CN113603745B - 一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽及其制备方法、应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽及其制备方法、应用，属于多肽技术领域，一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽为十肽，氨基酸序列：TLRFALHGME。一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，包括以下步骤：S0：固定化ACE凝胶亲和吸附柱的制备，S1：肽组分的制备，S2：肽组分的亲和吸附和洗脱，S3：肽的序列鉴定，S4：验证合成活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的ACE抑制活性。本发明制备的固定化ACE凝胶亲和吸附柱用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的筛选具有筛选快速高效、操作简便易行的特点，可用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的快速规模化筛选，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽具有ACE抑制活性和DPP‑Ⅳ抑制活性。

Description

一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽及其制备方法、应用
技术领域
本发明属于多肽技术领域，尤其涉及一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽及其制备方法、应用。
背景技术
随着社会的进步与发展，人们生活水平逐渐提高，饮食中脂肪与热量的比重逐渐加大，再加上运动量的减少，我国心血管疾病的发病率快速上升，其中高血压占主要地位。
正常情况下，人体能够通过激素调节和神经调节这两大调节系统确保血糖的来源与去路保持平衡，使血糖维持在一定水平。但是在遗传因素(如糖尿病家族史)与环境因素(如不合理的膳食、肥胖等)的共同作用下，两大调节功能发生紊乱，就会出现血糖水平的升高。
河鲀为暖温带及热带近海底层鱼类，栖息于海洋的中、下层，有少数种类进入淡水江河中，当遇到外来危险时使整个身体呈球状浮上水面，同时皮肤上的小刺竖起，借以自卫。
血管紧张素转化酶(ACE)抑制肽是经过蛋白水解后形成的小分子多肽，它具有显著的降血压作用，更有效的是它与其它普通降压药物比较发现，ACE抑制肽无毒副作用，并且对正常的血压无影响。ACE在血压调节中起重要作用，经碳端两个氨基酸(His-Leu)的切除，能够把原本无活性的血管紧张素Ⅰ转变为具有活性的血管紧张素Ⅱ，引起血管收缩，使血压上升；ACE还会使具有血管舒张功能的舒缓激肤失活，同样又引起血压上升的情形，ACE抑制肽能够阻断ACE引起的两种生化反应过程，起到降血压的作用。
现有制备的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽需要对酶解后的肽组分进行吸附洗脱处理，其中，吸附柱起到至关重要的作用，尤其是其填料，影响着洗脱效率。
现有在从榛子、牦牛乳、贝肉、枸杞等食物中制备多肽的技术，因此亟需一种以河鲀为原料制备活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的技术。
发明内容
本发明的目的在于提出一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽及其制备方法、应用，制备的固定化ACE凝胶亲和吸附柱用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的筛选具有筛选快速高效、操作简便易行的特点，可用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的快速规模化筛选，采用河鲀鱼皮作为原料，获得活性菊黄东方鲀鱼皮多肽氨基酸序列，制备的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽具有ACE抑制活性和DPP-Ⅳ抑制活性，可用于降血压药物和二肽基肽酶Ⅳ抑制剂的制备，具有良好的降压降血糖效果。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供的一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽为十肽，氨基酸序列：TLRFALHGME。
优选地，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的ACE抑制率的IC50值为0.02-0.03umol/mL。
优选地，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的DPP-Ⅳ抑制率的IC50值为9.5-9.6mg/mL。
本发明还提供一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，包括以下步骤：S0：固定化ACE凝胶亲和吸附柱的制备，S1：肽组分的制备，取菊黄东方鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kDa的肽组分，S2：肽组分的亲和吸附和洗脱，将步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分用步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱进行亲和吸附和洗脱，并进行紫外检测，紫外检测波长为220nm，收集洗脱峰组分，分别命名为第1-24组分，然后进行ACE活性测定，选择第3组分进行脱盐，减压浓缩后待用，S3：肽的序列鉴定，对步骤S2减压浓缩后的第3组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME，S4：将活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME按步骤S3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的ACE抑制活性。
