CN104098702A - 一种利用mfh融合蛋白制备glp-1多肽或其类似物方法和应用 - Google Patents

一种利用mfh融合蛋白制备glp-1多肽或其类似物方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用，属于生物技术领域。GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的结构式为MFH-DP-H6-E7-PEP，其中，MFH为蛋白融合载体；DP为甲酸水解位点；H6为组氨酸标签；E7为专一性蛋白酶切位点；PEP为GLP-1多肽或其类似物。将编码DP-H6-E7-PEP的DNA连接到pMFH质粒上再转入大肠杆菌，通过原核表达得到MFH-DP-H6-E7-PEP融合蛋白，利用甲酸水解、专一性蛋白酶水解和亲和层析得到GLP-1多肽或其类似物。本发明达到了多肽大规模高效表达、多肽释放工艺步骤少、条件温和、生产成本低的目的，适合工业化生产。

Description

一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及重组多肽的制备，具体涉及一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用。
背景技术
多肽是一类重要的生物分子，由小于80个氨基酸连接起来、呈一定空间结构的一类化合物。多肽参与生物体内各种细胞的生化反应过程，是人体最重要的功能调节剂之一。作为生物体内各种细胞功能的生物活性物质，多肽涉及到激素、神经、细胞生长和生殖等各个领域。与小分子化学药相比，多肽类药物往往更为安全、副作用更小，很少引起严重的免疫反应。多肽类物质分子结构小、易改造、易合成，已广泛应用于医药、食品、保健品、化妆品、生物材料、生物农药等众多领域，其中在医药行业应用领域主要包括多肽疫苗、多肽诊断试剂、多肽芯片、多肽药物等产品。随着化学和生命科学的进步，近年来多肽类药物的研发和上市出现了逐步加速的趋势。多肽类药物主要用于治疗癌症、代谢类疾病、心血管疾病和传染性疾病，内分泌类疾病、血液病和疼痛缓解等众多方向也都可应用多肽类药物。
多肽药物的制备目前主要有化学合成、基因重组和从动植物组织细胞中提取三种方法。化学合成法中的固相多肽合成技术免去了液相多肽合成法过程中的纯化步骤，便于自动化操作，对多肽药物的规模发展起到了极大地推进作用。但是，对长度大于30个氨基酸的多肽，化学合成法有一定的困难，主要是产率低和成本高。在化学合成多肽药物快速成长之际，基因重组表达制备多肽药物也引起业内关注。与化学合成相比，基因重组方式更适于长肽的制备；而且随着技术的进步，以基因重组方式生产多肽药物的成本也在不断降低。化学合成和基因重组表达将在很长一段时间内成为互为补充的多肽药物生产方式。
重组生产多肽拥有化学合成许多优点，包括产量高，成本低，易于规模化和减少对环境的污染。常用于重组多肽表达的宿主细胞有大肠杆菌、枯草杆菌和酵母菌等。由于在细胞内多肽的稳定性差，直接表达通常导致低收率，事实上表达在宿主细胞中的肽被内源性蛋白酶很快降解，由宿主细胞同化。为了克服这个问题，多肽通常以融合蛋白的形式表达。作为融合蛋白的一部分，肽可被定向到特定的细胞区室或以包涵体形式实现高产量表达和避免被细胞蛋白酶降解。
用于多肽表达的融合载体已有许多已经商业化。例如GE公司的GST融合蛋白，NEB公司的MBP融合蛋白等为较大融合蛋白载体，Novagen公司的KSI为较小的融合蛋白，都已经商品化，在多肽制备方面的逐渐得到广泛应用。另外，GB1(US8221998)和MFH(US7390639)等较小的融合蛋白更具有产率高的优点。因此，裂解融合蛋白，有效释放多肽为重组多肽生产的一个重要关键技术。利用目前的化学裂解、蛋白酶水解融合蛋白小规模制备多肽(小于20毫克)较成功。但直接用于工业化生产临床需求多肽产品，仍不成功，如化学裂解法释放方法，易产生杂质多肽，严重影响后续纯化过程，而且，专一性较好的化学试剂溴化氰具有剧毒，工艺条件要求高，不适合工业化应用。酶法水解要求融合蛋白水溶性高，融合蛋白多是包涵体，无法直接溶于蛋白酶水解缓冲液。而且酶法水解需要专一的氨基酸序列。酶法水解工业化生产所需蛋白酶酶用量大，直接影响生产成本。目前广泛使用的专一性蛋白酶，如凝血酶、肠激酶、Factor Xa来源单一，生产条件苛刻，产量低，无法满足工业化应用。虽然TEV蛋白酶可以大规模发酵制备，但同许多蛋白酶一样，水解产物仍然残留多余氨基酸。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种利用MFH融合蛋白制备GLP-1多肽或其类似物方法和应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其结构式为：MFH-DP-H6-E7-PEP。其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L-天冬氨酸-L-脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L-组氨酸1-L-组氨酸2-L-组氨酸3-组氨酸4-L-组氨酸5-L-组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为：L-谷氨酸1-L-天冬氨酸2-L-亮氨酸3-L-酪氨酸4-L-苯丙氨酸5-L-谷氨酰胺6-L-X，X为除脯氨酸以外的任意L-型氨基酸；PEP：为GLP-1多肽或其类似物，GLP-1多肽氨基酸序列见图1B及SEQ ID NO.1，GLP-1的类似物为R34，即GLP-1的第34位赖氨酸置换成精氨酸，其氨基酸序列见图2B及SEQ ID NO.2。
