CN102153652A

CN102153652A - 一种融合蛋白的表达方法及用途

Info

Publication number: CN102153652A
Application number: CN2010105956314A
Authority: CN
Inventors: 赵同峰; 赵江佩; 黄晓
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2011-08-17

Abstract

本发明提供人脂联素状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达方法，通过构建含人gAd-GLP-1-A融合基因的原核表达载体，转化Escherichia coliBL21(DE3)，经过诱导表达，从包涵体内获得含6×His tag的gAd-GLP-1-A融合蛋白，进一步用肠激酶对其切割获得该融合蛋白。动物研究表明该融合蛋白具有显著的降低血糖的活性。本发明既能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能改善胰岛素抵抗，可显著纠正2型糖尿病体内代谢紊乱，可在制备治疗2型糖尿病药物中应用。

Description

一种融合蛋白的表达方法及用途

技术领域

本发明涉及生物领域，涉及一种融合蛋白的表达方法，尤其涉及人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白的表达方法及用途。

背景技术

2型糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是严重危害人类健康的疾病，患病人数正随着生活水平的提高、人口老龄化，以及诊断技术的进步而迅速增加。近年的研究表明胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足是2型糖尿病特征性的病理生理改变，二者相互作用，最终导致2型糖尿病的发生。不仅如此，胰岛素抵抗还参与了糖尿病慢性并发症如心血管并发症、糖尿病肾病等的发生、发展，是联系2型糖尿病、高血压、高脂血症、冠心病的一个重要枢纽。因此针对2型糖尿病的发病机制，采用有效的药物减轻胰岛素抵抗、增加胰岛素分泌对于2型糖尿病及其并发症的治疗具有重要的意义。在目前尚无有效的药物能同时针对2型糖尿病发病机制的两个方面既胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足进行治疗。尽管已经有胰岛素增敏剂如噻唑烷二酮类药物和许多种类的口服降糖药物在临床上应用，但这些药物主要是针对2型糖尿病发病机制的某一方面(单纯针对胰岛素抵抗或胰岛素分泌不足或作用于糖吸收或代谢的某一环节)进行治疗，而且它们分别改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌、降低血糖的能力并不尽如人意，长期应用作用会逐渐降低，同时这些药物所具有的副作用，也极大地限制了它们在临床上的应用。即使是胰岛素，也因为胰岛素抵抗的存在降糖作用大大降低，大剂量应用胰岛素还可能加重糖尿病慢性并发症的发展。鉴于此，国际上正在积极地寻找新的能改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌的药物，以期能更有效、安全地治疗2型糖尿病。

脂联素(Adiponectin)是近年发现的脂肪细胞分泌的特异性蛋白，其分泌异常在胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生、发展中起着重要作用，血清脂联素浓度可以预测个体将来发生的胰岛素抵抗的风险。2型糖尿病患者血浆脂联素水平明显下降，前瞻性纵向研究表明，基础血浆脂联素浓度是2型糖尿病发病的独立危险因子，高浓度的血浆脂联素提示有较小的2型糖尿病发病风险，在以后要发展为2型糖尿病的个体，其血浆脂联素浓度显著低于对照组，2型糖尿病发病后仍持续下降，并与胰岛素的敏感性下降相平行。脂联素基因可能是2型糖尿病的易感基因，脂联素基因缺乏的纯合子小鼠(Adipo-/-小鼠)表现出中度的胰岛素抵抗和糖耐量异常。这些研究表明脂联素产生的异常参与了胰岛素抵抗和2型糖尿病的发生、发展，而用重组脂联素对糖尿病和胰岛素抵抗动物治疗后可显著改善胰岛素抵抗，降低血糖。脂联素不刺激胰岛素分泌，但增强胰岛素对肝细胞葡萄糖生成的抑制，使亚生理浓度的胰岛素同样能抑制肝糖输出。脂联素还可降低高脂高蔗糖喂养的小鼠循环游离脂肪酸和甘油三酯水平，减轻小鼠体重，增加骨骼肌细胞对游离脂肪酸的摄取、氧化和能量消耗，使骨骼肌甘油三酯含量降低，从而增强骨骼肌细胞胰岛素信号传导，增加胰岛素敏感性。脂联素除了可改善胰岛素抵抗，参与调节糖、脂代谢外，还拮抗动脉粥样硬化的形成。低水平的血浆脂联素是糖尿病患者发生心血管疾病的独立危险因子。此外，伴糖尿病性视网膜病变的2型糖尿病患者的血浆脂联素浓度显著低于不伴视网膜病变的2型糖尿病患者，提示脂联素产生的减少也可能参与了糖尿病微血管病变的发生、发展。