优选地，步骤S0的具体步骤：S01：将ACE溶解于硼酸盐缓冲液制得ACE螯合配体溶液，S02：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4B中加入稀盐酸进行溶胀，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余HCl，得溴化氰活化琼脂糖4B填料，S03：将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化琼脂糖4B填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ACE，S04：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4B填料与Tris-HCl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤，S05：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替清洗过滤3-5次，得ACE固定化凝胶填料，将ACE固定化凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化ACE凝胶亲和吸附柱。
优选地，ACE的酶活力单位为4.5-5.5U/ml，硼酸盐缓冲液的pH为8.1-8.4，摩尔浓度为0.08-0.12M，除步骤S05的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45-0.55M的NaCl，溴化氰活化琼脂糖凝胶4B与稀盐酸的质量体积比为0.8-1.2g：5mL，稀盐酸的摩尔浓度为0.9-1.1mM，螯合过夜的温度条件为0-4℃，Tris-HCl缓冲液的pH为7.9-8.1，摩尔浓度为0.08-0.12M，步骤S05的Tris-HCl缓冲液含有0.45-0.55M的NaCl，轻柔振荡的振荡温度为23-27℃，振荡时间为1.8-2.2h，醋酸盐缓冲液的pH为3.8-4.2，摩尔浓度为0.08-0.12M，含有0.45-0.55M的NaCl。
优选地，步骤S1中，采用酶活力单位为5万U/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8-1.2％，pH值为7.8-8.2，酶解温度为58-62℃，酶解时间为5.8-6.2h，绞碎后加入的水为蒸馏水，菊黄东方鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9-1.1kg:10L，采用转速为11000-13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆，酶解后通过煮沸加热9-11min进行灭酶处理，采用HCl调节pH值至中性，微滤采用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600-1000L/M2H，超滤采用截留分子量为1kDa的聚醚砜超滤膜。
优选地，步骤S2具体包括：S21：在中压蛋白纯化仪上，安装好步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱，用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液进行平衡18-22min，平衡流速0.45-0.55mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm，S22：平衡后进行步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分的上样吸附，上样量4.5-5.5mL，流动相用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液，流速0.45-0.55mL/min，观察至检测基线平稳后14-16min，以摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，且硼酸盐缓冲液含有0.8-1.2M的NaCl，洗脱流速0.45-0.55mL/min，收集洗脱峰组分，S23:固定化ACE凝胶亲和吸附柱用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液重新进行平衡18-22min后，按步骤S22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，分别命名为第1-24组分，然后进行ACE活性测定，选择第3组分，采用截留分子量为100D的透析袋对第3组分进行脱盐，减压浓缩后待用。
优选地，步骤S3中，采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMapRPLC C18,75μm i.d.×150mm,3μm，
Figure BDA0003203461650000041
阳离子模式，扫描范围：m/z 300-1500Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件进行从头测序de novo Sequencing分析，获得高可信活性菊黄东方鲀鱼皮多肽氨基酸序列。
本发明还提供上述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽在制备降血压药物中的应用。