本发明在融合蛋白载体MFH与目标多肽PEP之间以甲酸水解、亲和层析标签和蛋白酶氨基酸序列连接(DP-H6-E7)，整合了“融合蛋白甲酸水解、蛋白酶水解和亲和层析”优点，避免融合蛋白单一释放多肽工艺中融合蛋白不溶和多杂质的缺点。甲酸水解位点(DP)直接连接与融合蛋白载体之后，有利于多肽释放，释放的多肽易于溶于缓冲液，有利于后期蛋白酶水解工艺。
上述GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法为采用pMFH质粒在宿主菌中表达，具体包括如下步骤：
(1)将编码DP-H6-E7-PEP的DNA序列连接到pMFH质粒上构建GLP-1多肽或其类似物的原核表达质粒pMFH-PEP。
(2)将pMFH-PEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌。
(3)融合蛋白表达：将表达MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小时以上，融合蛋白表达在包涵体中。
其中，诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法优选为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于LB中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG，终浓度为0.6～3mM，继续发酵10～12小时。
诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法优选为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养8～16小时。发酵培养基为：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸1g/L、硫酸镁0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去离子水配制初始pH6.5～8.0；微量元素溶液为：硫酸亚铁3.2g/L、氯化亚锰1g/L、硝酸钴1.5g/L、氯化钙1g/L、氯化铜0.05～0.5g/L、硫酸锌0.4g/L、硼酸0.3g/L和钼酸钠0.8～4.2g/L溶于1mol/L盐酸中。诱导前补液为：葡萄糖300g/L、硫酸镁12g/L、氯化铵45g/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制；诱导后补料液为：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。
所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化具体包括如下步骤：
(1)离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液。
(2)往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀2～8小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液。
(3)往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇第二次沉淀8～12小时，离心弃上清液，沉淀为纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。
更优选的，所述的乙醇沉淀纯化包括如下步骤：
(1)5000～6000转/分离心15～30min收集诱导表达的菌体，用含6M尿素的PBS重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破碎细胞，细胞破碎液经12000转/分离心20～30分钟，获取总蛋白上清液。
(2)往总蛋白上清液中加入等体积乙醇于-20℃沉淀2～8小时，12000转/分离心20～30分钟，弃沉淀获取一次乙醇上清液。
(3)往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇于-20℃第二次沉淀8～12小时，12000转/分离心20～30分钟，弃上清液，沉淀为纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。
一种制备GLP-1多肽或其类似物的方法为利用甲酸和蛋白酶水解上述GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，具体包括如下步骤：
(1)将纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白溶解于50～60％甲酸溶液，45～50℃保温36～56小时至水解完全。
(2)旋蒸浓缩甲酸水解液，调pH值至7.5～8.0，加入尿素、咪唑和PBS使体系为含6M尿素和5mM咪唑的pH7.5～8.0的1×PBS溶液，离心去沉淀，上清液含带组氨酸标签的多肽P-H6-E7-PEP。
(3)上清液用Ni-NTA亲和层析纯化，用含6M尿素的磷酸缓冲液洗涤3-5次，再用不含尿素的磷酸缓冲液洗涤3-5次，最后用含150mM咪唑的磷酸缓冲液洗脱。
(4)往洗脱液中加E7蛋白酶水解3～8小时，蛋白酶水解液用磷酸缓冲液透析8～12小时，直接上样Ni-NTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液。所述的E7蛋白酶优选为如SEQ ID NO.3所示的Tev蛋白酶或该Tev蛋白酶变种S219A、G148L或L33A，E7蛋白酶带组氨酸标签；E7蛋白酶的加入量优选为0.5mg E7/mg多肽。
