CN111004309B - 一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ace抑制肽及制备方法 - Google Patents

一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ace抑制肽及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法，属于ACE抑制肽技术领域，一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：S1：河鲀酶解液的制备，S2：河鲀酶解液的超滤分离，S3：多肽的分离纯化，S4:多肽的序列鉴定，S5:多肽合成及活性测定。一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，抑制肽为八肽，氨基酸序列为GPRGPQGP(Gly‑Pro‑Arg‑Gly‑Pro‑Gln‑Gly‑Pro)。本发明的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法，采用菊黄东方鲀鱼皮作为原料，获得八肽氨基酸序列，制备的多肽具有ACE抑制活性。

Description

一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法
技术领域
本发明属于ACE抑制肽技术领域，尤其涉及一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法。
背景技术
随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大，再加上运动量的减少，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位。
河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中，当遇到外来危险时使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。
血管紧张素转化酶（ACE）抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸（His-Leu）的切除，能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
现有在从榛子、牦牛乳、贝肉、枸杞等食物中制备ACE抑制肽的技术，但未见从河鲀，尤其是河鲀鱼皮作为原料制备ACE抑制肽的技术。
发明内容
本发明的目的在于提出一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽及制备方法，采用菊黄东方鲀鱼皮作为原料，获得八肽氨基酸序列，制备的多肽具有ACE抑制活性。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，抑制肽为八肽，氨基酸序列为GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)。
优选地，八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的分子量为764.4Da。
优选地，八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的IC50值为2.2-2.4umol/mL。
本发明还提供一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤： S1：河鲀酶解液的制备，取河鲀鱼皮打浆后，加水搅拌形成蛋白溶液，调节PH值至碱性后加入碱性蛋白酶进行酶解，保持pH值不变，酶解结束后进行灭酶处理，然后冷却至室温，调节PH值至中性后离心取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加入水中配制成河鲀酶解液。
S2：河鲀酶解液的超滤分离，对河鲀酶解液进行澄清分离，然后对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率。S3：多肽的分离纯化，将分子量小于1kDa的分离组分用半制备液相色谱进行初步分离纯化，收集得到8种不同吸收峰组分，按吸收峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为A1-A8组分，然后进行ACE活性测定，选择A8组分并对其进行凝胶过滤分离，然后对凝胶过滤分离后的A8组分进行高效液相色谱进行进一步分离纯化，分离得到高纯度多肽组分。
S4：多肽的序列鉴定，对步骤S3分离得到的高纯度多肽组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)，S5:多肽合成及活性测定，将八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)按测定的多肽序列进行固相合成，验证合成多肽的ACE抑制活性。
优选地，步骤S1的具体步骤为：取80-120g河鲀鱼皮打浆后，加入250-350mL蒸馏水中搅拌形成蛋白溶液，用NaOH调节PH值至7.5-9.0加入碱性蛋白酶，加酶量为450-600U/g，在50-60℃条件下酶解6-10h，保持pH值不变，酶解结束后在80-100℃条件下加热12-18min进行灭酶处理，然后冷却至室温，用HCl调节PH值至中性后以4000-6000r/min的速度离心8-12min后取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加蒸馏入水中配制成0.8-1.2mg/mL的河鲀酶解液。
优选地，步骤S2的具体步骤为：对步骤S1制得的河鲀酶解液采用孔径为50-100μm的陶瓷膜进行澄清分离，然后采用50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率。
优选地，步骤S3的半制备液相色谱采用2.5cm×20cm的SinoChrom ODS-BP色谱柱，上样量3-5mL，缓冲溶液采用10%甲醇溶液进行等度洗脱，洗脱流速5mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm，收集得到8种组分，冷冻干燥。
优选地，步骤S3的凝胶过滤分离采用φ20×1000mm的玻璃层析柱，填料为SephadexG-15，填料高度为800-1000mm，检测波长200-240nm，流动相为纯水，流动相流速为4.5-5.5mL/min，温度为室温。
优选地，步骤S3的高效液相色谱采用4.6×250mm 的sunfireC18色谱柱，紫外检测波长为220nm，流动相A为含有质量分数0.4-0.6%TFA的纯水，流动相B为乙腈，平衡时，流动相A与流动相B的流动相体积比为75:25，流动相流速为0.8-1.2mL/min，温度为25℃。
