CN116217663A - 一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽kftpap、制备方法及应用 - Google Patents

一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽kftpap、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP、制备方法及应用，涉及抗氧化多肽技术领域。本发明以雨生红球藻提取完虾青素的藻渣为原料，分离纯化得到一种抗氧化多肽KFTPAP的氨基酸序列为：Lys‑Phe‑Thr‑Pro‑Ala‑Pro，分子量为659.36Da，纯度高，活性好，安全无毒。经检测，本发明雨生红球藻来源的抗氧化多肽可显著改善秀丽线虫体内的抗氧化能力，抑制脂肪的生物合成，具有较强的抗氧化作用和减脂作用。同时本发明有利于雨生红球藻渣的资源化利用。

Description

一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP、制备方法及应用
技术领域
本发明属于抗氧化多肽技术领域，具体涉及一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP、制备方法及应用。
背景技术
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种营养价值极高的海洋微藻。目前全球范围内雨生红球藻的年产量达545吨，我国是世界雨生红球藻虾青素市场的产能大国之一。利用雨生红球藻可以提取虾青素，然而，利用雨生红球藻大规模生产虾青素的同时留下了大量雨生红球藻渣。目前雨生红球藻渣的处理方式是将其制成动物饲料或直接丢弃，但是雨生红球藻渣含有丰富的营养价值，其中蛋白质含量达20.8％～22.2％，这表明藻渣中仍存在值得探究的高附加值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP，其可以从雨生红球藻渣中获取。本发明是先从雨生红球藻渣中提取蛋白质，然后进行酶解后，以ABTS自由基清除力为活性跟踪指标，采用超滤、制备型和分析型液相色谱进行分离纯化，鉴定分析从而得出的多肽KFTPAP具有非常高的抗氧化性能，并对其进行生物实验验证。本发明可作为抗氧化剂或降脂药物，有利于雨生红球藻渣的资源化利用。
本发明是采用以下技术方案实现的：
一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP的氨基酸序列为：Lys-Phe-Thr-Pro-Ala-Pro(KFTPAP)。
本发明抗氧化多肽KFTPAP是从雨生红球藻渣中提取蛋白质，并对所述蛋白质进行酶解后，分离纯化得到。
本发明雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP可以作为抗氧化剂或降脂药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP的分子量为659.36Da，纯度高，活性好，安全无毒。经检测，本发明雨生红球藻来源的抗氧化多肽可显著改善秀丽线虫体内的抗氧化能力，抑制脂肪的生物合成，具有较强的抗氧化作用和减脂作用。同时本发明有利于雨生红球藻渣的资源化利用。
附图说明
图1为超滤组分F1、F2和F3的ABTS清除活性；
图2为组分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的液相色谱图(A)和ABTS清除活性(B)；
图3为组分ⅰ、ⅱ和ⅲ的液相色谱图(A)和ABTS清除活性(B)；
图4为不同浓度HPp对秀丽隐杆线虫SOD酶活力的影响；
图5为不同浓度HPp对秀丽隐杆线虫CAT酶活力的影响；
图6为不同浓度HPp对秀丽隐杆线虫MDA含量的影响；
图7为不同浓度HPp对秀丽隐杆线虫脂肪含量的影响；
图8为不同浓度HPp对秀丽隐杆线虫TG含量的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容更加透彻全面。
材料：荆州天然虾青素有限公司提取雨生红球藻中虾青素剩余的基料(雨生红球藻渣)。其余试验材料见表1。
表1试剂表
Figure BDA0004123666300000021
Figure BDA0004123666300000031
实施例1
一种从雨生红球藻中获取抗氧化多肽的方法，包括以下步骤：
(1)酶解
