胰酶，充分搅拌，然后调节体系的pH值至碱性7.5～8.5，调节体系的温度至40～60℃，搅拌条件下反应3～5小时得到酶解液；
(3)将上述酶解液升温至95℃以上，维持10～30min，冷却至室温，然后在3000～4000rpm离心15～45min，收集上清液，然后进行后处理即得。
申请人以水解度为指标，通过某单一因素变量的平行试验，确定其最优条件，初步筛选最佳酶解时间、酶与底物比、pH、温度等条件，其结果参见图1～4。
在一些优选的实施方式中，所述胰酶的体积用量与大豆蛋白粉质量用量比例为a：1，其中a不低于900；优选的，a为1800。其中胰酶的体积用量单位为微升(μL)，大豆蛋白粉质量用量单位为克(g)。
在一些优选的实施方式中，步骤(2)中体系的温度为50℃。优选的，反应时间为4小时。
在一些优选的实施方式中，所述后处理包括超滤、干燥、凝胶过滤层析和离子交换层析步骤；所述超滤步骤中采用的超滤膜孔径不高于20纳米；优选的，超滤膜的孔径为10纳米。本发明中10kD截留分子量超滤膜对应的超滤膜孔径即为10纳米；30kD截留分子量超滤膜对应的超滤膜孔径为20纳米；50kD截留分子量超滤膜对应的超滤膜孔径为30纳米；60kD截留分子量超滤膜对应的超滤膜孔径为40纳米；100kD截留分子量超滤膜对应的超滤膜孔径为50纳米。
在一些优选的实施方式中，步骤2中，体系的pH值为7.5～8.5；优选的，体系的pH值为8.0。
申请人在完成本发明的过程中发现，大豆蛋白水解添加物中上述六种肽段的含量与大豆蛋白粉在酶解过程中的反应温度、反应pH值以及酶与底物比(E/S)参数之间有着密切的联系。反应温度、反应pH值以及酶与底物比除了影响大豆蛋白粉的水解度之外，还会影响上述六种关键多肽成分的有效溶出。当体系的反应pH值过高，或反应温度过高时，虽然在一定程度上有助于提高大豆蛋白粉的水解，但是也会在很大程度上降低P1和LC组分的含量，从而增加大豆蛋白水解添加物MDCK悬浮细胞增殖中的使用量。申请人推测在高温或高pH值环境下，大豆蛋白水解物SH进一步水解或分解，产生具有更小分子量和氨基酸个数更少的蛋白质序列，或者使含有上述多肽的蛋白质成分遭到破坏，从而影响其功效发挥。
进一步地，通过t检验分析单因素实验的最佳水解参数，对水解时间、酶与底物比、pH、温度四个水解因素，每个因素设定三个水平，设计L9(34)正交试验，以水解度为指标，通过极差分析比较每个水解因素对水解度的影响，实验结果如下表1所示。
表1正交试验结果
Figure BDA0002597964830000071
进一步优选的，所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)按质量分数10％配制，称取大豆蛋白粉1000g，置于10L反应釜，注入10L纯水充分搅拌溶解；
(2)按胰酶：底物(大豆蛋白粉)＝1800：1.0(μ：g)添加相应量的胰酶，充分搅拌混匀，0.1M/L NaOH调节pH至8.0左右，温度设置50℃，转速400rpm/min，酶解反应4h得到酶解液；
(3)酶解液升温至95℃以上，持续15min，使胰酶完全失活；通过冷凝水循环冷却降温至室温并收集粗制水解液；
(4)将粗制水解液3500rpm离心30min，收集上清液，以去除水解不完全的蛋白、失活的酶和不溶杂质；
(5)讲上述上清水解液通过10kD截留分子量超滤膜超滤，收集小于10kD分子量的水解液，获得精制水解液；
