CN114990181B - 一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用，涉及生物活性肽技术领域。本发明以大豆分离蛋白为原料，进行三次连续酶解，而后经两次膜过滤，得到所述大豆肽，并以DPPH自由基清除率和‑OH‑自由基清除率为筛选指标，筛选得到三条具有强抗氧化活性的大豆来源寡肽。本发明还以斑马鱼为动物模型进行ROS清除率、β‑半乳糖苷酶活性抑制功效评价和端粒酶活性增强功效评价，证实了本发明提供的大豆肽和大豆来源寡肽均具有良好的抗衰老功效。
Description
技术领域
本发明属于生物活性肽技术领域，具体涉及一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用。
背景技术
大豆是蛋白质和植物油料的主要来源，其主要的生产国和出口国是美国；大豆蛋白是在进行豆油加工过程中的主要副产物，是一种优质植物蛋白产品，且是作物蛋白中唯一接近全价蛋白的优质蛋白质。大豆肽是大豆蛋白酶解后的产物，是由不同氨基酸通过酰胺键相互连接组成的分子量在氨基酸与蛋白质之间的一类化合物，一般由2～50个氨基酸脱水缩合而成，其功能活性与其氨基酸的组成和排列顺序有关。大豆多肽含有的必需氨基酸与蛋白几乎完全相同，含量平衡且丰富，更容易被人体消化吸收，同时具有多种功性能特性。
随着人们的生活水平飞速提升，延缓衰老已成为一个热门话题。自由基作为氧化代谢过程中的副产物，在机体中处于动态平衡状态。但是，随着年龄的增长或者在病理情况下，机体中抗氧化酶活性降低，过多的氧自由基聚集在细胞中不能被及时清除，而与机体内的生物大分子发生反应，继而生成过量氧化物或过氧化物聚集在机体内，导致细胞物质和能量代谢不能正常运行。
与大豆蛋白相比，大豆肽具有更好的理化性质如易消化吸收、低抗原性、加热不凝固、易溶于水、流动性好等，且含有某些生理活性物质在机体内有多种生理功能。但是目前关于大豆肽的制备，多为实验室层面，并未能实现工业化成生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用，制备方法简单，且大豆肽得率高，抗衰老作用好。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种抗衰老的大豆肽的制备方法，包括以下步骤：以大豆分离蛋白为原料，依次利用碱性蛋白酶、复合酶和纤维素酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，再依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，过滤液中包含所述大豆肽；
所述复合酶包括中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶。
优选的，所述大豆分离蛋白、碱性蛋白酶、复合酶和纤维素酶的质量比为(450～550)：(4.5～5.5)：(9～11)：(0.9～1.1)。
优选的，在利用碱性蛋白酶进行酶解前，还包括利用无离子水溶解所述碱性蛋白酶，并升温至55～58℃，调节pH至8.5～9.0。
优选的，待碱性蛋白酶的酶解液pH值达降至7.0～7.6时，利用复合酶进行酶解；所述复合酶酶解的时间为1.5～2h，酶解温度为55～58℃。
优选的，所述纤维素酶的酶解时间为4～5h，酶解温度为55～58℃。
优选的，包括利用活性炭进行所述脱色脱味。
优选的，所述0.25μm膜过滤包括利用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速为2000L/h；
所述10nm膜过滤包括利用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速为2800L/h。
本发明还提供了利用上述制备方法得到的抗衰老的大豆肽。
本发明还提供了从上述大豆肽中分离纯化出的大豆来源寡肽，所述大豆来源寡肽包括W1、W2和W3，且W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，W3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了上述大豆肽和/或上述大豆来源寡肽在制备抗衰老的制剂中的应用。
有益效果：本发明提供了一种抗衰老的大豆肽的制备方法，以大豆分离蛋白为原料，进行三次连续酶解，而后经两次膜过滤，得到所述大豆肽。本发明实施例中还对所述大豆肽进行分离纯化，以DPPH自由基清除率和-OH-自由基清除率为筛选指标，筛选抗氧化活性最高的流分进行进一步分离纯化，不断提高单一组分的纯度，并对纯化后的单一组分采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统测定氨基酸结构，得到三条大豆来源寡肽。本发明还以斑马鱼为动物模型进行ROS清除率、β-半乳糖苷酶活性抑制功效评价和端粒酶活性增强功效评价，证实了本发明提供的大豆肽和大豆来源寡肽均具有良好的抗衰老功效。
附图说明
图1为大豆肽经分离纯化后液相谱图；
图2为大豆肽W1二级质谱图；
图3为大豆肽W2二级质谱图；
图4为大豆肽W3二级质谱图；
图5为样品处理后斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度典型图，蓝色表示β-半乳糖苷酶染色强度，颜色越深活性越强。
具体实施方式