(5)调节多肽盐酸液pH值至3.5以下，SepPak C18反相树酯层析柱用含2％醋酸或甲酸的10％乙腈溶液预处理；酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SepPak C18反相树酯层析柱，用含2％醋酸或甲酸的10％乙腈溶液洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的3～5倍；用含50％的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2～3倍；洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，得到初纯化的目的多肽。
或将纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白用Tris-HCl溶液稀释溶解后，直接用E7蛋白酶水解制备GLP-1多肽或其类似物。
通过上述方法得到初纯化的GLP-1多肽或其类似物纯度在90％以上，再利用C18反相层析柱对多肽产品进行精制可以得到纯度为99％以上GLP-1多肽或其类似物。利用C18反相层析柱对多肽产品进行精制的方法优选为：初纯化的GLP-1多肽或其类似物用含2％醋酸或甲酸的10％乙腈溶液溶解和过滤，C18反相层析柱用含2％醋酸或甲酸的10％乙腈溶液预处理；肽溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用10～70％线性梯度洗脱，收集目标多肽组分，旋蒸浓缩，冻干。
GLP-1及其类似物能与GLP-1受体结合，促进胰岛素的分泌，具有治疗2-型糖尿病的功效，不会对病人产生毒副作用。
通过上述方法，每100克MHF-DP-H6-E7-GLP-1融合蛋白可制得10～13克纯度为99％以上的GLP-1多肽产品；GLP-1多肽可用于制备临床上治疗2-型糖尿病多肽药物制剂。
每100克MHF-DP-H6-E7-R34融合蛋白可制得11～14克纯度为99％以上的R34多肽产品；R34为临床上治疗2-型糖尿病多肽药物制剂利拉鲁肽前体多肽。
将MHF-DP-H6-E7-R34融合蛋白用甲酸水解得到的P-H6-E7-R34可以直接进行脂化修饰，然后用E7蛋白酶水解除去组氨酸标签，经SepPak C18反相树酯层析柱初纯化和C18反相层析柱精制后生成利拉鲁肽。每100克MHF-DP-H6-E7-R34融合蛋白可制得9～11克纯度为99％以上的利拉鲁肽。动物模型研究表明，本发明提供的利拉鲁肽具有治疗糖尿病的效果。
本发明创造了一种整合“融合蛋白甲酸水解、专一性蛋白酶水解和亲和层析”多肽释放方法，达到了多肽大规模高效表达、多肽释放工艺步骤少、较低生产成本的目的。
与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：
(1)现有融合蛋白水解需要使用溴化氰，虽然溴化氰专一性强，但具有剧毒，不适合工业化生产管理，本发明有机结合甲酸水解和专一性蛋白酶水解，条件温和，适合工业化生产。
(2)本发明提供的利用融合蛋白方法制备多肽方法纯化步骤简单。
(3)本发明提供的工艺方法多肽产品回收率高。
(4)本发明提供的方法过程中，中间体可以进行化学修饰，不影响蛋白酶水解工艺和产品纯化。
附图说明
图1是用于MFH-DP-H6-E7-GLP-1融合蛋白表达的质粒pMFH-GLP-1图谱(A)和GLP-1氨基酸序列(B)。
图2是用于MFH-DP-H6-E7-R34融合蛋白表达的质粒pMFH-R34质粒图谱(A)和R34氨基酸序列(B)。
图3是DP-H6-E7-GLP-1的DNA序列。
图4是DP-H6-E7-R34的DNA序列。
图5是重组菌IPTG诱导浓度对融合蛋白(MFH-DP-H6-E7-GLP-1)表达的影响。M：蛋白质分子量标准，1：空载体，2：无载体细胞；3～8：样品的IPTG浓度依次为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM、1.0mM和1.2mM。
图6是重组菌IPTG诱导时间对融合蛋白(MFH-DP-H6-E7-GLP-1)表达的影响。M：蛋白质分子量标准，1：空载体，2：无载体细胞；3～9：样品的诱导时间依次为1h、2h、3h、4h、5h、6h和8h。
图7是重组菌乳糖诱导融合蛋白(MFH-DP-H6-E7-R34)表达。M：蛋白质分子量标准，1：空载体，2：无载体细胞；3～6：发酵8、10、12、16小时的样品。
图8是SDS-PAGE胶分析乙醇沉淀纯化融合蛋白。M：蛋白质分子量标准。1：第一次乙醇沉淀，2：第二次乙醇沉淀，3：第二次乙醇沉淀后上清液。
图9是融合蛋白MFH-DP-H6-GLP-1部分甲酸水解分析。
图10融合蛋白MFH-DP-H6-E7-R34甲酸水解时间进程分析。1：分子量标准；2～10：为融合蛋白甲酸水解6、12、18、24、30、36、42、50和56小时的样品。
图11是HPLC纯化GLP-1色谱图，箭头之间所指部分为收集样品。
图12是HPLC纯化R34色谱图，箭头之间所指部分为收集样品。
图13是融合蛋白MFH-DP-H6-E7-R34经复性后可以经E7蛋白酶水解直接制备R34多肽。从左到右：分子量标准，融合蛋白E7酶水解0、30分钟、1小时、2小时、3小时的样品。
图14是制备利拉鲁肽的工艺过程图。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1和MFH-DP-H6-E7-R34载体构建和表达