(6)采用真空冷冻干燥(-45～25℃线性降温、升温)的方法，将精制水解液冷冻干燥，保证水解液活性的同时易于保存；
(7)采用缓冲液PBS，上样量为柱体积的3％，质量分数为8％的精制水解液，利用肽段分子量大小通过凝胶过滤层析分离为不同组分(包括三个组分，分别为P1、P2、P3)；
(8)采用缓冲液PBS，上样量1个柱体积，质量分数为10％的精制水解液，利用肽段所携带电荷不同通过离子交换层析分离为不同组分(包括两个组分，分别为LC、XT)。
本发明中的大豆蛋白水解物SH即为精制水解液。
本发明的第三个方面提供了如上所述的方法制备得到的大豆蛋白水解添加物的应用，应用于无血清培养基细胞培养。
在一些优选的实施方式中，所述无血清培养基细胞培养中所述大豆蛋白水解添加物的用量为1.5～4.5g/L；优选的，所述无血清培养基细胞培养中所述大豆蛋白水解添加物的用量为2.5g/L。
实施例：本实施例提供了一种大豆蛋白水解添加物，其制备方法包括如下步骤：
(1)按质量分数10％配制，称取大豆蛋白粉1000g，置于10L反应釜，注入10L纯水充分搅拌溶解；
(2)按胰酶：底物(大豆蛋白粉)＝1800：1.0(μ：g)添加相应量的胰酶，充分搅拌混匀，0.1M/L NaOH调节pH至8.0左右，温度设置50℃，转速400rpm/min，酶解反应4h得到酶解液；
(3)酶解液升温至95℃以上，持续15min，使胰酶完全失活；通过冷凝水循环冷却降温至室温并收集粗制水解液；
(4)将粗制水解液3500rpm离心30min，收集上清液，以去除水解不完全的蛋白、失活的酶和不溶杂质；
(5)讲上述上清水解液通过10kD截留分子量超滤膜超滤，收集小于10kD分子量的水解液，获得精制水解液(SH，也即为大豆蛋白水解物)；
(6)采用真空冷冻干燥(-45～25℃线性降温、升温)的方法，将精制水解液冷冻干燥，保证水解液活性的同时易于保存；
(7)采用缓冲液PBS，上样量为柱体积的3％，质量分数为8％的精制水解液，利用肽段分子量大小通过凝胶过滤层析分离为不同组分(包括三个组分，分别为P1、P2、P3)；
(8)采用缓冲液PBS，上样量1个柱体积，质量分数为10％的精制水解液，利用肽段所携带电荷不同通过离子交换层析分离为不同组分(包括两个组分，分别为LC、XT)。
申请人采用凝胶过滤层析和离子交换层析分离上述实施例中大豆蛋白水解物SH中的组分，其结果参见图5和图6，申请人发现通过凝胶过滤层析和离子交换层析将经超滤小于10kD的大豆蛋白水解物分离纯化为不同分子量的组分P1、P2、P3和电荷不同的组分LC、XT。
申请人以不添加蛋白水解物为空白组，以实验室制品大豆蛋白水解物SH为实验组，以商品化大豆蛋白水解物1510、S204为对照组，通过细胞连续传代培养比较不同水解物对细胞传代稳定性及生长特性的影响。
具体的，先进行悬浮细胞的复苏，其步骤为：取冻存于液氮中的MDCK悬浮细胞2支，于37℃的水中使其快速解冻，表面消毒后无菌操作接种于125mL摇瓶中，培养基选用SFM04，培养液体积40mL，置于5％CO2、37℃培养箱放置的摇床培养，摇床转速为130rpm/min，培养48h后取样计数并传代。待细胞活率达到97％以上进行后续试验。
然后，分别称取1g的SH、1510、S204蛋白水解物干粉，充分混匀溶解于500mL SFM培养基中，终浓度为2g/L，调节pH为7.2，0.22μm过滤除菌备用。将细胞以1×106cells·mL-1细胞浓度接种于125mL摇瓶，培养液体积40mL，置于5％CO2、37℃培养箱的摇床培养，摇床转速为130rpm/min。每24h取样计数、检测细胞活力，并置于显微镜下观察细胞形态，其结果参见附图7。每48h传代培养，细胞密度为1×106cells·mL-1，连续培养20代，并绘制曲线，其结果参见图8～11。