总之，脂联素具有降糖、降脂，增加胰岛素敏感性的作用，同时可拮抗动脉粥样硬化的形成，不会使体重增加，在人体内未发现脂联素抵抗的存在，而且脂联素是机体自身产生的蛋白，对人体几乎没有副作用，因此脂联素有可能成为治疗糖尿病的一类新药，国际上正在积极地对其进行研究和开发。研究表明，脂联素具有较长的血浆半衰期，达到2.5-6h。人脂联素共244个氨基酸，从N-端到C-端依次为信号序列(1-18aa)，非螺旋区(19-41aa)，22个胶原重复序列(42-107aa)，C-端球状域(即脂联素球状域，108-244aa)，脂联素球状域(Globular Adiponectin，gAd)为其功能域。有研究者用胰蛋白酶裂解全长的脂联素得到含gAd的片断，其活性远大于全长的脂联素。研究表明，细菌表达的gAd具有很好的生物活性，这为进一步研究和开发脂联素提供了有利的条件。

胰升糖素样肽-1(Glucagons-like Peptide-1，GLP-1)是胰岛α细胞和肠粘膜L细胞分泌的一种激素，胰岛α细胞和肠粘膜L细胞先产生胰升糖素原，进一步经过水解成为具有生物活性的GLP-1(7-37)，其中一部分分子C-端的一个氨基酸被分解，余端被酰胺化为具有生物活性的GLP-1(7-36)酰胺。在体内80％的GLP-1以GLP-1(7-36)酰胺的形式存在，少量以GLP-1(7-37)的形式存在，但两者的生理活性相同。GLP-1的活性域位于N-端，可与胰岛β细胞上的GLP-1受体结合，增加胰岛细胞内腺甘酸环化酶的活性，促进胰岛素的释放，其作用是依赖葡萄糖的，在血糖升高时，静脉输注GLP-1能明显增加胰岛素分泌，随着血糖水平的下降，葡萄糖刺激的消失，GLP-1促进胰岛素分泌的作用变小，继续输注GLP-1血糖不会继续下降。在2型糖尿病患者，饮食诱导的GLP-1分泌受损，引起胰岛β细胞分泌胰岛素的恶化，从而导致2型糖尿病的发生。GLP-1还具有增加肝糖原及肌糖原的合成，促进脂肪酸合成，抑制胰升糖素的分泌，抑制胃肠动力，延缓食物的吸收，抑制胰岛细胞凋亡，促进胰岛细胞增生，抑制食欲，减轻体重，延缓糖尿病的发生等作用。

由于GLP-1具有多种药理作用，正在试用于2型糖尿病的治疗。研究表明输入外源性GLP-1能明显改善2型糖尿病患者空腹及餐后血糖，从而减少胰岛素的用量，甚至停用胰岛素，而且不会发生低血糖，长期输注GLP-1可显著增加2型糖尿病患者胰岛素的1相分泌。GLP-1还可降低甘油三酯水平，增大低密度脂蛋白颗粒体积，改善2型糖尿病伴冠心病患者的内皮功能紊乱，延缓2型糖尿病心血管并发症的发生、发展。尽管GLP-1在治疗2型糖尿病方面具有很多优点，但尚存在难以克服的缺点，GLP-1的体内半衰期很短，静脉输注的半衰期约为5分钟，从而使得GLP-1难以在临床上应用，因此，积极寻找有效的方法延长GLP-1的半衰期具有非常重要的意义。在体内GLP-1主要以两种形式进行清除：酶清除与器官清除。GLP-1在二肽肽酶IV的作用下失去N-端的两个氨基酸残基成为无活性的GLP-1(9～36)酰胺。由于二肽肽酶IV具有高度的底物特异性，改变GLP-1的N-端氨基酸组成可增加GLP-1对二肽肽酶IV的抵抗力。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后获得的GLP-1类似肽(Glucagons-like Peptide-1 Analog，GLP-1-A)，对二肽肽酶IV的抵抗力显著增加，其体外半衰期延长到159分钟，而且和GLP-1(7～37)具有相近的生物活性。但仅有二肽肽酶IV的参与不能解释GLP-1在体内的所有清除机制，GLP-1在体外血浆中的半衰期为20分钟，远远超过许多研究所得出3～11分的体内半衰期。Deacon等以甘氨酸代替GLP-1(7～37)第8位氨基酸丙氨酸后获得的GLP-1-A的体外半衰期显著延长，但体内半衰期并没有得到相应的改善，提示尚有别的机制参与了GLP-1的体内清除。肾脏在这一过程中起着重要的作用，GLP-1是小分子肽，易从肾脏滤过，在肾小管上皮细胞刷状缘有二肽肽酶IV，GLP-1被肾脏滤过后，可被肾小管上皮细胞摄取而分解。大鼠肾脏切除后GLP-1的清除率下降，离体研究表明，肾脏一次可将灌注液中超过80％的GLP-1滤过而清除。因此，寻找有效的方法延缓GLP-1从肾脏的清除对于延长GLP-1的体内半衰期具有重要的意义。研究表明，将GLP-1与其他具有较长血浆半衰期的大分子物质如白蛋白相连接可减少GLP-1从肾脏的清除。