本发明提供了一种抗衰老的大豆肽的制备方法，包括以下步骤：以大豆分离蛋白为原料，依次利用碱性蛋白酶、复合酶和纤维素酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，再依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，过滤液中包含所述大豆肽；
所述复合酶包括中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶。
本发明以大豆分离蛋白为原料，对其进行三次连续酶解，所述酶解优选在酶解罐中进行。本发明在实施例中，优选首先往酶解罐中加入6000L无离子水，并调节pH值至8.0左右，而后利用碱性蛋白酶进行第一酶解，首先调节pH至8.0有利用大豆分离蛋白的快速溶解，避免大豆分离蛋白抱团，有利于酶解处理以提高收率，其次采用碱性蛋白酶酶解，由于碱性蛋白酶酶解位点广泛且酶活较高，首先采用碱性蛋白酶对分离蛋白进行初步酶解，可以快速的将大豆分离蛋白酶解成小分子肽，且采用分两次添加碱性蛋白酶有利于酶解的进行，提高酶解效率，避免蛋白酶之间的竞争性抑制作用。本发明所述碱性蛋白酶的质量优选为所述大豆分离蛋白质量的1/100，在本发明实施例中，所述碱性蛋白酶优选分两步添加，首先将一半量的碱性蛋白酶用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至酶解罐中，缓慢升温至55℃～58℃，调节pH至8.5～9.0。本发明对所述调节pH值的方法并没有特殊限定；而后将大豆分离蛋白缓慢加入至上述酶解罐中，期间不断搅拌，再次称取另一半量的碱性蛋白酶用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至酶解罐中，此操作可以减少泡沫的产生。
本发明在所述第一酶解的酶解液pH值降低至7.0～7.6时，优选降至7.2时，利用复合酶进行第二酶解，所述复合酶中包括中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶，且中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶的质量比优选为2:1：1，采用复合蛋白酶进行第二酶解，可进行深层酶解和提高收率，并且菠萝蛋白酶和风味蛋白酶处理后有利于改善大豆肽的口感，减轻肽的苦味。本发明所述复合酶的质量优选为所述大豆分离蛋白质量的1/50.本发明所述第二酶解的温度优选为55～58℃，酶解时间优选为1.5h～2h。
本发明在所述复合酶酶解结束后，利用纤维素酶进行第三酶解，所述纤维素酶的质量优选为所述大豆分离蛋白质量的1/500。采用纤维素酶处理处理目的是，对大豆分离蛋白中残留的大豆纤维进行酶解，以提高后面膜处理的工作效率，本发明所述第三酶解的温度优选为55～58℃，时间优选为4～5h。
本发明对上述酶解所用的酶的来源并没有特殊限定，优选利用本领域的常规市售产品。
本发明在第三酶解结束后优选进行灭酶，所述灭酶优选包括升温至95℃，灭酶10min。本发明在所述灭酶后进行脱色脱味，优选包括利用活性炭进行所述脱色脱味。在本发明实施例中，6000L的酶解罐中优选称取7.5kg活性炭进行脱色脱味，且在所述脱色脱味过程中不需要调节酶解液的pH值，待酶解液降温至50℃，将活性炭缓慢加入至灭酶后的酶解液中，保温2h。
本发明将经活性炭脱色脱味后的酶解液依次过两级膜过滤处理，优选首先用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速稳定至2000L/h，陶瓷膜可以将活性炭、脂肪大分子蛋白以及其他杂质充分过滤掉，极大提升产品的品质；而后将经陶瓷膜过滤后的酶解液用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速稳定在2800L/h，用有机膜浓缩大豆肽酶解液至32％～36％。
本发明优选对两级膜过滤处理后的过滤液进行干燥处理，实施例中优选采用喷雾干燥的方式进行，并设置进风温度为165℃，出风温度为82℃，最终得到颜色较白，口感微微苦的大豆肽。
本发明还提供了利用上述制备方法得到的抗衰老的大豆肽。
本发明还提供了从上述大豆肽中分离纯化出的大豆来源寡肽，所述大豆来源寡肽包括W1、W2和W3，且W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：GYPVVVN，W2的氨基酸序列如SEQID NO.2所示：LVNNDDRDSY，W3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：YDPSTGIY。
在本发明中，氧化应激是生物体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，很多慢性病包括衰老都与体内的氧化作用相关；大量研究表明，人体内过多的游离基会使机体发生病变，其中大豆肽活性物质可以清除人体内过剩氧自由基，它可以保护人体，使其免受自由基的伤害。采用体外抗氧化试验，分析大豆肽中具有抗氧化成分的多肽序列并采用层析色谱和制备型液相分离后选择具有较强抗氧化活性的组分继续利用分析性液相对大豆肽抗氧化组分进行分离纯化，最后采用液质联用技术对强抗氧化性的组分进行氨基酸序列鉴定。
本发明实施例中，对所述大豆来源寡肽和大豆肽进行ROS清除率测定，证实所述大豆来源寡肽和大豆肽，均对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有明显的ROS清除功效；同时对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效，以及对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有促进端粒酶活性增强功效，可应用于抗衰老制品的制备。