将从雨生红球藻渣中提取的雨生红球藻蛋白质加水制成9％(w:v)蛋白质溶液，加入0.7％(w:w)碱性蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)后将溶液pH调至11.5，所述酶解温度为40℃，酶解时间为3h，酶解结束后离心处理，收集上清液并进行冷冻干燥，得到雨生红球藻酶解物，其中雨生红球藻蛋白质的提取方法如下：
将提取过虾青素的雨生红球藻渣与0.05mol/L的PBS缓冲液按料液比为1g:20mL混合，然后调整pH值为11.5，在56℃下水浴搅拌加热30min，离心过滤后收集上清液，并调整上清液pH值为4.2，在4℃下静置过夜；离心处理后收集固体沉淀(10000r，4℃，15min)，将固体沉淀加水复溶后，并调整pH至中性后冷冻干燥，得到雨生红球藻蛋白。
(2)超滤
将所述雨生红球藻酶解物分散到水中，然后利用超滤膜进行过滤纯化处理，冷冻干燥后得到F1(分子量>10kDa)，F2(分子量3-10kDa)和F3(分子量<3kDa的雨生红球藻酶解物，并检测ABTS清除能力如图1所示；
(3)制备型液相色谱分离纯化
将超滤处理后的雨生红球藻酶解物F3溶解至水中，配制成1mg/mL浓度的溶液，过滤后利用制备型液相色谱仪进行纯化，上样量为5mL，分别收集保留时间为8.6-8.9min、9.2-9.5min、10-10.4min、12.8-13min、13.4-13.7min、13.7～14.7min的I-Ⅵ六种产物，色谱图如图2A显示；然后对上述六种产物进行ABTS清除能力检测，如图2B所示，可见产物Ⅵ的抗氧化性能最高。
其中所述制备型液相色谱仪使用SunFire Prep C18 OBD色谱柱，规格为19×250mm，5μm；
所述色谱条件为：
流动相A为0.1％(v/v)三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈；
线性梯度洗脱程序：0-18min，B相浓度10-32.5％；
流速5mL/min；
检测波长为214nm；
(4)分析型液相色谱分离纯化
将步骤(3)收集的产物Ⅵ用水复溶，制成0.5mg/mL的溶液，过滤后利用分析型液相色谱仪进行二次纯化，上样量为20μL，并收集保留时间为4.75～5.2min、6～6.75min、7.25～7.75min的ⅰ、ⅱ和ⅲ三种产物，如图3A所示，然后对上述三种产物进行ABTS清除能力检测，如图3B所示，可见产物i的抗氧化性能最高。
其中分析型液相色谱仪使用Diamonsil C18色谱柱，规格为4.6×250mm,5μm所述二次纯化的色谱条件为：
流动相A为0.1％(v/v)三氟乙酸溶液，流动相B为乙腈；
线性梯度洗脱程序：0-10min，B相浓度10％，10-20min，B相浓度10-20％，20-22min，B相浓度20-10％；
流速0.5mL/min；
检测波长为214nm。
本发明对步骤(1)得到的蛋白酶解物以及超滤后得到的组分F3、产物VI以及产物i进行ABTS清除活性分析，如表2所示。
表2雨生红球藻源不同纯化多肽组分的ABTS清除活性
Figure BDA0004123666300000041
注：表2中清除率是物质在0.25mg/mL浓度下所测定的活性；活性倍数指各纯化组分的ABTS清除率与蛋白酶解物相比的增加倍数。
实施例2
采用HPLC-MS/MS法检测雨生红球藻抗氧化多肽组分ⅰ的组成及序列。
其中色谱条件：液相为Easy nLC 1200纳升液相系统(ThermoFisher,USA)，C18反相色谱柱(Acclaim PepMap RSLC，75μm×25cm C18-2μm
Figure BDA0004123666300000051
)；流动相A：0.1％甲酸/水，流动相B：80％乙腈，0.1％甲酸；梯度洗脱程序：0-60min，5～38％B。
质谱条件：采用ThermoFisher Q Exactive系统(ThermoFisher，美国)结合纳升喷雾Nano Flex离子源(ThermoFisher，美国)，喷雾电压为1.9kV，离子传输管加热温度为275℃。
本发明检测方法的扫描范围为100-1500m/z，通过PEAKS Studio软件进行数据处理和de novo分析。经过Uniprot数据库检索，得到10个多肽序列，命名为ⅰ-1～i-10，其肽段信息见表3所示。
表3
Figure BDA0004123666300000052
Figure BDA0004123666300000061
/>
