CN117192107A - 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117192107A CN117192107A CN202311165989.7A CN202311165989A CN117192107A CN 117192107 A CN117192107 A CN 117192107A CN 202311165989 A CN202311165989 A CN 202311165989A CN 117192107 A CN117192107 A CN 117192107A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- host cell
- specific host
- protein
- cell protein
- antibody
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 144
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 143
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 105
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 67
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 39
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 30
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 24
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 7
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 75
- YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N Liraglutide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)CC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 YSDQQAXHVYUZIW-QCIJIYAXSA-N 0.000 claims description 70
- 229960002701 liraglutide Drugs 0.000 claims description 70
- 108010019598 Liraglutide Proteins 0.000 claims description 69
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 53
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 52
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 51
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 47
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 39
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 36
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 31
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 28
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 26
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 21
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 20
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 claims description 19
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 17
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 claims description 15
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 claims description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 13
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 13
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 13
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 12
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 12
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 11
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 claims description 10
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 9
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 claims description 8
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 8
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 7
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 7
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 105
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 14
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 9
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013315 hypercross-linked polymer Substances 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800000224 Glucagon-like peptide 1 Proteins 0.000 description 2
- DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N Glucagon-like peptide 1 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DTHNMHAUYICORS-KTKZVXAJSA-N 0.000 description 2
- 102400000322 Glucagon-like peptide 1 Human genes 0.000 description 2
- 238000012449 Kunming mouse Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 2
- 229910001453 nickel ion Inorganic materials 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 palmitoyl fatty acid Chemical class 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000283977 Oryctolagus Species 0.000 description 1
- 229920002538 Polyethylene Glycol 20000 Polymers 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S([O-])(=O)=O.CCCCCCCC(O)=O MUUGCDGGIVCSDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000012444 downstream purification process Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N preproglucagon 78-108 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC=1N=CNC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)C1=CC=CC=C1 GCYXWQUSHADNBF-AAEALURTSA-N 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000029610 recognition of host Effects 0.000 description 1
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明提供了一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒，所述方法包括：将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入宿主细胞；用生产所述重组蛋白的发酵工艺及第一步纯化工艺，获得工艺特异性宿主细胞蛋白；将所述宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种的动物抗体；将所述宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验检测的标准品，将两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验检测试剂盒，用于检测待测样本中残留的宿主细胞蛋白。本发明的检测方法和试剂盒能够更加准确和灵敏地检测出基因工程重组蛋白样品中的宿主细胞蛋白残留。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域，特别涉及一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒。
背景技术
生物制药是利用生物活体来生产药物的方法。随着生物技术的发展，人工制备的生物原料成为当前生物制药原料的主要来源。生物制药技术作为战略性新兴产业技术，发展迅猛，在制药工艺中广泛应用。现代生物制药特点是以基因工程为主导，包括细胞工程、发酵工程、酶工程和组织工程等技术的应用。
大多数生物药物是通过重组DNA技术，使用宿主细胞来表达目标蛋白药物。由于宿主细胞本身的蛋白质也会大量表达，因此重组蛋白药物会受到宿主细胞蛋白( Host CellProtein, HCP)的污染。宿主细胞中含有各种可能给生物制品造成污染的HPC、DNA和内毒素等，即使经过复杂的纯化步骤，最终获得的生物药产品中仍有可能残留低浓度的HCP。
基因工程重组生物制品中残留的HCP作为外源蛋白，其潜在的免疫原性有可能诱导机体产生相应抗体；其潜在的“佐剂效应”也可能会引起机体对药物产生抗体，进而影响药物的疗效。灵敏度高、重复性好的宿主蛋白检测方法不仅是保证生物制品安全有效的关键,也是生产过程控制和工艺优化的重要参数。由于HCP可能会引起不可预测的免疫反应，因此相关法规要求对HCP进行鉴定和定量，以保障患者使用安全。HCP残留检测是生物药能否成功获批的重要因素之一。
由于伴随细胞凋亡、死亡、裂解等，除了目标蛋白外，其他非必需蛋白也可释放到细胞培养或发酵上清中。HCP构成了生物制品生产工艺过程与过程相关杂质的主要组成部分。生物制品中残余HCP含量通常被认为是产品的关键质量属性（CQA），因为HCP有可能影响产品的安全性和功效。HCP可以起免疫原性的作用而直接激发机体产生针对特定HCP杂质的抗体，同时也可以作为佐剂从而增加机体对治疗蛋白的免疫反应以及产生抗抗体，进而直接影响药物的生物分布、药代动力学和生物活性等。