本发明还提供了上述大豆肽和/或上述大豆来源寡肽在制备抗衰老的制剂中的应用。
本发明所述应用优选与上述相同，在此不再赘述。
下面结合实施例对本发明提供的一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
大豆肽生产工艺
首先，往酶解罐中加入6000L无离子水，用30％浓度NaOH调节pH至8.0左右；称取2.5kg碱性蛋白酶(上海团昇科技有限公司)用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至酶解罐中，缓慢升温至55℃～58℃，调节pH至8.5～9.0；
按照底物浓度1:12的比例，称取500Kg大豆分离蛋白，缓慢加入至酶解罐中，期间不断搅拌，再次称取2.5kg碱性蛋白酶(上海团昇科技有限公司)用10倍体积的无离子水充分溶解后加入至酶解罐中；
期间不断检测酶解液的pH，待酶解液pH降至7.2左右时，称取5kg中性蛋白酶和2.5kg风味蛋白酶和2.5kg菠萝蛋白酶继续酶解1.5h～2h，称取1.0kg纤维素酶，继续酶解4h～5h，升温至95℃，灭酶10min；
称取7.5kg活性炭(四川德墨活性炭有限公司)，不用调节酶解液的pH，待酶解液降温至50℃，将活性炭缓慢加入至灭酶后的酶解液中，保温2h；
将经活性炭脱色后的酶解液用孔径为0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速稳定至2000L/h；
将经陶瓷膜过滤后的酶解液用孔径为10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速稳定在2800L/h，用有机膜浓缩大豆肽酶解液至32％～36％，后进行喷雾干燥处理，进风温度为165℃，出风温度为82℃，最终得到颜色较白，口感微微苦的大豆肽；
各种基本理化指标检测(大豆肽分子量分布、氨基酸分布等指标)。
表1理化指标检测结果
| 蛋白质 | 水分 | 灰分 |
| 93.9％ | 4.2％ | 1.9％ |
表2大豆肽氨基酸分布
表3大豆肽分子量分布
实施例2
大豆肽组分及其抗氧化性测定
1、分析型液相色谱条件：
色谱条件：Gemini-NX 10μC18100A，4.6×250mm，流速为15mL/min，流动相A(水+0.1％三氟乙酸)，流动相B(乙腈+0.1％三氟乙酸)进行梯度洗脱，洗脱程序见表4，流速1.0mL/min，进样量10μL，吸光度220nm。分析型液相色谱图见图1。得到7个组分，0～5min(D1)、5～10min(D2)、10～15min(D3)、15～20min(D4)、20～25min(D5)、25～30min(D6)、30～35min(D7)、分别7个组分对抗氧化作用进行评价，针对抗氧化效果较好的组分进一步收集，并通过液质联用对该多肽组分的氨基酸序列结构进行鉴定。
表4分析型液相流动相梯度
2、抗氧化性评价
2.1DPPH自由基清除能力测定
将活性肽分别配置成1、2、5、10、20mg/ml的溶液，取0.2mM DPPH(95％乙醇溶解)0.5mL与0.5ml降糖肽溶液，混匀，避光反应30min，于517nm处测定样品吸光度(A样品)，同时以95％乙醇加样品作空白组(A空白)，DPPH溶液加上95％乙醇为对照组(A对照)，DPPH自由基清除率计算见公式I：
2.2羟基自由基清除率测定
将样品配制成溶液，稀释至0.2mg/mL、1mg/mL、5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL的梯度溶液，向其中分别加入0.009mol/L的FeSO41 mL，0.009mol/L的水杨酸-乙醇溶液(50％乙醇溶液)1mL，用漩涡振荡器混合均匀，加入H2O2(0.03％)1mL启动反应。将混合液置于37℃恒温水浴锅中反应30min，若有沉淀产生，5000r/min离心5min，上清液于510nm处测得样品吸光值(A1)，用1mL蒸馏水代替样品，其他条件不变作为对照组(A2)，用1mL 50％乙醇代替水杨酸-乙醇溶液，其他条件不变作为空白组(A0)，羟基自由基的清除率计算见式II；
收集制备型液相色谱仪的洗脱液，并将15个流份冷冻干燥，进行抗氧化性评价。
表515个流份的抗氧化性评价
| 流份 | DPPH自由基清除率(％) | -OH-自由基清除率(％) |
| 流份1 | 39.5 | 16.3 |
| 流份2 | 43.6 | 22.9 |
| 流份3 | 69.1 | 46.4 |
| 流份4 | 89.2 | 76.1 |
| 流份5 | 79.8 | 63.3 |
| 流份6 | 52.3 | 39.1 |
| 流份7 | 31.1 | 19.2 |
3、选择大豆肽D4组分进一步分离纯化，不断提高单一组分的纯度。纯化后的单一组分采用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用系统，对大豆肽D4进行纯度和结构鉴定。
3.1.色谱条件：
(1)流动相：A相：100％纯净水+0.1％甲酸；B相：100％乙腈+0.1％甲酸；
(2)流动相流速：300nl/min；
(3)进样量：1μL上清；
(4)流动相梯度程序如下表6所示。
表6流动相梯度程序
| 时间(分) | 0 | 2.0 | 36.0 | 38.0 | 41.0 | 42.0 | 45.0 |
| A(％) | 97 | 97 | 63 | 10 | 10 | 97 | 97 |
| B(％) | 3 | 3 | 37 | 90 | 90 | 3 | 3 |