选用大肠杆菌偏爱的密码子设计引物，采用重叠延伸PCR方法，以质粒pCMFH-GLP模板(HJ Li，CX Zhou and JZ Su,Chemical ligation and cleavage on solid support facilitaterecombinant peptide purification。Protein Expression and Purification50,238–246,2006)，分别扩增和构建出编码DP-H6-E7-GLP-1和DP-H6-E7-R34融合蛋白的DNA序列，然后，二个GLP-1衍生物肽的DNA序列经EcoR I和BamH I双酶切后，插入预先用EcoR I和BamH I双酶切的高效表达载体pMFH-MCS(HJ Li，CX Zhou and JZ Su,Protein Expression andPurification50,238–246,2006)中，构建成GLP-1和其衍生物肽的原核表达重组质粒：pMFH-GLP-1(图1)和pMFH-R34(图2)，再把重组质粒分别转入表达菌大肠杆菌BL21(DE3)中得到表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1和MFH-DP-H6-E7-R34的工程菌。
DP-H6-E7-GLP-1的DNA序列如图3及SEQ ID NO.4所示。用于扩增DP-H6-E7-GLP-1的PCR引物为：正向引物1：5’-GCG GAA TTC GAC CCG GGC CAT CAC CAT CAC CAT CACGAA AAC CTG TAC-3’，正向引物2：5’-CAT CAC GAA AAC CTG TAC TTC CAG CAC GCTGAA GGT ACC TTC-3’；反向引物为通用引物pTrc反向引物(GE公司)。PCR反应体系：10×PCR缓冲液：5μL，质粒模板：50pg，正向引物1：1.0μM，正向引物2：1.0μM，反向引物：2.0μM，dNTP混合物：0.25mM/种，pfu DNA聚合酶：1.5单位，反应体积：50μL。PCR反应条件为：(1)95℃5分钟，1个循环；(2)95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；(3)72℃10分钟，1个循环。
DP-H6-E7-R34的DNA序列如图4及SEQ ID NO.5所示。用于扩增DP-H6-E7-R34的PCR引物为：正向引物1：5’-GCG GAA TTC GAC CCG GGC CAT CAC CAT CAC CAT CAC GAAAAC CTG TAC-3’，正向引物2：5’-CAT CAC GAA AAC CTG TAC TTC CAG CAC GCT GAAGGT ACC TTC-3’；反向引物为：5’-CGC GGA TCC TTA GCC ACG ACC ACG AAC CAG CCAAGC GAT AAA-3’。PCR反应体系：10×PCR缓冲液：5μL，质粒模板：50pg，正向引物1：1.0μM，正向引物2：1.0μM，反向引物：2.0μM，dNTP混合物：0.25mM/种，pfu DNA聚合酶：1.5单位，反应体积：50μL。PCR反应条件为：(1)95℃5分钟，1个循环；(2)95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒，30个循环；(3)72℃10分钟，1个循环。
采用化转法进行质粒转化。首先取1微升质粒加入到50微升DH5α感受态细胞中，将混合物置于冰上30分钟。30分钟后将混合物取出，在42℃水浴90秒，中途勿摇动试管。水浴后将混合物放置在冰上1～2分钟，取2个EP管(37℃水浴预热SOC培养基)，将800微升SOC加入到这2个EP管中，然后转置摇床在37℃下以200rpm转速摇45分钟。45分钟后涂布平板，标记后放到37℃的培养箱中保存。
将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1、MFH-DP-H6-E7-R34的工程菌进行活化，依次制备一级种子和二级种子；将二级种子接种于发酵培养基中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG，终浓度为0.6～3mM，继续发酵10～12小时。一级种子和二级种子培养基和发酵培养基均为LB培养基，其组成如下：酵母浸出膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/mL，初始pH7.5。
融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1、MFH-DP-H6-E7-R34在BL21中经IPTG诱导，大量表达于包涵体中。通过实验确定：37℃，0.8mM IPTG诱导表达6小时为工程菌的最佳发酵条件，在此条件下诱导表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的35～45％(图5～6)。
实施例2利用乳糖诱导工程菌生产融合蛋白的发酵方法
本发明还确定利用乳糖作为诱导剂诱导融合蛋白的表达。因为乳糖自身不能诱导Lac启动子的启动，它需要经过β-半乳糖苷酶的作用转化为异乳糖后才起诱导剂的作用。本发明通过种子培养和设计发酵培养基的条件，使得工程菌能表达出目的融合蛋白。具体步骤如下：
(1)将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1、MFH-DP-H6-E7-R34的BL21从平板上挑取单菌落至5毫升(含氨苄)LB培养基，200转/分、37℃，摇瓶培养12～16小时。LB培养基的组成如下：酵母浸膏5g/L、酪蛋白水解物10g/L、氯化钠10g/L，初始pH6.5～8.0。
(2)培养后取1毫升菌液，加到50毫升(含氨苄)LB培养基中，200转/分、37℃，摇瓶培养6～8小时。