目前，商品化的HCP试剂盒检测结果只代表通用的HCP含量和比例，但是每个项目都有其特异的HCP比例，而且各个蛋白对HCP的检测干扰程度不一样，所以建立专属的HCP检测方法是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒，可以更有目的性地、更加准确地检测出目的重组蛋白药品中的宿主细胞蛋白残留，提高检测的灵敏性。
为了达到上述目的，本发明的一个方面提供了一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，包括：
步骤S101：提供宿主细胞，将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入所述宿主细胞；
步骤S102：用生产所述重组蛋白的发酵工艺及第一步纯化工艺，获得工艺特异性宿主细胞蛋白；
步骤S103：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体；
步骤S104：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验检测的标准品，选取两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验检测试剂盒，用于检测待测样本中残留的宿主细胞蛋白；
其中，所述重组蛋白为利拉鲁肽前体，所述待测样本为利拉鲁肽前体产品或利拉鲁肽产品；
所述步骤S102包括：
步骤S102-1：将所述宿主细胞发酵及IPTG诱导培养以获得原液；
步骤S102-2：将所述原液离心以获得菌体；
步骤S102-3：在所述菌体中加入裂解缓冲液获得菌体重悬液；
步骤S102-4：将所述菌体重悬液通过高压均质及离心后收集上清液，所述上清液经滤膜过滤后获得含所述工艺特异性宿主细胞蛋白的蛋白液；
步骤S102-5：将所述蛋白液经过镍柱纯化后，获得所述工艺特异性宿主细胞蛋白；
所述步骤S102-5包括：
所述镍柱为采用Ni-NTA亲和层析介质填充的层析柱；
依次采用平衡缓冲液、所述蛋白液、所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液过柱；
所述平衡缓冲液的配方为：24~25mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为6.8-7.2；
洗脱缓冲液的配方为：390~410mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为8.0-8.2。
优选的，所述洗脱缓冲液的配方为：400mM咪唑、50mM磷酸钾、300mM氯化钠，pH调节为8.1。
优选的，取所述层析柱4~6倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以平衡所述层析柱；
取所述层析柱6~9倍柱体积的所述蛋白液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以使所述工艺特异性宿主细胞蛋白附着在所述Ni-NTA亲和层析介质；
取所述层析柱6~8倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗涤所述Ni-NTA亲和层析介质；
取所述层析柱6~9倍柱体积的所述洗脱缓冲液过柱；控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗脱附着在所述Ni-NTA亲和层析介质的所述工艺特异性宿主细胞蛋白。
优选的，在所述步骤S103中，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫鼠和兔，以获得鼠抗体和兔抗体，获得所述鼠抗体和所述兔抗体的步骤包括：
对所述鼠进行4次免疫，第四次免疫与第三次免疫的间隔时间为4周，将0.5mL1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白与0.5 mL福氏完全佐剂混合用于第一次免疫，免疫剂量为0.1mL，使用1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于第二次和第三次免疫，第二次免疫和第三次免疫的用量分别为0.05mL、第四次免疫的用量为0.25mL，所述鼠第四次免疫后间隔1周对所述鼠进行采血，分离血清以获得所述鼠抗体；
对所述兔进行4次免疫，第一次免疫、第二次免疫和第三次免疫的间隔时间为2周，第四次免疫与第三次免疫的间隔时间为4周，将1mL 1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白与1.5 mL福氏完全佐剂混合用于第一次免疫，免疫剂量为1 mL，使用1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫，第二次免疫和第三次免疫的用量分别为0.5 mL、第四次免疫的用量为1 mL，所述兔第四次免疫后间隔1周对所述兔进行采血，分离血清后以获得所述兔抗体。
优选的，所述步骤S104包括：
提供酶标板，用19~21μg/ml第一所述动物抗体，在4℃的温度下，包被过夜，以形成第一阶段固相载体；
取300μl的1%浓度的BSA作为封闭液，加入至所述第一阶段固相载体后，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第二阶段固相载体；
选取所述第二阶段固相载体中的若干个板孔，分别加入100μl的不同浓度的所述工艺特异性宿主细胞蛋白和所述重组蛋白样本，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第三阶段固相载体；
将不同于第一所述动物抗体的第二所述动物抗体稀释500~1000倍，加入至所述第三阶段固相载体，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第四阶段固相载体；
将与第二所述动物抗体结合的HRP偶联的二抗稀释5000-15000倍，加入至所述第四阶段固相载体，形成第五阶段固相载体；
向所述第五阶段固相载体加入TMB，显色时间为3-5min；
用酶标仪测定所述第五阶段固相载体中的所述板孔的A450吸光值。
优选的，第一所述动物抗体为兔抗体，第二所述动物抗体为鼠抗体，所述HRP偶联的二抗为HRP偶联的羊抗鼠抗体。
优选的，所述宿主细胞为大肠杆菌。
优选的，用于检测的所述待测样本的浓度为：所述利拉鲁肽前体产品的浓度为0.25mg/mL-0.0625mg/mL，所述利拉鲁肽产品的浓度为0.5mg/mL。
优选地，所述步骤S104中，所述工艺特异性宿主细胞蛋白的浓度梯度为：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、3.90625ng/mL。