在自然界中，许多多结构域(或多功能域)的蛋白质是由数个多肽链片段拼接在一起形成的，由相对较小的结构域拼装成较大的多功能蛋白是自然进化的一个重要因素。基因重组技术的发展使得人类能把不同基因或基因片段相融合，通过蛋白表达得到不同功能的蛋白拼接在一起形成的新型多结构域的人工融合蛋白，目前这种方法已被应用于许多领域的研究中，并显示出较高的价值。在蛋白融合的过程中，为了最大限度地保持融合蛋白上各个蛋白的空间构象及生物活性，常把不同的蛋白通过空间活动性较大的接头相连，结构简单、不易形成折叠的富含甘氨酸的短肽常用来作为接头。由于脂联素的功能域位于C-端，GLP-1的功能域位于N-端，从而可应用基因重组技术将脂联素的N-端和GLP-1的C-端通过一个空间活动性较大的接头相连，产生一种新的蛋白，该蛋白同时具有脂联素的C-端和GLP-1的N-端，故可具有脂联素和GLP-1的两种功能，新的蛋白由于分子体积增大，不易从肾脏滤过而清除，可克服单一的GLP-1多肽易从肾脏清除、半衰期短的缺点，同时如将GLP-1的第8位氨基酸丙氨酸以甘氨酸代替，则新蛋白的N-端还具有抵抗二肽肽酶IV的能力，可同时消除GLP-1在体内易被清除的两种因素，显著延长GLP-1的体内半衰期。由于gAd的活性大于全长的脂联素，而且细菌表达的gAd具有活性，在该融合蛋白中如进一步以gAd代替全长的脂联素，则可使该融合蛋白表现出更强的脂联素活性。

本发明在国内、外首次运用基因重组技术，构建含人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1融合基因(Globular Adiponectin-glucagon-like Peptide-1 Analog融合基因，gAd-GLP-1-A融合基因)的原核表达载体PET28a-gAd-GLP-1-A，用PET28a-gAd-GLP-1-A转化蛋白表达细菌Escherichia coli BL21(DE3)，经过蛋白诱导表达，发现表达的目的蛋白主要存在于包涵体内，包涵体蛋白经过纯化、复性，获得含6×His tag的gAd-GLP-1-A融合蛋白(6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)，进一步用肠激酶对其切割去除6×His tag获得gAd-GLP-1-A融合蛋白，在该融合蛋白中，gAd的N-端和GLP-1-A的C-端通过一富含甘氨酸的短肽(接头肽)相连接，通过将人GLP-1(7-37)第8位氨基酸丙氨酸突变为甘氨酸获得GLP-1-A，动物研究表明gAd-GLP-1-A融合蛋白具有显著的降低血糖的活性。本发明为进一步分析gAd-GLP-1-A融合蛋白改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌等作用，测定融合蛋白上GLP-1-A的半衰期，获得既能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能改善胰岛素抵抗，可显著纠正2型糖尿病体内代谢紊乱，副作用小的新蛋白，提供前期研究。本研究所获得的新蛋白将有可能取代相当部分的口服降糖药物，且降糖作用会更好、更安全、更符合人体的生理需要，具有极大的社会意义和经济意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合蛋白(Globular Adiponectin-glucagon-like Peptide-1 Analog融合蛋白，gAd-GLP-1-A融合蛋白)，该融合蛋白的氨基酸序列见SEQ.ID NO1，全长共183个氨基酸，1-31氨基酸为人胰升糖素样肽-1类似肽，通过将人胰升糖素样肽-1(7-37)第8位氨基酸丙氨酸突变为甘氨酸而获得，32-46氨基酸为接头肽(富含甘氨酸的短肽)，47-183氨基酸为人联素球状域，模式图见图1。

本发明的目的之二是提供人gAd-GLP-1-A融合蛋白的表达方法，通过以下步骤实现：

1.含6×His tag的gAd-GLP-1-A融合蛋白(6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)的表达

(1)构建含人脂联素球状域-胰升糖素样肽-1类似肽融合基因(Globular Adiponectin-glucagon-like Peptide-1 Analog融合基因，gAd-GLP-1-A融合基因)的原核表达载体PET28a-gAd-GLP-1-A。在gAd-GLP-1-A融合基因的5’端还引入了肠激酶识别序列。

(2)用PET28a-gAd-GLP-1-A转化Escherichia coli BL21(DE3)，加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导后，证实此载体能很好地表达6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，融合蛋白主要存在于包涵体内。