利用纳升级液相色谱-Q EXACTIVE质谱联用，从大豆肽D4中纯化得到了3条多肽，鉴定其结构为GYPVVVN、LVNNDDRDSY和YDPSTGIY的单链多肽(图2～4)，通过液质联用技术测定此单链多肽在大豆肽(实施例1制备得到的)的质量百分含量分别为0.72％、0.36％和1.02％。因此，将所述单链多肽命名为大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3。委托上海强耀生物科技有限公司对3条单链多肽进行合成。
实施例3
大豆肽ROS清除功效评价
1.检测材料
1.1.样品配制信息
实施例1制备得到的大豆肽粉、实施例2制备得到的大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3，均用标准稀释水配制成20.0mg/mL母液，现配现用。
阳性对照：过氧化氢酶，棕色液体，批号K2010330，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用超纯水配制成200mg/mL母液，-20℃避光储存。
1.2.实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为受精后6小时(6hpf)的斑马鱼用于样品最大检测浓度(MTC)测定和ROS清除功效评价。
1.3.仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)；96孔酶标板(Costar，China)；多功能酶标仪(SPARK，TECAN，Switzerland)；CM-H2DCFDA(货号C6827，Life Technologies Corporation，USA)。
过氧化氢(批号G2023089，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)。
2.检测方法
2.1ROS清除功效评价
随机选取6hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予大豆肽(W1、W2和W3)和大豆肽粉(浓度见表5)，阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予过氧化氢建立斑马鱼衰老模型。样品与过氧化氢共同处理至4dpf后，每个实验组分别加入活性氧(ROS)检测试剂CM-H2DCFDA，然后将斑马鱼转移至96孔酶标板中，每孔1尾，每孔容量为100μL，置于28℃培养箱中继续孵育至5dpf，实验结束时应用多功能酶标仪检测各实验组斑马鱼ROS荧光值，以该指标的统计学分析结果评价样品对衰老模型斑马鱼ROS清除功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
3.检测结果
3.1.ROS清除功效评价
模型对照组斑马鱼ROS荧光值(5041)与正常对照组(1107)比较p<0.001，表明模型建立成功。阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度组斑马鱼ROS荧光值为2892，与模型对照组比较p<0.01，对斑马鱼ROS清除功效为55％，说明过氧化氢酶具有明显的ROS清除功效。
大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3在25μg/mL浓度组斑马鱼ROS荧光值分别为1034、1895和1556，ROS清除功效分别为102％、62％和69％，与模型对照组比较，p<0.001&p>0.05&p>0.05，提示海洋鱼低聚肽粉大豆肽(W1、W2、W3)在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有明显的ROS清除功效。
大豆肽粉62.5、125和250μg/mL浓度组斑马鱼ROS荧光值分别为5004、534和497，ROS清除功效分别为1％、115％和116％，与模型对照组比较，p>0.05、p<0.001、p<0.001，提示大豆肽粉在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有明显的ROS清除功效(表7)。
表7样品ROS清除功效评价实验结果(n＝10)
与模型对照组比较，**p<0.01，***p<0.001
实施例3
β-半乳糖苷酶活性抑制功效评价
1.检测材料
1.1.样品配制信息
实施例1制备得到的大豆肽粉、实施例2分离纯化得到的大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3，均用标准稀释水配制成20.0mg/mL母液，现配现用。阳性对照：过氧化氢酶，棕色液体，批号K2010330，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用超纯水配制成200mg/mL母液，-20℃避光储存。
1.2.实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为6hpf的斑马鱼用于样品β-半乳糖苷酶活性抑制功效评价。
1.3.仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(Nest Biotech，China)。
过氧化氢(批号G2023089，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(货号C0602，碧云天生物，China)；甲基纤维素(批号B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；组织细胞固定液；4％组织细胞固定液(批号20201216，北京索莱宝科技有限公司，China)。