本发明的另一方面在于提供一种用于上述检测方法的试剂盒，所述试剂盒包含所述工艺特异性宿主细胞蛋白、两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体、以及结合所述检测抗体的HRP偶联的二抗。
在本发明提供的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法中，将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入所述宿主细胞后，用生产所述重组蛋白的发酵工艺产生工艺特异性宿主细胞蛋白，及用生产所述重组蛋白的第一步纯化工艺进行纯化，获得所述工艺特异性宿主细胞蛋白。由于本发明的工艺特异性宿主细胞蛋白是在重组蛋白的发酵过程中产生，且在重组蛋白的纯化过程中不被完全去除的宿主细胞蛋白。因此，本发明的检测方法能够更加准确和灵敏地检测出基因工程重组蛋白样品中的宿主细胞蛋白残留。并且，通过使用生产所述重组蛋白的第一步纯化工艺进行纯化，与使用全部纯化工艺相比，能够得到适合数量的宿主细胞蛋白，由此构建的试剂盒以及检测方法的准确度及灵敏度更高。此外，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体；将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验检测的标准品，选取两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验检测试剂盒，用于检测所述重组蛋白样本中残留的宿主细胞蛋白。本发明采用两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体作为夹心酶联免疫吸附试验检测试剂盒，能够具有更高的检测灵敏度、更高的特异性和以及用于检测成分更复杂的重组蛋白样品。
附图说明
图1为本发明工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法的流程图；
图2为本发明实施例中蛋白凝胶电泳分析图；
图3为本发明试剂盒的结构示意图；
图4为本发明实施例中宿主细胞蛋白残留的ELISA检测标准曲线；
其中，附图标记如下：
101-酶标板；1011-板孔；102-捕获抗体；103-检测抗体；104-HRP偶联的羊抗鼠抗体；105-含3,3',5,5'-四甲基苯胺的底物显色液；
标准品；B-样本。
具体实施方式
下面将结合示意图对本发明的具体实施方式进行更详细的描述。根据下列描述，本发明的优点和特征将更清楚。需说明的是，附图均采用非常简化的形式且均使用非精准的比例，仅用以方便、明晰地辅助说明本发明实施例的目的。在本申请使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。
在本申请和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”、“所述”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。还应当理解，本文中使用的术语“和/或”是指并包含一个或多个相关联的列出项目的任何或所有可能组合。应当理解，尽管在本申请可能采用术语第一、第二、第三等来描述各种信息，但这些信息不应限于这些术语。这些术语仅用来将同一类型的信息彼此区分开。
图1为本实施例中的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法的流程图示意图。本发明的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法包括：
步骤S101：提供宿主细胞，将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入所述宿主细胞；
步骤S102：用生产所述重组蛋白的发酵工艺及第一步纯化工艺，获得工艺特异性宿主细胞蛋白；
步骤S103：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体；
步骤S104：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的标准品，选取两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒，用于检测待测样本中残留的宿主细胞蛋白。
在本发明的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法中，将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入所述宿主细胞后，用生产所述重组蛋白的发酵工艺产生工艺特异性宿主细胞蛋白，及用生产所述重组蛋白的第一步纯化工艺进行纯化，获得所述工艺特异性宿主细胞蛋白。如此，所获取的工艺特异性宿主细胞蛋白是在重组蛋白的发酵过程中产生、且在所述重组蛋白第一步纯化过程中不能被完全去除的宿主细胞蛋白，由于该宿主蛋白采用重组蛋白的发酵工艺产生，具有工艺特异性，因此，所述工艺特异性宿主细胞蛋白能够更加准确和灵敏地检测出基因工程重组蛋白样品中的宿主细胞蛋白残留。
此外，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体；将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验(ELISA)检测的标准品，选取两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒，用于检测所述重组蛋白样本中残留的宿主细胞蛋白。本发明采用两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体作为夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒，能够具有更高的检测灵敏度、更高的特异性和用于检测成分更复杂的重组蛋白样品。
步骤S101
将不含重组蛋白基因的空载体质粒（pET11b，上海生工生物工程有限公司）通过氯化钙转化方法导入所述宿主细胞。在步骤S101中所述的重组蛋白为利拉鲁肽前体，也即，所述重组蛋白基因为能够表达出利拉鲁肽前体的基因。所述利拉鲁肽前体为重组胰高血糖素样肽-1（GLP-1）的N端第7~37个氨基酸主链的结构。应知道，所述利拉鲁肽前体可以用于合成制备利拉鲁肽。基于此，本实施例中的所述待测样本为利拉鲁肽前体产品或利拉鲁肽产品。