(3)大量表达6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，收集细菌，超声破碎后，离心，保留沉淀(主要为包涵体蛋白)用以进一步纯化融合蛋白，6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的模式图见图1。

2.人gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得：

(1)将包涵体蛋白洗涤并溶解后，用High-Affinity Ni-IDA Resin纯化，获得纯化的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白。

(2)将纯化后的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白在尿素梯度溶液中透析复性。

(3)将复性后的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白与肠激酶孵育，切割去除6×His tag，获得gAd-GLP-1-A融合蛋白。

由于Escherichia coli BL21(DE3)表达的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白主要存在于包涵体内，在本专利中通过蛋白的诱导表达，细菌破碎获得包涵体，进一步对包涵体蛋白进行处理获得gAd-GLP-1-A融合蛋白，这是和以往的专利(ZL 2005 1 0050844.8)不同的地方。

本发明的目的之三是提供人gAd-GLP-1-A融合蛋白在制备治疗2型糖尿病药物中的应用。本发明经动物研究表明该融合蛋白具有显著的降低血糖的活性。

本发明的优点在于：

1.在世界上首次将gAd编码基因和GLP-1-A的编码基因进行融合获得gAd-GLP-1-A融合基因，通过蛋白表达、纯化、复性及肠激酶切割获得gAd-GLP-1-A融合蛋白。

2.在gAd-GLP-1-A融合蛋白中，通过一富含甘氨酸的接头肽连接gAd的N-端和GLP-1-A的C-端，有利于最大限度地保持融合蛋白上各个蛋白的空间构象及生物活性。

5.由于PET28a表达的蛋白在N-端含有6×His tag，我们在gAd-GLP-1-A融合基因中还引入了肠激酶识别序列，即在gAd-GLP-1-A融合蛋白的N-端引入了肠激酶识别序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys，可以通过与肠激酶孵育去除6×His tag，使GLP-1-A的N-端游离出来，而易与其受体结合发挥生物活性。

6.本发明通过两种机制保证获得的gAd-GLP-1-A融合蛋白上的GLP-1-A有长的体内半衰期。一方面在gAd-GLP-1-A融合蛋白中，GLP-1-A是将GLP-1(7-37)第8位氨基酸丙氨酸突变为甘氨酸而获得，该突变可以使GLP-1-A具有显著的抵抗二肽肽酶IV降解的能力；另一方面融合蛋白本身分子体积增大，不易从肾脏滤过而清除，可克服单一的GLP-1多肽易从肾脏清除、半衰期短的缺点。通过接头肽将GLP-1-A与gAd相连接构建融合蛋白以延长GLP-1的体内半衰期在世界上属于首创。

7.用PET28a-gAd-GLP-1-A转化蛋白表达细菌，发现此载体能很好地表达6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，融合蛋白主要存在于包涵体内，表达量大，进一步对包涵体内蛋白进行洗涤、纯化、复性，并经过肠激酶切割去除6×His tag获得gAd-GLP-1-A融合蛋白，动物研究表明该融合蛋白具有显著的降低血糖的活性。具有降糖活性的gAd-GLP-1-A融合蛋白为世界上首次获得。

8.我们将在前期研究的基础上进一步研究gAd-GLP-1-A融合蛋白改善胰岛素抵抗、促进胰岛素分泌的作用，研究其体内半衰期和毒理学作用，如结果能符合预期的目标，将在国内、外首次建立获得具有生物活性的gAd-GLP-1-A融合蛋白的方法，获得既能促进胰岛β细胞分泌胰岛素，又能改善胰岛素抵抗，可显著纠正2型糖尿病体内代谢紊乱，副作用小的新蛋白，具有极大的经济意义和社会意义。

附图说明

图1为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，gAd-GLP-1-A融合蛋白模式图，其中(A)6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，(B)gAd-GLP-1-A融合蛋白。

图2为肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因、gAd编码基因琼脂糖凝胶电泳，其中1.DNA mark；2.肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因；3.gAd。

图3为PET28a-gAd-GLP-1-A酶切结果琼脂糖凝胶电泳，其中M.DNA marker；1.PET28a-gAd-GLP-1-A未酶切；2.BamH I/HindIII酶切结果；3.Xba I/HindIII酶切结果。

图4为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白表达结果12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中M：蛋白marker；1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白；2.IPTG诱导后5h上清蛋白；3.IPTG诱导前菌液；4-9.分别为IPTG诱导1h～6h总蛋白。

图5为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白表达结果12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中M：蛋白marker；1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白；2.IPTG诱导后5h上清蛋白。

图6为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析；其中1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白；2.IPTG诱导后5h上清蛋白。

图7为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白纯化结果12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中M：蛋白marker；1.过柱后的Elution buffer；2.洗涤层析柱后的LEW buffer。