(3)将培养后的50mL(含氨苄)LB培养基添加到50升(含氨苄)新鲜发酵培养基中，37℃，200转/分摇瓶培养。
(4)当OD600达到1.0左右时，添加40毫升诱导前补液到发酵培养基。诱导前补液组成为：葡萄糖300g/L、硫酸镁12g/L、氯化铵45g/L，用去离子水配制。
发酵培养基组成：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸1g/L、硫酸镁0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去离子水配制，氨苄青霉素100μg/mL，初始pH6.5～8.0。
微量元素溶液的组成：硫酸亚铁3.2g/L、氯化亚锰1g/L、硝酸钴1.5g/L、氯化钙1g/L、氯化铜0.05～0.5g/L、硫酸锌0.4g/L、硼酸0.3g/L和钼酸钠0.8～4.2g/L溶于1mol/L盐酸中，微量元素溶液过滤除菌。
(5)1小时后，将40毫升乳糖诱导液全部倒入发酵培养基，加完后立刻将40毫升乳糖后补料液全部倒入发酵培养基。所述的乳糖诱导液的组成为：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。诱导后补料液的组成为：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。
(8)继续发酵培养8～16小时。最后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过观察条带强度来确定目的蛋白的含量(图7)。如图7所示，在此条件下诱导表达的融合蛋白约占菌体总蛋白的35％以上。
实施例3融合蛋白乙醇沉淀纯化
本发明确认利用乙醇沉淀法可以有效地纯化融合蛋白。将上述通过乳糖诱导融合蛋白表达的菌体5000～6000转/分离心15～30min收集，室温下利用PBS(含6M尿素)重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破碎细胞，细胞破碎液经12000转/分离心20～30分钟，获取总蛋白上清液，上清液经乙醇沉淀2～8小时(1:1体积比；-20℃)，12000转/分高速离心去沉淀(-20℃)，二次上清液再经乙醇沉淀8～12小时(1:1体积比；-20℃)。12000转/分离心收集沉淀，二次离心沉淀既为融合蛋白，纯度在85％以上，产率为300克菌体制得100克融合蛋白沉淀(图8)。
实施例4Tev蛋白酶变种和特性
本发明提供通过改良TEV Protease(TEV蛋白酶)活性中心及周围氨基酸变化，以拓扩该蛋白酶对底物识别序列，尤其是扩展蛋白酶对底物P1’和P2’位点识别能力和酶切效率。
TEV Protease(TEV蛋白酶)是来源于烟草蚀纹病毒(TEV)的Nla蛋白酶27kDa的蛋白酶活性结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，经过设计后的蛋白酶与天然TEV蛋白酶相比其稳定性更好，可用大肠杆菌以MBP融合蛋白进行表达(Kapust,R.B.and Waugh,D.S.1999，Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility ofpolypeptides to which it is fused.Protein Sci.8:1668-1674)，表达过程中，Tev蛋白酶可以自我专一性剪切，除去MBP融合载体。此蛋白酶被用来切除纯化后融合蛋白的亲和标签。TEV蛋白酶具有很强的位点特异性，能够识别EXXYXQ(G/S)七氨基酸序列，最常用序列的是Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly(或ENLYFQG)，其切割位点在谷氨酰胺和甘氨酸或丝氨酸之间(即P1和P1’之间)。在pH7.0、30℃时可达到最佳活性，但在pH5.5-8.5和4-30℃的广泛范围内TEV蛋白酶皆有活性，因此，可根据目的蛋白的性质选择反应条件。由于重组Tev蛋白酶自身带有组氨酸标签，切割后也很容易利用其N端的亲和标签将TEV蛋白酶清除，也可以从固定在树脂上的融合蛋白切除掉目的蛋白。
本发明通过随机PCR方法，改变TEV蛋白酶(WT，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)活性中心周围氨基酸性质，通过筛选，获取对底物P1’氨基酸序列识别广谱的蛋白酶变种。如表2所示，G147L和L32A蛋白酶变种对P1’的识别氨基酸显著拓宽，除脯氨酸(P)外，对其他氨基酸的效率都在85％以上。
本发明制备GLP-1和R34多肽所用的E7蛋白酶为表1中任一种Tev蛋白酶。本发明筛选的E7蛋白酶可用于其他重组多肽和蛋白的制备。
表1几种蛋白酶变种对P1’氨基酸的识别能力和酶切效率(以P1’为对照)
P1’ G S A M C N H Y K D Q F T W R L E I V P
WT 100 100 100 90 85 84 80 75 72 70 68 68 65 62 60 58 58 56 45 0
S219A 100 100 100 91 85 91 90 89 85 86 87 86 87 62 60 58 60 56 55 0
G148L 100 100 100 99 97 96 95 92 93 91 96 95 98 89 91 90 87 88 86 0
L33A 100 100 100 99 97 95 96 93 95 92 93 94 96 88 87 88 85 88 85 0