本发明还提供上述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。
本发明的有益效果为：
1、采用河鲀鱼皮作为原料，获得活性菊黄东方鲀鱼皮多肽氨基酸序列，制备的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽具有ACE抑制活性，可应用于降血压药物，具有良好的降血压效果。
2、制备的固定化ACE凝胶亲和吸附柱用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的筛选具有筛选快速高效、操作简便易行的特点，可用于活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的快速规模化筛选。
3、制备的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME具有DPP-Ⅳ抑制活性，可应用于二肽基肽酶Ⅳ抑制剂，降血糖效果良好。
4、活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME与ACE形成12个氢键作用，稳定性高，此外，亦存在其他疏水作用和静电作用，接触点位较多。
附图说明
图1是本发明的步骤S23中收集到的第1-24组分的ACE抑制活性测定图。
图2是本发明的固定化ACE凝胶亲和吸附柱对肽组分的亲和洗脱图谱。
图3是本发明的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的浓度对ACE抑制率的测定图。
图4是本发明的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME与ACE结合模式。
图5是本发明的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME与ACE的抑制模式及作用机理。
图6是本发明的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME对SHR大鼠的降血压效果图。
图7是本发明的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的DPP-Ⅳ抑制效果图。
具体实施方式
现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明。
本实施例中提供的一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽为十肽，氨基酸序列：TLRFALHGME。
本实施例还提供一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，包括以下步骤：
S0：固定化ACE凝胶亲和吸附柱的制备
将酶活力单位为5U/ml的ACE溶解于50ml的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3，含0.5MNaCl)，制得ACE螯合配体溶液。称取10g溴化氰活化琼脂糖4B填料置100ml烧杯中，加入50mL1mM HCl进行溶胀，过滤后用0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3，含0.5M NaCl)清洗、滤干，除去残余HCl，得溴化氰活化琼脂糖4B填料。将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，搅拌均匀后，在4℃条件下螯合过夜，螯合后，用5倍溴化氰活化琼脂糖4B填料体积的0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3，含0.5M NaCl)进行清洗和过滤，除去多余的ACE。将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4B填料与50mL 0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)混匀，在25℃下轻柔振荡2h。过滤后，0.1M醋酸盐缓冲液(pH4.0，含0.5M NaCl)和0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0，含0.5MNaCl)交替清洗过滤3次，得ACE固定化凝胶填料。将ACE固定化凝胶填料悬浮于0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)，装填入柱体积5ml的层析柱(Φ0.9×1.57cm)，即为固定化ACE凝胶亲和吸附柱。
S1：肽组分的制备
取1000g菊黄东方鲀鲜鱼皮，绞碎后加入10L蒸馏水，组织匀浆器中12000rpm/min转速匀浆形成鱼皮浆料液，在碱性蛋白酶(5万U/g)添加量为1％，pH值为8.0，酶解温度60℃条件下酶解6h，酶解后煮沸加热10min进行灭酶处理，冷却后用HCl调节pH值至中性。酶解液应用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件(过滤精度200nm,600-1000L/M2H)进行微滤后，采用的聚醚砜超滤膜(截留分子量1kDa)进行超滤处理，获得分子量小于1kDa的肽组分。
S2：肽组分的亲和吸附和洗脱
S21：在中压蛋白纯化仪(AKTA pure 25)上，安装好步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱，用0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)进行平衡20min，平衡流速0.5mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm。