图8为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白肠激酶切割结果12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；其中M：蛋白marker；1.肠激酶切割后；2.肠激酶切割前。

图9为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白肠激酶切割结果Western Blot分析(一抗为抗组氨酸单克隆抗体)；其中1.肠激酶切割前；2.肠激酶切割后。

图10为gAd-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析(一抗为抗-gAd抗体)。

图11为gAd-GLP-1-A融合蛋白Western Blot分析[一抗为抗GLP-1(7-37)抗体]。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。

实施例一

1.材料和仪器

1.1材料

大肠杆菌菌株Escherichia coli DH5α，BL21(DE3)由浙江大学附属第二医院肿瘤研究所提供，原核表达质粒PET28a购自德国Novagen公司，RNA抽提液(Trizol)购自美国Gibcol BRL公司，焦碳酸二乙酯、Oligo(dT)₁₅、UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒均购自上海生工生物工程公司，M-MLV Reverse Transcriptase、RNasin、dNTPs、Taq DNA polymerase、琼脂糖、T₄ DNA连接酶、限制性内切酶Nhe I、BamH I、HindIII、Xba I均购自美国Promega公司，淋巴细胞提取液购自上海恒信化学试剂有限公司，GeneRuler^TM DNA Ladder Mix购自德国Fermentas公司，DNA Marker DL2000、异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside，IPTG)购自日本TaKaRa公司，SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳低分子量标准蛋白质购自上海博亚生物技术有限公司，6×His Monoclonal Antibody(抗组氨酸单克隆抗体)购自美国BD Biosciences公司，辣根酶标记的山羊抗小鼠IgG购自北京中山生物技术有限公司，抗GLP-1(7-37)单克隆抗体及抗gAd单克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自上海申能博彩生物技术有限公司，Western Blotting Luminol Reagent购自美国Santa Cruz公司，聚偏二氟乙烯膜购自美国Bio-Rad公司，QIA quick Gel Extraction kit购自德国QIAGEN公司，High-Affinity Ni-IDA Resin购自Genscript公司，体重18-20g的雄性KM小鼠购自浙江中医药大学实验动物中心。

1.2主要仪器

高速低温离心机(Biofuge 28RS)为德国Heraeus公司产品，细菌恒温摇床(Orbital Shaker)为美国Forma Scientific公司产品，紫外分光光度仪(8453型)购自美国Hewlett Packard公司，GeneAmp PCR system 2400购自美国Perkin Elmer公司，垂直电泳仪(Mini Protean 3 cell)和电转移仪均为美国Bio-Rad公司产品，真空冷冻干燥仪(UVS400A)购自美国Savant Instruments公司，超声波细胞粉碎机(JY88-2型)购自宁波新芝科器研究所，ABI377DNA测序仪购自美国PIERCE公司。

2.引物的设计

根据原核表达载体PET28a和GenBank中公布的人GLP-1(7-37)与gAd的基因序列，设计GLP-1-A与gAd编码基因的引物及插入载体的位置。GLP-1-A编码基因引物：P1：5’-cgc

gacgatgacgataagcat

gaagggaccttt-3’，P2：5’-cgc

tcctcggcctttcacca-3’；gAd编码基因引物：P3：5’-ccc

gcctatgtataccgctca-3’，P4：5’-ccctcagttggtgtcatggta-3。P1将GLP-1(7-37)编码基因第8位氨基酸丙氨酸密码子GCT突变为甘氨酸密码子GGT(加粗斜体表示)，还包括N端肠激酶识别序列(下划线表示，PET28a表达的蛋白N端含有6×His tag，所以引物上设计了肠激酶识别序列，用来去除融合蛋白N端的6×His tag)、Nhe I酶切位点(GCTAGC，加粗表示)，P2，P3含接头序列(斜体表示)及BamH I酶切位点(GGATCC，加粗表示)，P4含Hind III酶切位点(AAGCTT，加粗表示)。接头序列为45个碱基的核苷酸序列5’-tctggttctggttctggttctggttctggttctggttctggatcc-3’，连接GLP-1-A与gAd两个基因，编码15个氨基酸，序列为：N-(丝氨酸-甘氨酸)7-丝氨酸-C。引物由上海生工生物工程公司合成。GLP-1-A编码基因引物序列见SEQ.ID NO2，SEQ.ID NO3，gAd编码基因引物序列见SEQ.ID NO4，SEQ.IDNO5，编码柔性接头肽的核苷酸序列见SEQ.ID NO6。

3.gAd编码基因的RT-PCR扩增

3.1脂肪组织总RNA的抽提

取-80℃保存的人脂肪组织约100mg，在液氮中研成粉末，参考Trizol试剂说明书抽提脂肪组织的总RNA，用紫外分光光度仪测定分析RNA纯度，所有RNA A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.80以上。