注：WT为TEV Protease；S219A为WT的第219个氨基酸由丝氨酸(S)突变为丙氨酸(A)；G148L：为WT的第148个氨基酸由甘氨酸(G)突变为亮氨酸(L)；L33A：为WT的第33个氨基酸由亮氨酸(L)突变为丙氨酸(A)。
实施例5GLP-1和GLP-1变种(R34)制备
将实施例3乙醇沉淀纯化的融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1溶入终浓度为50～70％(v/v)的甲酸(50克融合蛋白溶入250毫升浓度为60％甲酸中)，在45～50℃水浴避光水解24小时，水解完成后用旋转蒸发仪抽去绝大部分甲酸，取少量部分水解后的蛋白混合物跑Tricine-SDS-PAGE电泳，如图9所示，融合蛋白MFH-DP-H6-E7-GLP-1有较高的水解效率，24小时内水解效率可达75％。45℃水浴避光水解继续水解到48小时，水解效率达98％(图10)，经质谱检查验证水解完全。甲酸水解液经过旋蒸浓缩至80毫升，先用固体NaOH调节溶液pH值至6.0～6.5，再用NaOH溶液调节溶液pH值至7.5～8.0之间，添加尿素使其在200毫升的体系中的终浓度为6M，再添加20毫升10×PBS缓冲液(既磷酸缓冲液，pH8.0)母液，再添加0.5毫升2M咪唑母液，加水至终体积到200毫升，检查pH值在7.0～8.5范围，离心去除沉淀。上清液主要成分为P-H6-E7-GLP-1多肽。
上清液直接用于Ni-NTA亲和层析纯化。上清液上样到Ni-NTA亲和层析柱，用含6M尿素的磷酸缓冲液(pH8.0)洗涤3～5次，用SDS-PAGE方法检测不含杂质。然后用不含尿素的磷酸缓冲液(pH8.0)洗涤3～5次除去尿素。最后用含150mM咪唑的磷酸缓冲液(pH8.0)洗脱，洗脱体积为柱体积的4～5倍。
洗脱液直接用E7蛋白酶水解。在洗脱液中加入E7蛋白酶(L33A)，加入量为：0.5mg E7/mg多肽。室温放置8小时，随后蛋白酶水解液利用磷酸缓冲液透析12小时，直接上样Ni-NTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液，主要成分为GLP-1多肽。
多肽盐溶液利用SepPak C18反相树酯层析柱除去盐类杂质，同时对GLP-1多肽样品进行初步纯化。利用醋酸、甲酸或盐酸调节多肽盐溶液pH值至3.5以下，SepPak C18反相树酯层析柱预先用10％的乙腈溶液(含2％醋酸或甲酸)预处理。酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SepPak C18反相树酯层析柱，用10％的乙腈溶液(含2％醋酸或甲酸)洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的3～5倍。用含50％的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2～3倍。含GLP-1样品洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，经质谱仪分析检测纯度为90％以上。
初步纯化的GLP-1多肽样品可以用HPLC进一步纯化。初步纯化的多肽样品用10％的乙腈溶液(含2％醋酸或甲酸)溶解和过滤。C18反相层析柱用10％的乙腈溶液(含2％醋酸或甲酸)预处理。多肽样品溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用10～70％乙腈线性梯度洗脱60分钟，收集主峰(图11)，即目标多肽GLP-1组分，旋蒸浓缩，冻干，经质谱仪分析检测纯度为99％以上。
每100克MHF-DP-H6-E7-GLP1融合蛋白经上述纯化工艺可制得10～13克纯度为99％以上的多肽产品。
上述工艺过程也同样适用于GLP-1多肽变种K34R(定义为R34)的生产。R34为临床上治疗2-型糖尿病多肽药物制剂利拉鲁肽前体多肽，为GLP-1的第34位赖氨酸置换成精氨酸。经本发明所述纯化工艺，每100克MHF-DP-H6-E7-R34融合蛋白可制得11～14克纯度为99％以上的R34多肽产品(图12)。R34多肽可以直接用于制备利拉鲁肽。
另一方面，本发明也确认融合蛋白经50mM Tris-HCl溶液(pH8.0)稀释溶解后，可以直接用E7蛋白酶水解制备GLP-1多肽和R34多肽(图13)。
实施例6GLP-1和R34对胰高血糖素样多肽-1受体的活化作用
当前发明使用由Montrose-Rafizadeh等人描述的方法(Montrose-Rafizadeh,C.,Yang,H.,Rodgers,B.D.，Beday,A.,Pritchette,L.A.,&Eng,J.High potency antagonists of the pancreaticglucagon-like peptide-1receptor.J.Biol.Chem.272，21201-21206.1997.)测定GLP-1和类似物R34与CHO/GLP-1R细胞的胰高血糖素样多肽-1受体结合生成cAMP的能力。在实验之前，当CHO/GLP-1R细胞培养至密度为60-70％时，以磷酸盐缓冲液洗涤了三次。加1毫升含有0.1％BSA的磷酸盐缓冲液，置湿润空气孵化器中于37℃培养2小时。然后加1毫升含有0.1％BSA和IBMX(1毫摩尔浓度)的磷酸盐缓冲液后继续培养，并加入胰高血糖素样多肽-1和类似物。空白样以磷酸盐缓冲液代替，阳性对照使用从Sigma公司购买的标准GLP-1样品。30分钟后，以冰冷磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次停止反应。用1毫升冰冷高氯酸溶液(0.6摩尔浓度)处理5分钟，提取细胞中的cAMP。用碳酸钾(5摩尔浓度，84微升)调整样品的酸碱度至7，短暂振荡样品管，并且离心去沉淀物(5分钟，2000×g，4℃)。上清液经真空干燥后溶于0.05摩尔浓度含4毫摩尔浓度EDTA的Tris盐缓冲液(酸碱度7.5)。加入碳酸钠(0.15微摩尔浓度)和硫酸锌(0.15微摩尔浓度)于样品，然后放置于冰上15分钟。离心去盐沉淀物(5分钟，2000×g，4℃)。促细胞生产cAMP的活性是评价GLP-1肽的效价的一项重要指标，使用[3H]cAMP竞争约束分析用试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)测定样品。IC50和EC50值列表2，结果表明本发明所制备的GLP-1和R34多肽与标准品的质量一致，与GLP-1受体的结合能力相同(IC50)，也具有同样的刺激细胞产生cAMP活性(EC50)。