2.检测方法
随机选取6hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予大豆肽(W1、W2和W3)和大豆肽粉(浓度见表6)，阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予过氧化氢建立斑马鱼衰老模型。样品与过氧化氢共同处理至5dpf后，将斑马鱼用4％组织细胞固定液固定过夜，用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照并保存图片，利用NIS-Elements D3.20高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼整体β-半乳糖苷酶染色强度，以该指标的统计学分析结果评价样品对衰老模型斑马鱼β-半乳糖苷酶活性抑制功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
3.检测结果
模型对照组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度(51822像素)与正常对照组(47204像素)比较p<0.01，表明模型建立成功。阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度为46256像素，与模型对照组比较p<0.05，对斑马鱼β-半乳糖苷酶活性抑制功效为121％，说明过氧化氢酶具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效。
大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3在25μg/mL浓度组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度分别为45809、51491和53973像素，β-半乳糖苷酶活性抑制功效分别为130％、7％和-47％，与模型对照组比较，p<0.05、p>0.05、p>0.05，提示大豆肽(W1、W2、W3)在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效(表6和图5)。
大豆肽粉62.5、125和250μg/mL浓度组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度分别为49837、43721和44314像素，β-半乳糖苷酶活性抑制功效分别为43％、175％和163％，与模型对照组比较，p>0.05&p<0.001&p<0.01，提示大豆肽粉在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效(表8和图5)。
表8样品处理后斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度实验结果(n＝10)
/>
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001
实施例4
端粒酶活性增强功效评价
1.检测材料
1.1.样品配制信息
实施例1制备得到的大豆肽粉、实施例2制备得到的大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3，均用标准稀释水配制成20.0mg/mL母液，现配现用。阳性对照：过氧化氢酶，棕色液体，批号K2010330，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用超纯水配制成200mg/mL母液，-20℃避光储存。
阳性对照：过氧化氢酶，棕色液体，批号K2010330，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用超纯水配制成200mg/mL母液，-20℃避光储存。
1.2.实验动物
斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/L CaCO3)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。
野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为6hpf的斑马鱼用于样品端粒酶活性增强功效评价。
1.3.仪器、耗材与试剂
解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)，CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(NestBiotech，China)；96孔板(NestBiotech，China)；端粒酶ELISA试剂盒(批号H21Y02，上海恒远生物科技有限公司，China)；高速离心机(TG16G，上海依赫生物科技有限公司，中国)；多功能酶标仪(SPARK，TECAN，Switzerland)。
过氧化氢(批号G2023089，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)。
2.检测方法