3.2逆转录

以mRNA为模板，Oligo(dT)₁₅为引物，经逆转录合成cDNA，反应条件为：取2μg总RNA，1.0μl 10pmol/μl ligo(dT)₁₅，加0.1％DEPC水9μl，总体积10μl，混匀，65℃，变性10min，立即置于冰上，冷却后加入4μl 5×M-MLV Buffer，1μl 25mM dNTPs，0.5μl RNasin，0.5μl M-MLV Reverse Transcriptase，加0.1％DEPC水至20μl，37℃反应1h，所得cDNA用于PCR扩增。

3.3扩增

反应体系：10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl₂ 3μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P₃ 1μl，10μM P₄ 1μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH₂O 36.5μl，总体积50μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火1min，68℃延伸2min，40个循环后68℃延伸7min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(电压80V，电泳30min)。用QIA quick Gel Extraction kit回收目的基因。扩增结果见图2，其中1.DNA mark；2.肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因；3.gAd，gAd编码基因序列见SEQ.IDNO7。

4.肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因的PCR扩增

4.1人类基因组DNA的提取

取人外周静脉5ml抗凝血，分离人外周血有核细胞，用UNIQ-10柱式基因组抽提试剂盒提取人类基因组DNA。

4.2PCR扩增

反应体系为：10×PCR Buffer 5μl，25mM MgCl₂ 3μl，10mM dNTPs 1μl，10μM P₁ 1μl，10μM P₂ 1μl，cDNA 2μl，Taq DNA polymerase(5u/μl)0.5μl，ddH₂O 36.5μl，反应总体积50μl。PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环后72℃延伸5min。扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定(电压80V，电泳30min)。用QIA quick Gel Extraction kit回收目的基因(由于该目的基因同时含有肠激酶识别序列、GLP-1-A、柔性接头肽基因序列，故称为肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因)。扩增结果见图2，肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因序列见SEQ.ID NO8。

5.gAd-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-gAd-GLP-1-A的构建

5.1PET28a-GLP-1-A重组质粒的构建

①酶切与连接：分别将割胶回收的肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因及PET28a质粒用Nhe I和BamH I在37℃的条件下进行酶切反应，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因或PET28a质粒6.5μl，Nhe I 0.5μl，BamH I 0.5μl，反应总体积20μl，反应3h。然后将酶切产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，用QIA quick Gel Extraction kit割胶回收酶切后的目的片段，将回收产物用T4DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系为：ddH₂O 4.5μl，10×buffer 1μl，PET28a酶切回收产物3μl，肠激酶识别序列-GLP-1-A-接头肽融合基因酶切回收产物1μl，T4 DNA连接酶0.5μl，总体积10μl。次日将连接产物转化感受态细菌DH5α，以扩增连接质粒。

②鉴定：挑取几个平板上已经长出的单菌落，分别在含7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)的扩增管中37℃，300rpm振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，用Xba I和BamH I在37℃的条件下双酶切质粒，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer MC 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，Xba I 0.5μl，BamH I 0.5μl，总体积20μl，反应3h，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，观察酶切结果，留取阳性克隆的菌液和质粒，获得PET28a-GLP-1-A重组质粒。

5.2gAd-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-gAd-GLP-1-A的构建

①酶切与连接：分别将构建好的PET28a-GLP-1-A质粒及割胶回收的gAd目的基因用BamH I、HindIII在37℃的条件下进行酶切反应，酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，PET28a-GLP-1-A或gAd目的基因6.5μl，BamH I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，反应3h。然后将酶切产物分别进行1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)，割胶回收酶切后目的片段，回收产物用T4 DNA连接酶4℃连接过夜，连接体系为：ddH₂O 14.5μl，10×buffer 2μl，PET28a-GLP-1-A酶切回收产物2μl，gAd目的基因酶切回收产物1μl，T4 DNA连接酶0.5μl，总体积20μl。次日将连接产物转化感受态细菌DH5α，以扩增连接质粒。

②鉴定：挑取几个平板上已经长出的单菌落，在7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)的扩增管中37℃，300rpm振摇过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，分别用BamH I、HindIII(酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×buffer E 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，BamH I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，37℃反应3h)及Xba I、HindIII(酶切体系为：ddH₂O 10μl，10×bufferB 2μl，BSA(10μg/μl)0.5μl，连接质粒6.5μl，Xba I 0.5μl，HindIII 0.5μl，总体积20μl，37℃反应3h)双酶切质粒，酶切产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳(电压80V，电泳30min)后，出现426bp及683bp的小片断，酶切产物符合预期值，说明gAd-GLP-1-A融合基因已成功插入PET28a的预期酶切位点，获得了gAd-GLP-1-A融合基因及含该融合基因的原核表达载体PET28a-gAd-GLP-1-A。见图3，其中M.DNA marker；1.PET28a-gAd-GLP-1-A未酶切；2.BamH I/HindIII酶切结果；3.Xba I/HindIII酶切结果。经PET通用引物通过ABI377DNA测序仪对PET28a-gAd-GLP-1-A进行测序鉴定，表明各基因的插入方向及顺序完全正确，所测序列和预期完全一致。gAd-GLP-1-A融合基因序列见SEQ.ID NO9，全长共567个bp，1-15bp编码肠激酶识别序列，16-108bp编码人GLP-1-A，序列长93bp，109-153bp编码接头肽，序列长45bp，154-564bp编码gAd，序列长411bp，565-567bp为终止密码子。