表2胰高血糖素样多肽-1及类似物R34与GLP-1受体结合力和cAMP分析
序列号 多肽 结合能力IC50(nM) cAMP生成EC50(nM)
1 GLP-1(标准) 2.3±0.6 3.1±0.8
2 GLP-1 2.2±0.6 3.2±0.8
3 R34 2.3±0.8 3.0±0.7
实施例7R34多肽脂化修饰
R34多肽脂化修饰采用固相合成方法实施。如图14所示，首先使用PerSeptive肽自动合成仪采用F-moc化学固相法按标准固相肽合成方法制备N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂，固相载体为聚乙烯甘醇多苯乙烯树脂(500μmol)，起始氨基酸为侧链经保护的谷氨酸(600μmol)，使用2-(苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU，2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate)和1-羟基苯并三氮唑(1-hydroxybenzotriazole)为连接剂(使用量为起始物的1.1倍)，与600μmol十六脂肪酸进行羧胺缩合反应，缩合完毕后，使用哌啶二甲基甲酰胺为去保护剂进行去保护，生成N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂。
将5克P-H6-Tev-R34溶于二氯甲烷，采用与上述羧胺缩合反应相同条件，与N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂中的侧链羧基进行羧胺缩合反应，生成P-H6-Tev-R34-N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂。用二氯甲烷洗涤上述树脂，除去催化剂和其他杂质。
上述树脂悬浮于200毫升PBS缓冲液(pH8.0，含2mM DTT和1mM EDTA)，添加200毫升E7蛋白酶母液(1mg/mL)，置于25℃，连续轻度搅拌16小时以上，至到组氨酸标签全部除去。离心回收R34-N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂，其可以直接进行脂化修饰。
R34-N-ε-(γ-Glu(N-α-十六脂肪酸))-树脂悬于90％TFA，5％硫代苯甲醚，3％苯甲醚和2％乙二硫醇进行去树脂裂解，得到利拉鲁肽粗品。利拉鲁肽粗品经SepPak C18反相树酯层析柱初纯化，再使用C18-HPLC反相疏水层析纯化，流动相为含0.1％三氟乙酸的乙腈梯度(10～75％)纯化的样品。经HPLC分析柱鉴定，产物多肽的纯度大于95％。100克P-H6-E7-R34融合蛋白可制得9～11克纯度为95％以上的利拉鲁肽。动物模型研究表明，本发明提供的利拉鲁肽具有治疗糖尿病的效果。

Claims (10)

1.一种GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白，其特征在于结构式为：MFH-DP-H6-E7-PEP；其中，MFH为蛋白融合载体；DP为L-天冬氨酸-L-脯氨酸序列；H6为组氨酸标签，序列为L-组氨酸1-L-组氨酸2-L-组氨酸3-组氨酸4-L-组氨酸5-L-组氨酸6；E7为专一性蛋白酶切位点，其序列为：L-谷氨酸1-L-天冬氨酸2-L-亮氨酸3-L-酪氨酸4-L-苯丙氨酸5-L-谷氨酰胺6-L-X，X为除脯氨酸以外的任意L-型氨基酸；PEP为GLP-1多肽或其类似物，GLP-1的类似物包括R34，GLP-1多肽和R34的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1和2所示。
2.权利要求1所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将编码DP-H6-E7-PEP的DNA序列连接到pMFH质粒上构建GLP-1多肽或其类似物的原核表达质粒pMFH-PEP；
（2）将pMFH-PEP质粒转化到大肠杆菌BL21中得到表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌；
（3）融合蛋白表达：将表达MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌培养至菌液OD600达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG或乳糖继续发酵6小时以上，融合蛋白表达在包涵体中。
3.根据权利要求2所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于：
诱导剂为IPTG时，融合蛋白表达的方法为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于LB中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，添加诱导剂IPTG，终浓度为0.6～3mM，继续发酵10～12小时； 