对上述细胞连续传代培养过程中选取第3、7、11、15代做细胞生长曲线测试，通过细胞最大增殖浓度、倍增时间和比生长速率比较分析SH、1510、S204对细胞增殖的影响，其结果参见如下表2。
表2细胞增殖生长特性分析结果
Figure BDA0002597964830000101
通过上述实验结果，可以看出，本发明中的制备得到的大豆蛋白水解物SH对MDCK悬浮细胞的促生长效果与商品化大豆蛋白水解物1510、S204一致。
为了分析大豆蛋白水解物SH中不同组分对细胞增殖的影响，申请人以不添加蛋白水解物为空白组，SH为对照组，不同分子量以及不同电荷组分P1、P2、P3、LC、XT为试验组，各组在SFM培养基中的添加量均为2g/L，将细胞以106cells·mL-1细胞浓度接种于125mL摇瓶中培养，培养液体积40mL，同2.2的方法连续传代培养。每48h细胞取样计数、检测细胞活力，以1×106cells·mL-1接种传代培养10代，选取第3、7、9代细胞做细胞生长曲线测试，其结果参见图12～17。通过细胞最大增殖浓度、倍增时间和比生长速率进行比较分析SH不同组分对细胞增殖的影响，其结果参见下表3和表4。
表3 SH不同分子量组分对细胞增殖的影响结果
Figure BDA0002597964830000111
从上述实验结果中可以看出，本发明的大豆蛋白水解物SH中组分P1表现出促细胞生长作用，效果接近SH，P2无明显促进作用，P3有抑制细胞生长的作用。
表4 SH不同电荷组分对细胞增殖的影响结果
Figure BDA0002597964830000112
Figure BDA0002597964830000121
从上述实验结果中可以看出，本发明的大豆蛋白水解物SH中组分LC表现出促细胞生长作用，效果接近SH，XT有抑制细胞增殖的作用。
结果表明大豆蛋白水解物SH中促进MDCK悬浮细胞增殖的主要组分为LC，XT有抑制细胞增殖的作用。
申请人通过Tris-Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳的方法分析各水解物的肽段分子量大小。电泳条件：4％浓缩胶，10％夹层胶，20％分离胶，三种胶体积比4.0：1.5：1.0；样品100℃变性10min，上样量10μL；30V电泳2h，100V电泳8h；考马斯亮蓝染色。其结果参见图18，其中条带M为分子量标准品Marker，条带1、2、3、4、5分别为SH、SH、1510、S204、空白。
从图18中可以看出，本发明中制备得到的大豆蛋白水解物SH和商品化大豆蛋白水解物1510、S204分子量接近3.3kD，说明1510、S204的水解工艺中均通过纯化工艺去除了大分子量的蛋白和肽段。
申请人对实施例中的大豆蛋白水解物SH进行游离氨基酸分析，其具体测试方法包括如下步骤：
样品处理：纯水溶解大豆蛋白水解液干粉，5％的5-磺基水杨酸，1200rpm/min离心15min，去除蛋白。取上清倍比稀释，使用全自动氨基酸分析仪检测水解产物中的游离氨基酸。
色谱条件：样品分析系统为生理体液系统，交换柱：4.6*60mm，填料为3nm磺酸型阳离子树脂，分离柱柱温：50℃，反应柱柱温：135℃，进样体积为20μL。其测试结果参见表5.