优选地，步骤S4采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLCC18, 75μm i.d.×150mm, 3μm，100Å). 阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500 Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件分析，获得多肽氨基酸序列。
本发明的有益效果为：
1、采用菊黄东方鲀鱼皮作为原料，获得八肽氨基酸序列，制备的多肽具有ACE抑制活性。
2、八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)与ACE之间形成氢键网络，稳定性高。
3、八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro) Pro8羧基氧原子具有电负性，可以与结合位点的Zn2+形成较强的极性作用，从而破坏Zn离子本应有的功能，提高抑制作用。
4、八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)具有较多的疏水残基，这些疏水残基可以与结合口袋残基形成较强的疏水作用和范德华势能。
附图说明
图1是三种蛋白酶酶解液对ACE抑制率的测定图。
图2是本发明步骤S2中收集到的不同分子量分离组分的ACE抑制率的IC50值测定图。
图3是本发明步骤S2中收集到的不同分子量分离组分的ACE抑制活性测定图。
图4是本发明的半制备液相色谱分离图谱。
图5是本发明步骤S3中半制备液相色谱分离收集到的8种吸收组分的ACE抑制活性测定图。
图6是本发明步骤3中经过SephadexG-15纯化的多肽组分图谱。
图7是本发明的高纯度多肽液相色谱图谱。
图8是本发明的高纯度多肽序列测定图谱。
图9是本发明的合成多肽ACE抑制活性测定图。
图10是本发明的合成多肽与ACE结合模式。
图11是本发明的合成多肽与ACE的抑制模式及作用机理。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
本实施例提供的一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，抑制肽为八肽，氨基酸序列为GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)。
八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的分子量为764.4Da。
本实施例还提供一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，包括如下步骤：
S1：河鲀酶解液的制备，取100g河鲀鱼皮打浆后，加入300mL蒸馏水中搅拌形成蛋白溶液，用NaOH调节PH值至8.0，然后加入碱性蛋白酶，加酶量为500U/g，在55℃条件下酶解10h，保持pH值不变，酶解结束后在90℃条件下加热15min进行灭酶处理，然后冷却至室温，用HCl调节PH值至中性后以5000r/min的速度离心10min后取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，4℃保存，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加蒸馏入水中配制成1mg/mL的河鲀酶解液。
如图1所示，以3种商业蛋白酶：胃蛋白酶（最适pH及温度为：pH5.7，60℃）、中性蛋白酶（最适pH及温度为：pH7.0，50℃）、碱性蛋白酶（最适pH及温度为：pH8.0，55℃）为酶制剂筛选源，研究其在最适条件下对菊黄东方鲀鱼皮水解ACE抑制率的影响，筛选出适合河鲀鱼皮蛋白水解产ACE抑制肽的蛋白酶。结果显示，运用碱性蛋白酶具有最佳的酶解效果。酶解条件为：碱性蛋白酶酶浓度：500U/g，pH值用氢氧化钠（NaOH）调至8.0，酶解温度为55℃，酶解时间10h。
S2：河鲀酶解液的超滤分离，对步骤S1制得的河鲀酶解液采用孔径为50μm的陶瓷膜进行澄清分离，然后采用50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率的IC50值。结果表明，如图2所示，分子量小于1kDa组分的ACE抑制率最高，如图3所示，分子量小于1kDa组分的ACE抑制活性最高，因此，选择分子量小于1kDa的分离组分进行后续纯化。
S3：多肽的分离纯化，将分子量小于1kDa的分离组分用半制备液相色谱进行初步分离纯化，收集得到8种不同吸收峰组分，按吸收峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为A1-A8组分，如图4所示。然后进行ACE活性测定，如图5所示，显示A4、A5、A7、A8具有较高的ACE抑制活性，本方法选择A8组分并对其进行凝胶过滤分离，然后对凝胶过滤分离后的A8组分进行高效液相色谱进行进一步分离纯化，分离得到高纯度多肽组分。
具体的，步骤S3的半制备液相色谱采用2.5cm×20cm的SinoChrom ODS-BP色谱柱，上样量5mL，缓冲溶液采用10%甲醇溶液进行等度洗脱，洗脱流速5mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm，收集得到8种组分，冷冻干燥。
具体的，步骤S3的凝胶过滤分离采用φ20×1000mm的玻璃层析柱，填料为SephadexG-15，填料高度为900mm，检测波长220nm，流动相为纯水，流动相流速为5mL/min，温度为室温，如图6所示，为经过SephadexG-15纯化的多肽组分图谱。
具体的，步骤S3的高效液相色谱采用4.6×250mm 的sunfireC18色谱柱，紫外检测波长为220nm，流动相A为含有质量分数0.5%TFA的纯水，流动相B为乙腈，平衡时，流动相A与流动相B的流动相体积比为75:25，流动相流速为1mL/min，温度为25℃，如图7所示，为高纯度多肽液相色谱图谱。
S4:多肽的序列鉴定，对步骤S3分离得到的高纯度多肽组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)，具体的，采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18, 75μm i.d.×150mm,3μm，100Å). 阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500 Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件分析，获得多肽氨基酸序列GPRGPQGP，其序列测定图谱如图8所示。
S5:多肽合成及活性测定，将八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)按测定的多肽序列进行固相合成，验证合成多肽的ACE抑制活性。结果显示，纯化多肽具有良好的ACE抑制活性，制得的八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的IC50值为2.3umol/mL。合成多肽的ACE抑制活性测定如图9所示。