采用PeptideRanker系统(http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/)对10条多肽进行初步的生物活性预测。表4显示，i-1～i-10的活性预测得分均高于50分，表示这些多肽均有大于50％的概率存在生理活性，达到初步筛选的标准。然后，将ABTS自由基定为配体，通过Autodock软件模拟多肽和配体间的结合情况，并比较各肽之间的最小结合自由能(表4)。结果显示i-1～i-8与ABTS的结合自由能小于0，表示其能在一般情况下自发地与配体发生相互作用；其中i-1与ABTS的最小结合能最低，为-5.01kcal/mol，表示该肽相对最易与ABTS自由基结合，并发挥清除作用，意味着i-1的抗氧化能力最强。最终确定六肽i-1属于雨生红球藻活性肽，命名为HPp；且这是首次从食物源天然产物中分离出生物活性肽KFTPAP。
表4
Figure BDA0004123666300000062
实施例3
为对活性肽HPp进行活性验证，由上海氨联生物科技有限公司合成高纯度的活性肽HPp(KFTPAP，纯度>98％)，利用秀丽隐杆线虫评价产物i-1(KFTPAP，即HPp)的抗氧化活性。具体方法如下：
秀丽隐杆线虫在含有NGM琼脂培养基的培养皿上生长，并置于20℃的培养箱中培育。使用裂解法获得同一时期的虫卵，待秀丽线虫的受精卵发育至L4期，完成同期化。将2mg多肽产品KFTPAP溶解在378μL蒸馏水中，并与大肠杆菌OP50混合，配制最终浓度分别为0，50，100和200μM的菌液，接种在NGM板中作为秀丽线虫的食物。
其中NGM琼脂培养基的配制参数：按1L计
Figure BDA0004123666300000071
摇匀后，121℃灭菌30min，80℃恒温15min，然后加入下列溶液(胆固醇过滤除菌，其余高温灭菌)。
Figure BDA0004123666300000072
活性评价：当活性物处理4天时，用M9缓冲液冲洗秀丽隐杆线虫至离心管中，后低温研磨10min，离心后得到线虫研磨液(5000r/min，10min)，每种处理方式设置三个平行实验。按说明书的操作方法，用BCA试剂盒测定各组秀丽线虫的蛋白含量，并使用相应试剂盒测定MDA含量和SOD、CAT酶活力，如图4-6所示。
从图4-6可以看出，使用三个浓度的HPp处理后，秀丽隐杆线虫的SOD、CAT酶活均显示出增强的趋势。其中，100μM HPp处理组的线虫SOD酶活力显著高于对照组，酶活力增加了8.04％(P<0.05)；采用浓度为100和200μMHPp处理的线虫体内CAT酶活力显著高于对照组，酶活力分别增加了1.56和1.13倍(P<0.05)。综合分析，认为HPp能有效改善秀丽线虫的抗氧化酶系统，发挥抗氧化作用。
采用低、中浓度HPp培养的秀丽隐杆线虫，能在一定程度上减少线虫的MDA水平。值得关注的是，用100μM HPp培养秀丽隐杆线虫后，体内MDA含量显著下降了38.8％(P<0.05)。结果表明HPp能有效降低秀丽线虫体内MDA含量。经对比，在更低作用浓度下，HPp增强CAT酶活和抑制MDA含量的程度优于已报道的牦牛骨胶原肽UU1(CAT酶活增强倍数：0.33倍，MDA抑制率18.78％，参照论文《Novel antioxidant peptides from Yak bones collagenenhanced the capacities of antiaging and antioxidant in Caenorhabditiselegan》)；这可能是基于分子量更小的特点，HPp更容易被人体吸收，或更易与目标自由基相互作用，从而发挥更强的抗氧化活性。
由此可见，雨生红球藻抗氧化肽HPp可显著改善秀丽线虫体内的抗氧化能力，具有较强的抗氧化作用，其中浓度为100μM时效果最佳。本发明为今后雨生红球藻来源的抗氧化肽应用奠定基础。
本发明ABTS清除活性的测定方法如下：
配制ABTS储备液(终浓度为7mmol/L ABTS和2.45mmol/L过硫酸钾)，并在室温、黑暗环境中静置过夜。测定前用0.01mol/LPBS缓冲液(pH7.4)稀释成ABTS工作液，令溶液在734nm波长处的吸光度为0.70±0.05。测定时，在96孔板中加入100μL ABTS工作液和100μL待测样品，于室温黑暗处放置10min，后测定734nm处的吸光度(A1)；同时空白组数值(A0)由100μL ABTS工作液与100μL三级水反应获得，对照组(A2)由100Μl PBS缓冲液混合100μL样待测样品获得。
Figure BDA0004123666300000081
式中：A0表示空白的吸光值；A1表示样品的吸光值；A2表示对照的吸光值。
实施例4
利用秀丽隐杆线虫测定本发明抗氧化肽HPp的降脂活性，具体试验如下：
(1)活性评价