在步骤S101中所述的宿主细胞为大肠杆菌。大肠杆菌是最早用于重组蛋白表达的宿主菌，大肠杆菌表达系统较其它表达系统具有多种优势，其在生物制品产业化应用价值如下：1)结构简单，生理生化和遗传背景知识，尤其是对基因表达调控机制有清楚的了解；2)易于大规模培养，培养周期短，成本低廉；3)抗污染能力强；4)经过一系列遗传改造，已发展为一种安全的基因工程实验系统，拥有了各种不同的菌株和载体系统。
应知道，所述宿主细胞也可以是其他类型的表达系统，如CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)、酵母菌及真菌等。应理解，所述宿主细胞还可以依据本领域技术人员的经验采用的重组蛋白表达系统，在此不做限定。
步骤S102
在步骤S102中，用生产所述重组蛋白的发酵工艺及第一步纯化工艺获得工艺特异性宿主细胞蛋白。在生产利拉鲁肽前体时，将含有能够表达出利拉鲁肽前体基因的质粒载体导入宿主细胞（例如大肠杆菌BL21DE3菌株，上海生工生物工程有限公司）后，进行发酵培养可以表达出利拉鲁肽前体。相应的，用生产利拉鲁肽前体的发酵工艺来发酵不含产利拉鲁肽前体基因的大肠杆菌，可以使所述大肠杆菌表达出来的宿主细胞蛋白的类型，更加接近生产利拉鲁肽前体时的情形。在理想的状态下，含利拉鲁肽前体基因的大肠杆菌与不含利拉鲁肽前体基因的大肠杆菌用同样的发酵工艺培养后，表达出来的所有类型的蛋白相比较，差别仅在于是否有利拉鲁肽前体，且宿主细胞蛋白的类型理论上是一样。基于此，不含目的基因的大肠杆菌，采用生产利拉鲁肽前体的发酵工艺来发酵，所得到的宿主细胞蛋白的类型会更为全面。
接下来，采用利拉鲁肽前体部分纯化工艺（即第一步纯化工艺）对所述不含产利拉鲁肽前体基因的大肠杆菌发酵产物进行纯化，如此，所获取的纯化蛋白即为工艺特异性宿主细胞蛋白。
再回到步骤S102，其具体包括以下步骤：
步骤S102-1：将所述宿主细胞发酵及IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导培养以获得原液。具体的，将含空载体质粒的大肠杆菌菌株接种于LB培养基，摇瓶37℃培养，再接入含有LB培养基的7L发酵罐（连云港百伦生物反应器科技有限公司，BLBIO-7GJ），37℃培养至OD600（上海仪电分析仪器有限公司，721G）到达诱导条件后，即OD600到达55-65，降温至20℃并加入1mM的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导表达，获得原液。蛋白凝胶电泳分析（北京六一生物科技有限公司，凝胶电泳装置，DYY7C）结果表明含空载质粒的大肠杆菌在发酵培养过程中产生了工艺特异性宿主细胞蛋白（如图2所示）。
步骤S102-2：将所述原液离心以获得菌体；具体的，在本发明的一实施方式中，用高速管式离心机（上海菌淼分离技术有限公司，JM-2/GQ76）回收菌体。
步骤S102-3：在所述菌体中加入裂解缓冲液获得菌体重悬液，具体的，在本发明的一实施方式中，提供一裂解缓冲液，加入所述菌体中，通过冰浴及顶置式搅拌器（ Wiggens,型号WB2000-M）搅拌混匀，以获得菌体重悬液。
应理解，裂解缓冲液是一种可以让菌体裂解的液体，裂解缓冲液也俗称菌体裂解液。所述裂解缓冲液的配方为：1.8~2.2mM 乙二胺四乙酸、24~26mM 咪唑、49~51mM 磷酸盐和295~305mM 氯化钠，pH调节为6.8-7.2。在本发明的一个具体实施例中，优选地，所述裂解缓冲液为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且裂解缓冲液的酸碱度为pH7.0。配置所述裂解缓冲液时，秤取15.77gKH2PO4、30.61gK2HPO4·3H2O、87.66gNaCl、8.5g咪唑、3.72gEDTA-2Na·2H2O，加入约4750g的去离子水，搅拌溶解后，用3M的氢氧化钠或6N的盐酸调pH至7.0，补水至5L，0.45μm滤膜 (苏州华凯过滤技术有限公司)过滤至5L血清瓶，保存于4℃冰箱。
回到步骤S102-3，在本发明的一具体实施方式中，用3000mL裂解缓冲液将300g湿重的菌体以比例10：1w/w进行重悬，以顶置式搅拌器（Wiggens, 型号WB2000-M）搅拌均匀。顶置式搅拌器搅拌时，在冰浴中操作，搅拌器的转速设置为700rpm。由此可以获得到菌体重悬液。
步骤S102-4：将所述菌体重悬液通过高压均质、离心、收集上清液后经滤膜过滤后获得一种含所述工艺特异性宿主细胞蛋白的蛋白液；
接下来，使用均质机（安拓思纳纳米计算有限公司，AH-PILOT）将搅拌均匀的菌体重悬液进行高压均质，均质压力为850±50 bar，重复3次。完成高压均质后，将菌体重悬液离心(长沙湘智离心机仪器有限公司，XZ-8M)，离心的转速设置为8000rpm，离心时间40min，离心时菌体重悬液的温度控制在3.9~4.1℃，菌体重悬液离心后收集其上清液，最后用0.45μm滤膜(苏州华凯过滤技术有限公司)过滤所述上清液，得到目标溶液，也即含所述工艺特异性宿主细胞蛋白的蛋白液。如图2所示，蛋白凝胶电泳分析结果表明含空载体质粒大肠杆菌菌体破菌裂解的情况达到预期。
步骤S102-5：将所述蛋白液，经过镍柱纯化后，获得所述工艺特异性宿主细胞蛋白。
进一步的，在步骤S102-5中，所述镍柱纯化即为生产利拉鲁肽前体所用的纯化工艺中的镍柱纯化工艺，包括以下步骤：
步骤S102-5-1：采用Ni-NTA亲和层析介质(武汉晶诚生物公司, Ni-Crystarose-FF)填充层析柱。即利拉鲁肽前体的纯化是通过Ni-NTA亲和层析介质来吸附，如此，在本实施方式中也采用Ni-NTA亲和层析介质填充层析柱。
在进行纯化时，依次采用平衡缓冲液、所述蛋白液、所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液过柱。在本发明的一实施方式中，上述过柱过程具体可包含：
步骤S102-5-2：取所述层析柱4~6倍柱体积的平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以平衡所述层析柱。应理解，平衡层析柱的目的是为了尽量减少除工艺特异性宿主蛋白本身特性因素外其他因素的影响。应理解，用4~6倍柱体积的平衡缓冲液，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，是为了能够更好的吸附利拉鲁肽前体。
进一步的，所述柱平衡缓冲液的配方包括：24~25mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为6.8-7.2。在本发明的一个具体实施例中，所述平衡缓冲液为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠，平衡缓冲液的酸碱度为pH7.0。配制所述平衡缓冲液时，称取15.77g KH2PO4、30.61g K2HPO4·3H2O、87.66gNaCl、8.5g咪唑，加入约4900g的去离子水，搅拌溶解后，补水至5L。用3M的氢氧化钠或6N的盐酸调整pH值至7.0。0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于4℃冰箱。