表5大豆蛋白水解物SH氨基酸含量结果
Figure BDA0002597964830000122
Figure BDA0002597964830000131
从上述实验结果中可以看出，本发明中是被得到的大豆蛋白水解物SH、1510、S204氨基酸种类基本相同，SH氨基酸含量25.15％，是1510和S204的3.2倍和1.7倍。
申请人对实施例中的大豆蛋白水解物SH、1510、S204采用高效液相色谱分析和鉴定其不同组分。具体操作步骤包括：
色谱柱选用ACQUITY BEH SEC 200，介质粒径1.7μm，色谱柱4.6×150mm；流动相为pH 6.8的100mM Na3PO4，流速为0.3mL/min，柱温30℃。其结果参见图19～21，其中谱图中的四个峰对应的面积如下表6所示。
表6高效液相色谱分析
Figure BDA0002597964830000132
Figure BDA0002597964830000141
通过洗脱峰峰面积和分子量大小检测发现，大豆蛋白水解物SH、1510和S204组分中分子量大小为2813-3612D的组分占比79.77-87.09％，占比最该，是水解物中的主要组分，可能是一些长肽，这与凝胶电泳结果一致；436-609D组分占比10.43-12.77％，可能是一些短肽和寡肽；分子量大小为10D的组分占比1-7％，可能是水解物的盐成分，SH、S204中分子量大小为113D和114D组分占比0.418％和3％，可能是游离氨基酸或者寡肽。
申请人对实施例中的大豆蛋白水解物SH、1510、S204采用液相色谱-串联质谱分析和鉴定其不同组分。其包括如下操作步骤：
(1)肽段脱盐与定量
称取50mg的肽段干粉，溶解于100μl的0.1％TFA，离心取上清，取适量肽段干燥，使用C18 StageTip脱盐，真空干燥。干燥后肽段用0.1％TFA复溶，OD280测定肽段浓度，以备LC-MS分析。
(2)LC-MS/MS分析
缓冲液A液为0.1％甲酸水溶液，B液为0.1％甲酸、乙腈和水混合溶液(其中乙腈为95％)。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样到Trap Column(100μm*20mm,5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm*150mm，3μm，C18，Dr.Maisch GmbH)进行梯度分离，流速为300nl/min。液相分离梯度如下：0-3min，B液线性梯度从2％到7％；3-48min，B液线性梯度从7％到35％；48-53min，B液线性梯度从35％到90％；53-60min，B液维持在90％。肽段分离后用Q-Exactive Plus质谱仪进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为60min，
检测模式：正离子，母离子扫描范围：300-1800m/z，一级质谱分辨率：70,000@m/z200，AGC target：1e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(Full scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：17,500@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2 ActivationType:HCD，Isolation window：2.0Th，Normalized collision energy：27。
液相色谱-串联质谱分析结果参见图22～27，可以看出蛋白水解物的分离情况较好，其色谱图谱峰尖锐，响应强度较高，峰形对称且重现性好，数据采集情况良好。
此外，申请人对本发明中的大豆蛋白水解物SH，SH的不同分子量组分(P1、P2、P3)，以及不同电荷组分(LC、XT)进行肽段鉴定。其采用的质谱数据库检索软件为MaxQuant1.6.1.0；使用如下蛋白质数据库：来源于Uniprot Protein Database，物种为Glycine max(大豆)，共85002条蛋白序列。其结果参见如下表7～12。
表7大豆蛋白水解物SH肽段鉴定结果
Figure BDA0002597964830000151
Figure BDA0002597964830000161
表8大豆蛋白水解物SH组分P1肽段鉴定结果
Figure BDA0002597964830000162
Figure BDA0002597964830000171
表9大豆蛋白水解物SH组分P2肽段鉴定结果
Figure BDA0002597964830000172
Figure BDA0002597964830000181
表10大豆蛋白水解物活性组分P3肽段鉴定结果
序号 Sequence Mass Score Intensity Length
1 PSRPEQQEPR 1222.6054 113.22 143860000 10
2 LQGENEEEEK 1203.5255 50.034 186610000 10
3 GPTVTDPNTEK 1157.5564 49.418 21357000 11
4 YGSVPVVRK 1003.5815 46.129 36943000 9
5 LQSPDDER 958.43559 61.999 47005000 8
6 EPQQPGEK 911.43486 75.738 128600000 8
7 VPTNPSR 769.40825 72.138 2817500000 7
表11大豆蛋白水解物SH组分LC肽段鉴定结果
Figure BDA0002597964830000182
Figure BDA0002597964830000191
表12大豆蛋白水解物活性组分XT肽段鉴定结果