S22：平衡后进行步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分的上样吸附，上样量5mL,流动相为0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)，流速0.5mL/min,观察至检测基线平稳后15min，以0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3含1M NaCl)为洗脱流动相进行洗脱，洗脱流速0.5mL/min，收集洗脱峰组分。
S23:固定化ACE凝胶亲和吸附柱用0.1M硼酸盐缓冲液(pH 8.3)重新进行平衡20min后，按步骤S22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，分别命名为第1-24组分，然后进行ACE活性测定，如图1所示，显示第3、第16、第17组分具有较高的ACE抑制活性，本方法选择第3组分，采用截留分子量为100D的透析袋对第3组分进行脱盐，减压浓缩后待用。
固定化ACE凝胶亲和吸附柱对肽组分的亲和洗脱图谱如图2所示。
S3：肽的序列鉴定，对步骤S2减压浓缩后的第3组分进行质谱测定，对质谱测定的结果进行分析，得到活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME，具体的，采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18,75μm i.d.×150mm,3μm，
Figure BDA0003203461650000071
阳离子模式，扫描范围：m/z 300-1500Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件进行从头测序de novo Sequencing分析，获得高可信活性菊黄东方鲀鱼皮多肽氨基酸序列。
S4：将活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME按步骤S3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的ACE抑制活性。结果显示，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME具有良好的ACE抑制活性，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的ACE抑制率的IC50值为0.0229umol/mL(0.0269mg/mL)。
活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的浓度对ACE抑制率的测定图如图3所示。
机理研究：
运用Discovery Studio软件进行活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME和ACE对接机理模拟分析，结果如下：
如图4-5所示，TLRFALHGME与ACE形成12个氢键作用，这些氢键作用对于二者稳定结合至关重要。与活性菊黄东方鲀鱼皮多肽形成氢键作用的结合口袋残基包括：Ala354、His513、Lys511、Tyr523。此外，亦存在其他疏水作用和静电作用，接触点位较多。
本发明还提供上述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽在制备降血压药物中的应用。
动物降血压实验：
以SHR大鼠为动物模型，将TLRFALHGME以10mg/kg(大鼠体重)剂量进行一次性尾静脉注射实验，卡托普利尾静脉注射剂量为5mg/kg(大鼠体重)作为药物对照组。
如图6所示，结果显示，TLRFALHGME在尾静脉注射后，在2、4、6、12、24h后收缩压分别为158.1、145.5、144.3、135.5、154.1mmHg，分别降低了16.1％、22.7％、23.4％、28.1％和18.2％，降血压效果优于卡托普利对照组。其中，12h的收缩压血压值接近正常血压，而且活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME一次注射后，降压效果可持续24h以上。实验表明，TLRFALHGME具有良好的降血压效果。
本发明还提供上述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽在制备二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。
活性菊黄东方鲀鱼皮多肽抑制DPP-Ⅳ活性测定：
DPP-Ⅳ抑制剂即二肽基肽酶Ⅳ抑制剂，是一类治疗2型糖尿病的药物，该类药物能够抑制胰高血糖素样肽-1(GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素分泌活性菊黄东方鲀鱼皮多肽(GIP)的灭活，提高内源性GLP-1和GIP的水平，促进胰岛β细胞释放胰岛素，同时抑制胰岛α细胞分泌胰高血糖素，从而提高胰岛素水平，降低血糖，且不易诱发低血糖和增加体重。
测定活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的DPP-Ⅳ抑制活性，如图7所示，结果显示，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME具有一定的DPP-Ⅳ抑制活性，活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME的DPP-Ⅳ抑制率的IC50值为9.55mg/mL。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解；其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