将裂解后的虫卵放至高糖NGM培养基(含10mM葡萄糖)上生长，在培养基上打入含0，50，100和200μM HPp的大肠杆菌OP50菌液，培养高脂线虫。用M9缓冲液冲洗药物处理3天的线虫(大约1000条，悬浊液为1mL)，按体积比10％加入1％NaN3溶液麻醉20min；沉淀物加入1mL 4％多聚甲醛固定液，之后反复冻融3次。用PBS缓冲液洗净固定液，保留1mL样液，后加入等体积60％异丙醇离心脱水(1500r，4℃，20min)，保留沉淀。用PBS缓冲液洗净异丙醇，保留500μL样液，加入1mL油红O染色工作液，避光振荡染色12h(400r，25℃，12h)。染色完成后，依次采用60％异丙醇和三级水洗去染色液和异丙醇(3000r，20s)，直至上清液洗为澄澈的淡红色。采用电子显微镜CX41(广州市明美光电技术有限公司)拍摄线虫的染色图像(明场，10×物镜)，利用ImageJ软件分析图片染色强度以定量线虫脂肪沉积的程度。每种处理方式设置三个平行实验，每次实验至少拍摄15只线虫。
按说明书的操作方法，用BCA试剂盒测定各组秀丽线虫的蛋白含量，并使用TG试剂盒测定线虫体内TG含量。
(2)染色工作液的制备
在0.05g油红O染料(CAS：1320-06-5)中加入10mL异丙醇，在50-60℃高温下避光溶解20min，以制备5mg/mL油红O母液。将油红O母液和一级水以3:2(v:v)比例混合(5000r，4℃，1min)，上清液于0.25μm针头滤膜中过滤，获得油红O应用液。最后，令油红O应用液与2％TritonX-100以1:1比例混合，获得油红O染色工作液。
(3)结果分析
1、HPp减少了高脂线虫的脂肪含量
线虫的脂肪在肠道上皮细胞合成，油红O染料可以特异地与中性脂肪分子作用并着色，这使得秀丽线虫的脂肪含量可被直观观察和定量分析。因此，通过高糖培养基培育了高脂线虫，药物组线虫摄食不同浓度的HPp，并采用油红O染色法来观察HPp对线虫脂肪含量的影响。
通过Imagej软件定量线虫的染色强度(图7B)，以此判断各处理组的脂肪含量。结果显示，高脂组线虫的脂肪含量显著高于正常组(P<0.05)，意味着高脂模型造模成功。高脂线虫在摄入了50、100和200μM的HPp后，体内脂肪含量均显著低于未摄入药物的组别(P<0.05，图7A)；其中药物组间也存在显著差异，100μM组的脂肪含量最低(P<0.05)，低于高脂组12.97％。结果表明，3个浓度HPp处理均能有效降低高脂组线虫脂肪含量。
2、HPp减少了高脂线虫的甘油三酯含量
甘油三酯(triglycerides，TG)是线虫体内脂肪的主要储存形式，其含量与油红O染色测定结果有较强的相关性。因此，通过测定各组线虫的TG含量，进一步验证HPp对线虫脂肪积累的影响。
如图8所示，高脂组线虫的TG含量显著高于正常组(P<0.05)，表明高脂模型造模成功。高脂线虫在摄入了50、100μM的HPp后，体内TG含量均显著低于未摄入药物的组别(P<0.05)，分别降低18.48和19.62％；而200μM处理组与模型组相比无显著变化(P>0.05)。结果表明，50、100μM HPp处理能有效降低高脂组线虫的TG含量。TG实验与油红O染色结果基本匹配，相关性较高。
综上所述，HPp能有效减少高脂线虫的脂肪沉积，发挥降脂作用，且在100μM浓度时效果最佳。
对比《Fat-lowering effects of isorhamnetin are via NHR-49-dependentpathway in Caenorhabditis elegans》以及《Kahweol Reduces Food Intake ofCaenorhabditis elegans》中异鼠李素和咖啡醇对线虫TG含量的影响，如表5所示。
表5
物质 实验浓度 脂肪总含量减少率 TG含量减少率
HPp 100μM 12.97％ 19.62％
异鼠李素 100μM 未测定 17％
咖啡醇 120μM 未测定 17％
从表5中可见HPp对线虫TG含量的减少率比异鼠李素(17％)和咖啡醇(17％)更高，说明HPp产品具有较强的减脂作用。本发明为今后雨生红球藻来源的减脂肽应用奠定基础
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (3)

1.一种雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP，其特征在于，所述抗氧化多肽KFTPAP的氨基酸序列为：Lys-Phe-Thr-Pro-Ala-Pro。
2.根据权利要求1所述雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP的制备方法，其特征在于，所述制备方法是从雨生红球藻渣中提取蛋白质，并对所述蛋白质进行酶解后，分离纯化得到。
3.根据权利要求1所述雨生红球藻来源的抗氧化多肽KFTPAP的用途，其特征在于，作为抗氧化剂或降脂药物。
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