步骤S102-5-3：取所述层析柱6~9倍柱体积的所述蛋白液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以使所述工艺特异性宿主细胞蛋白附着在所述Ni-NTA亲和层析介质。
步骤S102-5-4：取所述层析柱6~8倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗涤所述Ni-NTA亲和层析介质。应理解，6~8倍柱体积的所述平衡缓冲液在利拉鲁肽前体工艺中，可以有更好的洗涤效果。
步骤S102-5-5：取所述层析柱6~9倍柱体积的洗脱缓冲液过柱；控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗脱附着在所述Ni-NTA亲和层析介质的所述工艺特异性宿主细胞蛋白。
进一步的，洗脱缓冲液的配方包括：390~410mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为8.0-8.2。使用上述洗脱缓冲液，能够提高后续工艺产品的稳定性。洗脱缓冲液的配方为：400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠。配制所述洗脱缓冲液时，称取27.2gKH2PO4、70.12gNaCl、108.93g咪唑，加入3670g的去离子水，搅拌溶解后，补水至4L。用3M的氢氧化钠或6N的盐酸调整pH值至8.1。0.45μm滤膜过滤至5L血清瓶，保存于室温。
进一步的，收集的工艺特异性宿主细胞蛋白通过将PEG20000涂于装有蛋白的3kD透析袋进行浓缩后，以13000 rpm离心10 min并分装，保存于-20℃。对浓缩后的蛋白溶液用Bradford法（考马斯亮蓝法）进行检测，其总蛋白含量为1mg/mL。如图2所示，蛋白凝胶电泳分析结果表明经过镍柱纯化后，工艺特异性宿主细胞蛋白被分离纯化收集。其中，泳道1是发酵完成后收集的菌液。泳道2是菌液均质裂解破菌以后的。泳道3是把2离心后的上清液。泳道4是镍柱工艺中不能被镍柱结合的流穿液，即大部分的容易被去除的杂蛋白。泳道5是洗涤出去的也是比较容易去除掉的杂蛋白。泳道6是制备的HCP，收集要用的。泳道7是6的浓缩后的HCP。
步骤S103
在步骤S103中，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体。例如，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫鼠和兔，以获得鼠抗体和兔抗体。
优选的，在本实施例中，所述动物选取鼠和兔，更优的，所述小鼠选用昆明小鼠，所述兔选用家兔（所述小鼠和兔来源于西安交通大学医学院实验动物中心）。
回到在步骤S103，具体的，获得鼠抗体的步骤包括：
将所述鼠进行4次免疫，取0.5ml步骤S102所得的HCP（1mg/ml）加入0.5ml的福氏完全佐剂，震荡混合至油包水状态。昆明小鼠每只脊背皮下分两点注射上述抗原，每点0.05ml。后续免疫使用不加入佐剂的HCP（1mg/ml）。2周后第二次免疫，背部皮下分两点接种，每点0.025ml HCP(1mg/ml)。再2周后第三次免疫，接种方法和剂量同第2针。再4周后，背部皮下分两点接种，每点0.125ml HCP。所述鼠第四次免疫后间隔1周对所述鼠进行采血，分离血清以获得所述鼠抗体。
在本实施例中，获得兔抗体的步骤包括：
将所述兔进行4次免疫，取1ml步骤S102所得的的HCP（1mg/ml）加入1.5ml的福氏完全佐剂，震荡混合至油包水状态。家兔（体重约3kg），每只脊背皮下分两点注射上述HCP，每点0.5ml。后续免疫使用不加入佐剂的HCP（1mg/ml）。2周后第二次免疫，背部皮下分两点，免疫抗原共0.5 ml；再2周后第三次免疫，背部皮下分两点，免疫抗原共0.5 ml。再4周后第四次免疫，背部皮下分两点，免疫抗原总量共1 ml。所述兔第四次免疫后间隔1周对所述兔进行采血，分离血清以获得所述兔抗体。
优选的，在本发明的一个实施方式中，分离兔血清后，将兔免疫血清采用辛酸-硫酸铵法纯化后，作为捕获抗体。具体步骤：取1份兔免疫血清与2份0.06M pH4.8醋酸盐缓冲液混合，室温搅拌下逐滴加入正辛酸33μl/每1ml血清，室温混合10 min，4℃静置2h，使其充分沉淀。4℃、12000 rpm离心30 min，弃沉淀，上清经一次性滤芯过滤后，加入1/10体积的10×PBS（即0.1M PBS），用2M NaOH调pH值至7.4，冰浴下于30 min内加入饱和硫酸铵溶液（样品体积：饱和硫酸铵溶液体积=1：0.9），4℃静置1h以上，4℃、10000 rpm离心30 min，弃上清。沉淀用适量的1×PBS溶解，装入透析袋中，于500ml的1×PBS（即0.01M PBS）中4℃透析过夜，得到兔抗残留蛋白免疫血清。
步骤S104
在步骤S104中，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的标准品，选取纯化后的兔抗体作为捕获抗体，选取鼠抗体作为检测抗体，所述待测样本为利拉鲁肽前体产品，应知道，所述待测样本还可以是利拉鲁肽产品。
图3为ELISA试剂盒的结构示意图。参考图3所示，在本发明的一实施方式中，选取兔抗体作为捕获抗体102，选取鼠抗体作为检测抗体103，将本发明的所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验（ELISA）检测的标准品A。如此，组成一种利拉鲁肽前体工艺特异性宿主细胞蛋白残留检测试剂盒。
相应的，采用所述利拉鲁肽前体工艺特异性宿主细胞蛋白残留检测试剂盒，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测待测样本B的步骤如下：
提供一酶标板，用19~21μg/mL（采用 Bradford 方法测定）所述兔抗体（捕获抗体102）进行包被，在4℃的温度下，包被过夜，以形成第一阶段固相载体；优选地，兔抗体的浓度为20μg/mL。
取300μl的1%浓度的BSA作为封闭液，加入至所述第一阶段固相载体后，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第二阶段固相载体；