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Thr Leu Arg Phe Ala Leu His Gly Met Glu
1 5 10

Claims (6)

1.一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽，其特征在于，
所述活性菊黄东方鲀鱼皮多肽为十肽，氨基酸序列：TLRFALHGME。
2.一种活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，其特征在于，
包括以下步骤：
S0：固定化ACE凝胶亲和吸附柱的制备；
S1：肽组分的制备，取菊黄东方鲀鲜鱼皮，绞碎后加入水，匀浆形成鱼皮浆料液，加入蛋白酶进行酶解，采用酶活力单位为5万U/g的碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为碱性蛋白酶添加量为鱼皮浆料液质量的0.8-1.2％，pH值为7.8-8.2，酶解温度为58-62℃，酶解时间为5.8-6.2h，酶解后进行灭酶处理，冷却后调节pH值至中性，得酶解液，对酶解液进行微滤，然后进行超滤处理，获得分子量小于1kDa的肽组分；
S21：在中压蛋白纯化仪上，安装好所述步骤S0制得的固定化ACE凝胶亲和吸附柱，用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液进行平衡18-22min，平衡流速0.45-0.55mL/min，并在紫外检测仪检测，紫外检测波长为220nm；
S22：平衡后进行所述步骤S1获得的分子量小于1kDa的肽组分的上样吸附，上样量4.5-5.5mL，流动相用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液，流速0.45-0.55mL/min，观察至检测基线平稳后14-16min，以摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液为洗脱流动相进行洗脱，且硼酸盐缓冲液含有0.8-1.2M的NaCl，洗脱流速0.45-0.55mL/min，收集洗脱峰组分；
S23:固定化ACE凝胶亲和吸附柱用摩尔浓度为0.08-0.12M、pH为7.9-8.1的硼酸盐缓冲液重新进行平衡18-22min后，按步骤S22进行多次的肽组分上样和洗脱，将多次洗脱峰组分合并，采用截留分子量为100D的透析袋对洗脱峰组分进行脱盐，减压浓缩后待用；
S3：肽的序列鉴定，对步骤S2减压浓缩后的洗脱峰组分进行质谱测定，采用LC-MS/MS进行质谱测定，测定条件为：色谱柱为PepMap RPLC C18,75μm i.d.×150mm,3μm，
Figure FDA0004184763400000021
阳离子模式，扫描范围：m/z 300-1500Da，发射极喷雾电压2-kV，质谱测定的结果用PEAKS STUDIO软件进行分析，得到其中一条活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的氨基酸序列为TLRFALHGME；
S4：将活性菊黄东方鲀鱼皮多肽TLRFALHGME按步骤S3测定的氨基酸序列进行固相合成，验证合成活性菊黄东方鲀鱼皮多肽的ACE抑制活性。
3.根据权利要求2所述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，其特征在于，
所述步骤S0的具体步骤：
S01：将ACE溶解于硼酸盐缓冲液制得ACE螯合配体溶液；
S02：往溴化氰活化琼脂糖凝胶4B中加入稀盐酸进行溶胀，过滤后用硼酸盐缓冲液清洗、滤干，除去残余HCl，得溴化氰活化琼脂糖4B填料；
S03：将ACE螯合配体溶液与溴化氰活化琼脂糖4B填料混合，搅拌均匀后螯合过夜，螯合后，用4-6倍溴化氰活化琼脂糖4B填料体积的硼酸盐缓冲液进行清洗和过滤，除去多余的ACE；
S04：将滤干后的溴化氰活化琼脂糖4B填料与Tris-HCl缓冲液混匀，进行轻柔振荡后过滤；
S05：过滤后，采用醋酸盐缓冲液和Tris-HCl缓冲液交替清洗过滤3-5次，得ACE固定化凝胶填料，将ACE固定化凝胶填料悬浮于硼酸盐缓冲液，装填入层析柱，即为固定化ACE凝胶亲和吸附柱。
4.根据权利要求3所述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，其特征在于，
ACE的酶活力单位为4.5-5.5U/ml；
硼酸盐缓冲液的pH为8.1-8.4，摩尔浓度为0.08-0.12M，除步骤S05的硼酸盐缓冲液外，其余步骤的硼酸盐缓冲液均含有0.45-0.55M的NaCl；
溴化氰活化琼脂糖凝胶4B与稀盐酸的质量体积比为0.8-1.2g：5mL，稀盐酸的摩尔浓度为0.9-1.1mM；
螯合过夜的温度条件为0-4℃；
Tris-HCl缓冲液的pH为7.9-8.1，摩尔浓度为0.08-0.12M，步骤S05的Tris-HCl缓冲液含有0.45-0.55M的NaCl；
轻柔振荡的振荡温度为23-27℃，振荡时间为1.8-2.2h；
醋酸盐缓冲液的pH为3.8-4.2，摩尔浓度为0.08-0.12M，含有0.45-0.55M的NaCl。
5.根据权利要求2所述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽制备方法，其特征在于，
所述步骤S1中，
绞碎后加入的水为蒸馏水，菊黄东方鲀鲜鱼皮与蒸馏水的质量体积比为0.9-1.1kg:10L；
采用转速为11000-13000rpm/min的组织匀浆器进行匀浆；
酶解后通过煮沸加热9-11min进行灭酶处理，采用HCl调节pH值至中性；
微滤采用Φ30mm×800mm的陶瓷膜元件，过滤精度为200nm，膜通量为600-1000L/M2H，超滤采用截留分子量为1kDa的聚醚砜超滤膜。
6.根据权利要求1所述的活性菊黄东方鲀鱼皮多肽在制备降血压药物或二肽基肽酶Ⅳ抑制剂中的应用。
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