运用Discovery Studio软件进行多肽和ACE对接机理模拟分析，结果如下：
如图10-11所示，八肽GPRGPQGP与ACE之间形成的氢键网络。二者可形成7氢键相互作用，这些氢键作用，对于多肽与ACE的稳定结合至关重要。相比于其他多肽，该多肽与ACE间的氢键较少。与多肽形成氢键作用的结 合口袋 残基包括：Tyr146，Glu162，Asn227，His353等。此外，多肽Pro8羧基氧原子具有电负性，可以与结合位点的Zn2+形成较强的极性作用，从而破坏Zn离子本应有的功能 。因 此，对于多肽抑制作用的发挥，亦起到一定作用。除氢键作用外，ACE结合口袋内多个疏水残基与多肽形成较强的堆积或者范德华对势作用，对于多肽的稳定结合亦具有重要贡献。这些残基包括：Peh512，Trp279，Val518，Phe527等。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术；以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (9)

1.一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，其特征在于，
所述抑制肽为八肽，氨基酸序列为GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)。
2.根据权利要求1所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，其特征在于，
所述八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的分子量为764.4Da。
3.根据权利要求1所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽，其特征在于，
所述八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)的IC50值为2.2-2.4umol/mL。
4.一种以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：河鲀酶解液的制备
取河鲀鱼皮打浆后，加水搅拌形成蛋白溶液，调节PH值至碱性后加入碱性蛋白酶进行酶解，加酶量为450-600U/g，在50-60℃条件下酶解6-10h，保持pH值不变，酶解结束后进行灭酶处理，然后冷却至室温，调节PH值至中性后离心取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加入水中配制成河鲀酶解液；
S2：河鲀酶解液的超滤分离
对河鲀酶解液进行澄清分离，然后对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率；
S3：多肽的分离纯化
将分子量小于1kDa的分离组分用半制备液相色谱进行初步分离纯化，半制备液相色谱采用2.5cm×20cm的SinoChrom ODS-BP色谱柱，上样量3-5mL，缓冲溶液采用10％甲醇溶液进行等度洗脱，洗脱流速5mL/min，收集得到8种不同吸收峰组分，按吸收峰的时间范围收集洗脱液，分别命名为A1-A8组分，然后进行ACE活性测定，选择A8组分并对其进行凝胶过滤分离，然后对凝胶过滤分离后的A8组分进行高效液相色谱进行进一步分离纯化，高效液相色谱采用4.6×250mm的sunfireC18色谱柱，紫外检测波长为220nm，流动相A为含有质量分数0.4-0.6％TFA的纯水，流动相B为乙腈，平衡时，流动相A与流动相B的流动相体积比为75:25，流动相流速为0.8-1.2mL/min，温度为25℃，分离得到高纯度多肽组分；
S4：多肽的序列鉴定
对步骤S3分离得到的高纯度多肽组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)；
S5：多肽合成及活性测定
将所述八肽GPRGPQGP(Gly-Pro-Arg-Gly-Pro-Gln-Gly-Pro)按测定的多肽序列进行固相合成，验证合成多肽的ACE抑制活性。
5.根据权利要求4所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，
所述步骤S1的具体步骤为：
取80-120g河鲀鱼皮打浆后，加入250-350mL蒸馏水中搅拌形成蛋白溶液，用NaOH调节PH值至7.5-9.0加入碱性蛋白酶，加酶量为450-600U/g，在50-60℃条件下酶解6-10h，保持pH值不变，酶解结束后在80-100℃条件下加热12-18min进行灭酶处理，然后冷却至室温，用HCl调节PH值至中性后以4000-6000r/min的速度离心8-12min后取上清液，上清液冷冻干燥，得到粗河鲀ACE抑制肽，将冷冻干燥后的粗河鲀ACE抑制肽加蒸馏入水中配制成0.8-1.2mg/mL的河鲀酶解液。
6.根据权利要求4所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，
所述步骤S2的具体步骤为：
对所述步骤S1制得的河鲀酶解液采用孔径为50-100μm的陶瓷膜进行澄清分离，然后采用50kDa、30kDa、10kDa、5kDa、1kDa的聚醚砜超滤膜对澄清的河鲀酶解液进行超滤处理，分别收集不同大小分子量的分离组分并冻干，测定各分离组分的ACE抑制率。
7.根据权利要求4所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，
所述步骤S3的半制备液相色谱采用2.5cm×20cm的SinoChrom ODS-BP色谱柱，上样量3-5mL，缓冲溶液采用10％甲醇溶液进行等度洗脱，洗脱流速5mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm，收集得到8种组分，冷冻干燥。
8.根据权利要求4所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，
所述步骤S3的凝胶过滤分离采用φ20×1000mm的玻璃层析柱，填料为SephadexG-15，填料高度为800-1000mm，检测波长220nm，流动相为纯水，流动相流速为4.5-5.5mL/min，温度为室温。
9.根据权利要求4所述的以菊黄东方鲀鱼皮为原料的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于，
所述步骤S4采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18,75μmi.d.×150mm,3μm，
Figure FDA0002928206390000021
阳离子模式，扫描范围：m/z 300–1500Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件分析，获得多肽氨基酸序列。
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