选取所述第二阶段固相载体中的若干个板孔1011，分别加入100μL的不同浓度的所述工艺特异性宿主细胞蛋白（标准品A）和所述待测样本B，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第三阶段固相载体；
用含1%BSA的0.01M pH7.4 PBS将步骤S103获得的鼠抗体（检测抗体103）稀释500~1000倍，优选地，稀释800倍，将稀释后的抗体100ul加入至所述第三阶段的固相载体，37℃孵育1h，以形成第四阶段的固相载体；
将0.8mg/ml HRP偶联的羊抗鼠抗体104（购自Invitrogen ）用含1%BSA的0.01MpH7.4 PBS稀释5000-15000倍，优选地，稀释10000倍，加入100μL至所述第四阶段固相载体，在37℃的温度下，孵育1 h 后洗涤，形成第五阶段固相载体；
向所述第五阶段的固相载体加入TMB显色液（阿拉丁，即含3,3',5,5'-四甲基苯胺的底物显色液105），显色时间为3-5min；
用酶标仪[ BioteK（450nm波长）]，测定所述第五阶段的固相载体中所述板孔1011的A450吸光值。
应理解，所述第一阶段固相载体、第二阶段固相载体、第三阶段固相载体、第四阶段固相载体和第五阶段固相载体都是同一酶标板101。因此，所述第二阶段固相载体的所述板孔1011与所述第五阶段的固相载体的所述板孔1011，是同一板孔1011。
优选的，用于绘制标准曲线的所述工艺特异性宿主细胞蛋白（标准品A）的浓度梯度为：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、3.90625ng/mL。
实施例1 待测样本的制备
将编码利拉鲁肽前体的基因序列（编码产物为GLP-1第7～37个氨基酸，此31氨基酸与诺和诺德的原研产品“诺和力”一致），连接到质粒载体pET11b（购自Invitrogen公司），并采用氯化钙转化法导入宿主大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株（购自Invitrogen公司）。利用抗性平板挑选出阳性克隆菌株，并经IPTG诱导表达、凝胶电泳检测，获得高表达利拉鲁肽前体的工程菌株，扩增培养后冻存。
取1mL的上述冻存的表达菌种，接种于500mL摇瓶中（含100ml的LB培养基），培养温度37°C，转速150rpm，时间3～5小时，OD600达到0.6~1.0之间。 菌种在摇瓶活化后，取95mL菌种，接种于7L发酵槽中（含3000的LB培养基），培养于温度37℃，叶片转速300rpm~800rpm，维持pO2≥30%，时间8~11小时；OD600达到70时，降温至20℃后，维持15~20分钟，然后加入1mM IPTG以诱导目标蛋白质的表达。经约18h 发酵培养后，降温至10℃，将发酵菌液4℃离心（8000 rpm），去除上清液，得到菌体沉淀，进行下游纯化工艺。
基因工程重组利拉鲁肽前体的纯化方法，包括：重组表达菌体的裂解，菌体裂解缓冲液配方为：1.8～2.2mM 乙二胺四乙酸、24～26mM 咪唑、49～51mM 磷酸盐和295～305mM氯化钠，pH调节为6.8～7.2，优选地，菌体裂解缓冲液配方为2.0mM 乙二胺四乙酸、25mM 咪唑、50mM 磷酸盐和300mM 氯化钠，pH调节为7.0。镍离子柱纯化方法，利用Ni-NTA亲和层析介质(武汉晶诚生物公司, Ni-Crystarose-FF)填充层析柱，其中平衡缓冲液配方为：24~25mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为6.8-7.2，优选地，平衡缓冲液配方为25mM咪唑、50mM磷酸盐、300mM氯化钠，pH调节为7.0；洗脱缓冲液的配方包括：390~410mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为8.0-8.2，优选地，洗脱缓冲液的配方为400mM咪唑、50mM磷酸钾、300mM氯化钠，pH调节为8.1。使用与本发明说明书上述“步骤S102-5”中同样的步骤及参数（包括各溶液的过柱体积、线型流速等）进行纯化。自裂解方法，裂解缓冲液配方为：50mM 磷酸钾缓冲液, pH10，将镍离子柱洗脱下来的样本称重定量，然后用蠕动泵缓慢泵入2.5倍重量的裂解缓冲液中，然后放置于25℃恒温箱中自裂解反应16小时，然后离心收集上清，最后用0.45μm滤膜过滤。疏水层析纯化方法, 平衡缓冲液配方为：20mM三羟甲基氨基甲烷, 120 Mm 氯化钠, pH 8.0,洗脱缓冲液为纯化水，采用疏水层析胶体填充层析柱（填充介质Generik MC-HIC购自赛分科技公司），线性流速为122cm/h，以五倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，裂解过滤液上样体积十倍于柱体积，然后以五倍于柱体积平衡缓冲液洗涤纯化柱，最后以四倍于柱体积的纯化水洗脱收集目的产物。反相色谱纯化方法（填充介质Unisil C8购自苏州纳微科技公司），平衡缓冲液配方为：20mM碳酸氢铵，pH8.0；洗脱缓冲液配方为：20mM碳酸氢铵，pH 8.0，93%乙醇，线性流速为244cm/h，以二倍于柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，以疏水层析洗脱液上样，然后以二倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤柱子，最后以洗脱缓冲液线性梯度洗脱。切向流超滤浓缩方法，浓缩置换缓冲液配方为：10mM 碳酸氢铵, pH 9.0，将反相色谱纯化收集到的样本进行切向流系统超滤，其中压力为0.9bar，渗过流率为15mL/min，以一进一出的方式，使用相当于渗过流率的流速加入缓冲液进行连续式稀释，共置换十倍的反相色谱纯化步骤所洗脱的体积。基因工程重组表达的利拉鲁肽前体经过以上纯化方法，可获得重组多肽的纯度高（达97%以上）。在所制备的利拉鲁肽前体（含GLP-1第7至37氨基酸活性片段）的第26位氨基酸位置通过化学合成引入一段 16 碳的棕榈酰脂肪酸，可延缓其在人体内的降解速度，因此半衰期显著延长（从2分钟延长到11小时），并得以成药为利拉鲁肽。由利拉鲁肽前体制备得到利拉鲁肽的方法可使用本领域已知的任何方法。
实施例2 工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测
步骤S101：将不含利拉鲁肽重组蛋白基因的空载体质粒导入大肠杆菌。
步骤S102：用实施例1中生产待测样本的发酵工艺以及第一步纯化工艺获得工艺特异性宿主细胞蛋白。具体地，请参见本发明说明书“步骤S102”部分，其中，