随机选取6hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予大豆肽(W1、W2和W3)和大豆肽粉(浓度见表7)，阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予过氧化氢建立斑马鱼衰老模型。样品与过氧化氢共同处理至5dpf后，将斑马鱼匀浆取上清，用端粒酶ELISA试剂盒进行反应，应用多功能酶标仪测定各实验组端粒酶活性，以该指标的统计学分析结果评价样品对衰老模型斑马鱼端粒酶活性增强功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。
3.检测结果
模型对照组斑马鱼端粒酶活性(2.54IU/gprot)与正常对照组(2.82IU/gprot)比较p<0.05，表明模型建立成功。阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度组斑马鱼端粒酶活性为3.26IU/gprot，与模型对照组比较p<0.001，对促进斑马鱼端粒酶活性增强功效为28％，说明过氧化氢酶对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型体内端粒酶活性有明显的增强作用。
大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3在25μg/mL浓度组斑马鱼端粒酶活性分别为3.69、3.64和2.95IU/gprot，端粒酶活性增强功效分别为45％、43％和16％，与模型对照组比较，p<0.01&p<0.01&p>0.05，提示大豆肽(W1、W2、W3)在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有促进端粒酶活性增强功效(表9)。
大豆肽粉62.5、125和250μg/mL浓度组斑马鱼端粒酶活性分别为3.48、3.39和2.68IU/gprot，端粒酶活性增强功效分别为37％、33％和6％，与模型对照组比较，p<0.05&p<0.05&p>0.05，提示大豆肽粉在本实验浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有促进端粒酶活性增强功效(表7)。
表9大豆肽W1、大豆肽W2和大豆肽W3在25μg/mL浓度(n＝3)
与模型对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东天久生物技术有限公司
中食都庆（山东）生物技术有限公司
<120> 一种抗衰老的大豆肽及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Tyr Pro Val Val Val Asn
1 5
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Val Asn Asn Asp Asp Arg Asp Ser Tyr
1 5 10
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Tyr Asp Pro Ser Thr Gly Ile Tyr
1 5
Claims (6)
1.一种抗衰老的大豆肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：以大豆分离蛋白为原料，依次利用碱性蛋白酶、复合酶和纤维素酶进行酶解，灭酶后脱色脱味，再依次进行0.25μm膜过滤和10nm膜过滤，过滤液中包含所述大豆肽；所述大豆分离蛋白、碱性蛋白酶、复合酶和纤维素酶的质量比为（450~550）：（4.5~5.5）：（9~11）：（0.9~1.1）；
所述复合酶由中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶组成；所述中性蛋白酶、风味蛋白酶和菠萝蛋白酶的质量比为2：1：1；
在利用碱性蛋白酶进行酶解前，还包括利用无离子水溶解所述碱性蛋白酶，并升温至55~58℃，调节pH至8.5~9.0；
待碱性蛋白酶的酶解液pH值达降至7.0~7.6时，利用复合酶进行酶解；所述复合酶酶解的时间为1.5~2h，酶解温度为55~58℃；
所述纤维素酶的酶解时间为4~5h，酶解温度为55~58℃。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，包括利用活性炭进行所述脱色脱味。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述0.25μm膜过滤包括利用0.25μm孔径的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2MPa，流速为2000L/h；
所述10nm膜过滤包括利用10nm孔径的有机过滤膜处理，处理压力为2.3MPa，流速为2800L/h。
4.利用权利要求1~3任一项所述制备方法得到的抗衰老的大豆肽。
5.从权利要求4所述大豆肽中分离纯化出的大豆来源寡肽，其特征在于，所述大豆来源寡肽包括W1、W2和W3，且W1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，W2的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，W3的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
6.权利要求4所述大豆肽和/或权利要求5所述大豆来源寡肽在制备抗衰老的制剂中的应用。
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