6.gAd-GLP-1-A融合蛋白的表达

6.1 6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的表达

用PET28a-gAd-GLP-1-A转化感受态表达细菌BL21(DE3)，次日挑取单菌落于7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇过夜，吸取70μl到7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇2h，使菌液在600nm处吸光度(A₆₀₀)为0.4～0.6，留取诱导前菌液1ml作为对照，剩下菌液中加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导，37℃分别振摇1～6h，分别收集1～6h各时段细菌，将每管细菌量进行调整，直至A₆₀₀基本一致，将收集的菌液以5,000rpm离心10min，弃上清，沉淀用PBS洗涤3次后，以适量PBS重悬，将菌液取10μl加等量的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min，13,000rpm，离心1min后上样，行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后确定目的蛋白是否表达及表达量最大时间段。结果显示，与诱导前的菌液相比，IPTG诱导后在25KD处有较浓的蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致，且IPTG诱导5～6h的蛋白条带最浓，较诱导前均明显增多。取诱导后5h菌液1ml冰浴上超声破碎细菌，分别留取上清及沉淀(包涵体在沉淀内)，将沉淀用与上清等体积的PBS重悬混匀，分别取10μl上清和10μl重悬后的沉淀，加等量的2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃煮沸5min，13,000rpm，离心1min后上样，用12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析目的蛋白在上清和沉淀中的表达情况，结果发现，在25KD处有较浓的蛋白条带，以沉淀的电泳条带为浓，与预期的融合蛋白大小一致，表明表达的融合蛋白主要存在于包涵体内。见图4、图5，在图4中M：蛋白marker，1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白，2.IPTG诱导后5h上清蛋白，3.IPTG诱导前菌液，4-9.分别为IPTG诱导1h～6h总蛋白；图5中M：蛋白marker，1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白，2.IPTG诱导后5h上清蛋白；用抗组氨酸单克隆抗体对产物行Western Blot分析显示上清及沉淀中均有特异性的蛋白表达，以沉淀中融合蛋白表达量大，表明表达的融合蛋白主要存在于包涵体内，参见图6，其中1.IPTG诱导后5h沉淀蛋白，2.IPTG诱导后5h上清蛋白。PET28a-gAd-GLP-1-A表达的蛋白为6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白，其模式图见图1。

6.2gAd-GLP-1-A融合蛋白的获得：

6.2.1 6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的大量表达：挑取鉴定表达的单菌落于7ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇过夜，吸取5ml到500ml LB液体培养基(含卡那霉素80μg/ml)中，37℃振摇2h，调整菌液的A₆₀₀为0.4～0.6，留取诱导前菌液1ml作为对照，剩下菌液中加IPTG 0.4mmol/L诱导，37℃振摇5h，5,000rpm，离心10min收集细菌，PBS洗涤3次后，5,000rpm离心10min收集细菌，用适量PBS重悬，加入溶菌酶，室温放置30min，加入100mg/ml PMSF至终浓度1mg/ml，超声破碎后，14000rpm，离心20min，保留沉淀用以纯化融合蛋白。

6.2.2包涵体蛋白的洗涤及溶解：

将沉淀的包涵体用包涵体洗涤液I(0.5％Triton X-100，50mmol/L Tris·Cl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)匀浆洗涤3次，再用包涵体洗涤液II(2mol/L urea，50mmol/L Tris·Cl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)洗涤2次，每次10min，4℃10000r/min离心15min，收集沉淀，最后用为pH 8.0的50mmol/L Tris·Cl液再洗涤1次，离心后收集沉淀，用含8mol/L尿素的1×Binding Buffer(5mmol/L咪唑，0.5mol/L NaCl，20mmol/L Tris·Cl，pH 8.0)在4℃溶解2h，然后4℃12000g离心15min收集上清，6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白溶解在上清中。