序号 Sequence Mass Score Intensity Length
1 EKVEEEDEER 1290.5576 166.16 194960000 10
2 EENEDEEQK 1148.4469 36.76 201610000 9
3 EEDEDEQPR 1145.4473 136.11 53099000 9
4 HIMEKIQGR 1110.5968 69.423 135390000 9
5 VEEEDEER 1033.42 138.9 149030000 8
6 PFSFGRKR 993.55083 26.962 89386000 8
从SH中分离的对细胞生长有促进作用的P1、LC组分中，含有6种共有肽段：分别是IMENQSEELEEKQK、IMENQSEELEEK、KLQGENEEEEK、LTEVGPDDDEK、GPTVTDPNTEK和EEQEWPR，因此推测这6个肽段是大豆蛋白水解物中对动物细胞起促生长作用的重要肽段。
本研究建立了大豆蛋白水解物制备的工艺参数：E/S＝1800:1(u/g)，pH 8.0，水解温度50℃，水解时间4h。在此条件下，大豆蛋白的水解度最高，可达37.86％。本研究制备的大豆蛋白水解物SH促MDCK悬浮细胞增殖的效果与进口的1510、S204效果基本一致；SH的最佳添加浓度为2.5g/L；SH不同组分中，P1、LC对细胞有促生长作用，P2促细胞生长作用不明显，而P3、XT对细胞生长有抑制作用。
本研究结果为打破大豆蛋白水解物国外技术垄断提供了基础研究数据，也为无血清培养基替代性添加物的研究提供了新的思路。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110>西北民族大学
<120> 一种用于无血清培养基的大豆蛋白水解添加物及制备方法
<160> 6
<170> PatentIn Version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 1
I M E N Q S E E L E E K Q K
1 5 10
<210> 2
<211> 12
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 2
I M E N Q S E E L E E K
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 3
K L Q G E N E E E E K
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 4
L T E V G P D D D E K
1 5 10
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 5
G P T V T D P N T E K
1 5 10
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213>大豆 (Glycine max)
<400> 6
E E Q E W P R
1 5

Claims (10)

1.一种大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中包含多肽Ⅰ、多肽Ⅱ和多肽Ⅲ；
所述多肽Ⅰ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEKQK；
所述多肽Ⅱ具有如下氨基酸序列：IMENQSEELEEK；
所述多肽Ⅲ具有如下氨基酸序列：KLQGENEEEEK。
2.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅳ，所述多肽Ⅳ具有如下氨基酸序列：LTEVGPDDDEK。
3.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅴ，所述多肽Ⅴ具有如下氨基酸序列：GPTVTDPNTEK。
4.根据权利要求1所述的大豆蛋白水解添加物，其特征在于，所述添加物中还包含多肽Ⅵ，所述多肽Ⅵ具有如下氨基酸序列：EEQEWPR。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)取大豆蛋白粉置于反应釜，并加入纯水搅拌溶解得到8～12wt％的底物溶液；
(2)在上述反应釜中加入胰酶，充分搅拌，然后调节体系的pH值至碱性7.5～8.5，调节体系的温度至40～60℃，搅拌条件下反应3～5小时得到酶解液；
(3)将上述酶解液升温至95℃以上，维持10～30min，冷却至室温，然后在3000～4000rpm离心15～45min，收集上清液，然后进行后处理即得。
6.根据权利要求5所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其特征在于，所述胰酶的体积用量与大豆蛋白粉质量用量比例为a：1，其中a不低于900。
7.根据权利要求5所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其特征在于，所述后处理包括超滤、干燥、凝胶过滤层析和离子交换层析步骤；所述超滤步骤中采用的超滤膜孔径不高于20纳米。
8.根据权利要求5所述的大豆蛋白水解添加物的制备方法，其特征在于，步骤2中，体系的pH值为7.5～8.5。
9.根据权利要求5～8任意一项所述的方法制备得到的大豆蛋白水解添加物的应用，其特征在于，应用于无血清培养基细胞培养。
10.根据权利要求9所述的大豆蛋白水解添加物的应用，其特征在于，所述无血清培养基细胞培养中所述大豆蛋白水解添加物的用量为1.5～4.5g/L。
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