诱导剂为乳糖时，融合蛋白表达的方法为：将表达融合蛋白MFH-DP-H6-E7-PEP的工程菌接种于发酵培养基中，37℃培养到OD600值达到0.9～1.0时，加入诱导前补液；1小时后，先后再加入乳糖诱导液、乳糖后补料液，继续发酵培养8～16小时；发酵培养基为：葡萄糖5g/L、酵母浸膏15g/L、酪蛋白水解物20g/L、氯化钠5g/L、硫酸铵1g/L、磷酸氢二钾5g/L、磷酸二氢钾2g/L、柠檬酸1g/L、硫酸镁0.5g/L，微量元素溶液1mL/L，用去离子水配制初始pH 6.5～8.0；微量元素溶液为：硫酸亚铁3.2g/L、氯化亚锰1g/L、硝酸钴1.5g/L、氯化钙1g/L、氯化铜0.05～0.5g/L、硫酸锌0.4g/L、硼酸0.3g/L和钼酸钠0.8～4.2g/L溶于1mol/L盐酸中；诱导前补液为：葡萄糖300g/L、硫酸镁12g/L、氯化铵45g/L，用去离子水配制；乳糖诱导液为：乳糖180g/L、酵母浸膏180g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制；诱导后补料液为：甘油300g/L、乳糖75g/L、硫酸镁7g/L，用去离子水配制。
4.根据权利要求2所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于还包括乙醇沉淀纯化，乙醇沉淀纯化包括如下步骤：
（1）离心收集上述诱导表达的菌体，再用含6M尿素的PBS缓冲液重悬菌体后进行破碎，离心收集总蛋白上清液；
（2）往总蛋白上清液中加入等体积乙醇沉淀2～8小时，离心弃沉淀获取一次乙醇上清液；
（3）往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇第二次沉淀8～12小时，离心弃上清液，沉淀为纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。
5.根据权利要求4所述的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白的制备方法，其特征在于：所述的乙醇沉淀纯化包括如下步骤：
（1）5000～6000转/分离心15～30min收集诱导表达的菌体，用含6M尿素的PBS缓冲液重悬菌体，搅拌30分钟，重悬液经超声波短暂预处理1分钟，再经高压均质机处理破粹细胞，细胞破粹液经12000转/分离心20～30分钟，获取总蛋白上清液；
（2）往总蛋白上清液中加入等体积乙醇于-20℃沉淀2～8小时，12000转/分离心20～30分钟，弃沉淀获取一次乙醇上清液；
（3）往一次乙醇上清液中加入等体积乙醇于-20℃第二次沉淀8～12小时，12000转/分离心20～30分钟，弃上清液，沉淀为纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白。
6.一种制备GLP-1多肽或其类似物的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白溶解于50～60%甲酸溶液，45～50℃保温36～56小时至水解完全；
（2）旋蒸浓缩甲酸水解液，调pH值至7.5～8.0，加入尿素、咪唑和PBS使体系为含
6M尿素和5mM咪唑的pH 7.5～8.0的1×PBS溶液，离心去沉淀，上清液含带组氨酸标签的多肽P-H6-E7-PEP；
（3）上清液用Ni-NTA亲和层析纯化，用含6M尿素的磷酸缓冲液洗涤3-5次，再用不含尿素的磷酸缓冲液洗涤3-5次，最后用含150mM咪唑的磷酸缓冲液洗脱；
（4）往洗脱液中加E7蛋白酶水解3～8小时，蛋白酶水解液用磷酸缓冲液透析8～12小时，直接上样Ni-NTA柱去除蛋白酶和组氨酸标签，流出液为多肽盐溶液；
（5）调节多肽盐酸液pH值至3.5以下，SepPak C18反相树酯层析柱用含2%醋酸或甲酸的10%乙腈溶液预处理；酸化后的多肽盐溶液上样预处理过的SepPak C18反相树酯层析柱，用含2%醋酸或甲酸的10%乙腈溶液洗涤除盐，洗涤体积为柱体积的3～5倍；用含50%的乙腈溶液洗脱，洗脱体积为柱体积的2～3倍；洗脱液经过旋蒸浓缩，冻干，得到初纯化的目的多肽；
或将纯化的GLP-1多肽或其类似物的MFH融合蛋白用Tris-HCl溶液稀释溶解后，直接用E7蛋白酶水解制备GLP-1多肽或其类似物。
7.根据权利要求6所述的制备GLP-1多肽或其类似物的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的E7蛋白酶为如SEQ ID NO.3所示的Tev蛋白酶或该Tev蛋白酶变种S219A、G148L或L33A，带组氨酸标签；E7蛋白酶的加入量为0.5mg E7/mg多肽。
8.根据权利要求6所述的制备GLP-1多肽或其类似物的方法，其特征在于：还包括利用C18反相层析柱对初纯化的多肽进行精制，具体包括如下步骤：初纯化的GLP-1多肽或其类似物用含2%醋酸或甲酸的10%乙腈溶液溶解和过滤，C18反相层析柱用含2%醋酸或甲酸的10%乙腈溶液预处理；肽溶液上样预处理过的C18反相层析柱，用10～70%线性梯度洗脱，收集目标多肽组分，旋蒸浓缩，冻干。
9.权利要求1所述的融合蛋白、权利要求2-5任一项所述的融合蛋白的制备方法或权利要求6-8任一项所述的制备GLP-1多肽或其类似物的方法在制备治疗2-型糖尿病多肽药物制剂中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：在制备利拉鲁肽前体多肽或利拉鲁肽中的应用。
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