6.2.3 6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的纯化

按照试剂盒说明书进行，将High-Affinity Ni-IDA Resin装入Ni层析柱，用4倍Ni-IDA Resin体积的LEW buffer(50mM sodium dihydrogen phosphate，300mM sodium chloride，pH 8.0)平衡；将前述获得的上清加到Ni层析柱中，流速控制在15ml/小时左右，过柱完成后，6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白结合在Ni层析柱上，用8倍Ni-IDA Resin体积的LEW buffer洗涤层析柱以去除未结合蛋白，流速控制在30ml/小时左右，再用10倍Ni-IDA Resin体积的Elute buffer(50mM sodium dihydrogen phosphate，300mM sodium chloride，250mM imidazole，8M urea，pH 8.0)洗脱结合蛋白(即6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白)，流速控制在15ml/小时左右，收集过柱后的液体，取部分液体行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，发现在过柱后的Elution Buffer中有25KD的蛋白，表明结合在Ni层析柱上的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白被Elution buffer洗脱，得到纯化，结果见图7，其中M：蛋白marker；1 过柱后的Elution buffer，2 洗涤层析柱后的LEW buffe。

6.2.4 6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的透析复性

将纯化后的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的浓度调整为0.5g/L装入透析袋，置于20倍体积的透析复性液(20mmol/L Tris·HCl，1mmol/L EDTA，6mol/L尿素，pH 8.0)中，临用前加入0.2mmol/L氧化型谷胱甘肽，2mmol/L还原型谷胱甘肽，0.6mol/L L-精氨酸，10％甘油中，4℃透析，每隔12h换液1次，按照6，4，2，1mol/L的梯度依次降低尿素的浓度，最后在不含尿素的透析复性液中透析两次，每次12h。用PEG20000浓缩蛋白，蛋白浓度用BCA Protein Assay Kit测定。

6.2.5 6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的肠激酶切割

将复性后的6×His tag-gAd-GLP-1-A融合蛋白的浓度调整为1mg/ml，分别取89μl融合蛋白溶液，重组肠激酶1μl(2U)，10×切割缓冲液(500mmol/L NaCl，200mmol/L Tris·HCl，20mmol/L CaCl₂，pH 7.4)10μl，22℃切割16h去除肠激酶，获得gAd-GLP-1-A融合蛋白，对肠激酶切割结果行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，显示肠激酶切割后获得一分子量大约为22KD的目的蛋白，表明6×His tag被切除，获得gAd-GLP-1-A融合蛋白，结果见图8，其中M：蛋白marker；1.肠激酶切割后；2.肠激酶切割前；用抗组氨酸单克隆抗体对肠激酶切割结果行Western blot分析，结果显示，肠激酶切割后的融合蛋白失去6×His tag的免疫原性，结果见图9，其中1.肠激酶切割前；2.肠激酶切割后。分别应用抗-gAd单克隆抗体及抗GLP-1(7-37)单克隆抗体对蛋白行Western blot分析，显示目的蛋白具有gAd及GLP-1(7-37)的抗原性，结果见图10、图11。人gAd-GLP-1-A融合蛋白的氨基酸序列见SEQ.ID NO1，全长共183个氨基酸，其中1-31氨基酸为GLP-1-A，32-46氨基酸为接头肽(富含甘氨酸的短肽)，47-183氨基酸为gAd，gAd-GLP-1-A融合蛋白的模式图见图1。

7gAd-GLP-1-A融合蛋白降低血糖的作用分析

(1)雄性KM小鼠，分为正常对照组、糖尿病对照组和糖尿病治疗组。

(2)腹腔内注射链脲佐菌素制作糖尿病模型。

(3)糖尿病治疗组小鼠腹腔注射人gAd-GLP-1-A融合蛋白，结果显示人gAd-GLP-1-A融合蛋白具有显著的降低血糖的作用。

具体操作：选择体重18-20g的雄性KM小鼠，适应性喂养1周后，随机分为正常对照组(8只)糖尿病制模组。糖尿病制模组小鼠禁食10小时后，腹腔内注射新鲜配制链脲佐菌素溶液150mg/kg(溶于0.1mmol/L柠檬酸缓冲液中，PH4.2)，注射后72小时，空腹血糖大于200mg/dl者为成模小鼠。将成膜小鼠随机分为糖尿病对照组和糖尿病治疗组，每组8只。各组小鼠空腹过夜后，糖尿病治疗组每只小鼠腹腔注射融合蛋白300μg，正常对照组及糖尿病对照组腹腔注射等量的生理盐水，分别在30min，1h，1.5h，2h，2.5h，3h观察血糖变化。结果显示在各个时间点糖尿病治疗组血糖均低于糖尿病对照组，而在注射后2h，2.5h，3h有显著性差异，表明gAd-GLP-1-A融合蛋白具有显著的降糖活性，结果见表1。

表1gAd-GLP-1-A融合蛋白降糖活性分析(均数±标准差)

^a与正常对照组相比P＜0.01；^b与正常对照组相比P＜0.05；^c与糖尿病对照组相比P＜0.05；^d与糖尿病对照组相比P＜0.01