步骤S102-3中，裂解缓冲液为2mM乙二胺四乙酸、25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠的混合溶液，且裂解缓冲液的酸碱度为pH7.0；
步骤S102-5中，采用Ni-NTA亲和层析介质填充层析柱；取所述层析柱5倍柱体积的平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为88cm/h，以平衡所述层析柱；取所述层析柱8倍柱体积的所述蛋白液过柱，控制过柱的线性流速为88cm/h，以使所述工艺特异性宿主细胞蛋白附着在所述Ni-NTA亲和层析介质；取所述层析柱7倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为88cm/h，以洗涤所述Ni-NTA亲和层析介质；取所述层析柱7倍柱体积的洗脱缓冲液过柱；控制过柱的线性流速为88cm/h，以洗脱附着在所述Ni-NTA亲和层析介质的所述工艺特异性宿主细胞蛋白。所述平衡缓冲液为25mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠，平衡缓冲液的酸碱度为pH7.0。洗脱缓冲液的配方为：400mM咪唑、50mM磷酸钾和300mM氯化钠。
步骤S103：使用步骤S102制备的工艺特异性宿主细胞蛋白免疫小鼠和兔获得对应鼠抗体和兔抗体，具体请参见本发明说明书“步骤S103”部分。
步骤S104：将步骤S102制备的工艺特异性宿主细胞蛋白作为标准品，将步骤S103获得的兔抗体作为捕获抗体，将步骤S103获得的鼠抗体作为检测抗体，将HRP偶联的羊抗鼠抗体作为二抗，通过酶联免疫检测方法对待测样品进行检测，其中，兔抗体的浓度为20μg/mL，鼠抗体免疫血清1:800稀释，HRP偶联的羊抗鼠抗体为1:10000。用于制备标准曲线的所述工艺特异性宿主细胞蛋白的浓度梯度为：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、3.90625ng/mL。
（1）标准曲线的相关性：标准曲线在浓度范围1000ng/mL-约4ng/mL，利用四参数拟合绘制标准曲线，其相关系数0.999，相关性良好。见图4。标准品浓度及对应A450值如表1所示。
表1 工艺特异性宿主细胞蛋白（HCP）标准曲线数据
（2）最低检测限：测定20个阴性对照（含1%BSA的PBS溶液）的平均值+2SD，以此数值从标准曲线中计算出最低检测限为1.22ng/mL，低于标准曲线的最低浓度值，按照工艺特异性宿主细胞蛋白残留为0.01%的标准，样品在稀释至0.25mg/mL时，其测定值应不高于25ng/mL，该方法的检测限远低于该标准，完全符合检测要求。具体数值及分析过程如表2所示。
表2 最低检测限分析数据
（3）精密度试验：以10ng/mL、50ng/mL、250ng/mL的HCP标准品作为低、中、高浓度的样品，每个浓度检测12个平行孔，计算其变异系数分别为2.66%、2.66%、1.67%，均小于15%，精密度符合要求。具体如表3所示。
表3 精密度试验
（4）回收试验：分别配制不同浓度的利拉鲁肽前体和利拉鲁肽样本，并配制各浓度下的利拉鲁肽前体和利拉鲁肽的加标样本。利拉鲁肽前体的浓度如下：0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL；利拉鲁肽的浓度如下：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL。根据标准曲线，计算各样本的HCP残留含量，即可计算出不同浓度样本的加标回收率，三个不同浓度的利拉鲁肽前体和利拉鲁肽的加标回收均在80%～120%范围内，具体如表4和表5所示。
回收率的计算方法如下：回收率=（加标样本HCP含量测定值-样本HCP含量测定值）/加入的HCP标准品含量×100%。
表4 不同浓度的利拉鲁肽前体的加标回收率
表5 不同浓度的利拉鲁肽的加标回收率
（4）最佳待测样本浓度：根据标准曲线和不同稀释倍数的利拉鲁肽前体/利拉鲁肽的A450值，计算各稀释倍数下的HCP残留浓度和稀释回收率，如表6和表7所示。
表6：利拉鲁肽前体的稀释回收率
表7：利拉鲁肽的稀释回收率
利拉鲁肽前体的检测浓度在0.25mg/mL~0.0625mg/mL，利拉鲁肽检测浓度为0.5mg/mL时，稀释回收率在80%-120%范围内，此时的干扰较小，确定以上浓度为样本的最佳检测浓度。
（5）样本检测结果：最终检测0.25 mg/mL利拉鲁肽前体和0.5mg/mL利拉鲁肽，经过4次重复实验，利拉鲁肽前体和利拉鲁肽的HCP含量的检测数值稳定，检测方法的重复性好。利拉鲁肽前体的HCP含量为52.066ng/mg（即52.066ppm），利拉鲁肽的HCP含量为2.6710ng/mg（即2.6710ppm）。生物药的HCP限度一般为1/1000~1/10000，即100~1000ppm，所以本发明的检测方法的检测灵敏度能够满足一般生物药的检测要求。
以上结果表明，本实施例提供的检测利拉鲁肽工艺特异性宿主细胞蛋白残留的方法，其检测线性范围宽，灵敏度高、精密度高，重复性好。可用于利拉鲁肽的工艺特异性宿主细胞蛋白（HCP）残留的检测分析。
上述仅为本发明的优选实施例而已，并不对本发明起到任何限制作用。任何所属技术领域的技术人员，在不脱离本发明的技术方案的范围内，对本发明揭露的技术方案和技术内容做任何形式的等同替换或修改等变动，均属未脱离本发明的技术方案的内容，仍属于本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，包括：
步骤S101：提供宿主细胞，将不含重组蛋白基因的空载体质粒导入所述宿主细胞；
步骤S102：用生产所述重组蛋白的发酵工艺及第一步纯化工艺，获得工艺特异性宿主细胞蛋白；
步骤S103：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫至少两种动物，以获得至少两种动物抗体；
步骤S104：将所述工艺特异性宿主细胞蛋白作为酶联免疫吸附试验检测的标准品，选取两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体，组成所述酶联免疫吸附试验检测试剂盒，用于检测待测样本中残留的宿主细胞蛋白；
其中，所述重组蛋白为利拉鲁肽前体，所述待测样本为利拉鲁肽前体产品或利拉鲁肽产品；
所述步骤S102包括：
步骤S102-1：将所述宿主细胞发酵及IPTG诱导培养以获得原液；
步骤S102-2：将所述原液离心以获得菌体；
步骤S102-3：在所述菌体中加入裂解缓冲液获得菌体重悬液；
步骤S102-4：将所述菌体重悬液通过高压均质及离心后收集上清液，所述上清液经滤膜过滤后获得含所述工艺特异性宿主细胞蛋白的蛋白液；
步骤S102-5：将所述蛋白液经过镍柱纯化后，获得所述工艺特异性宿主细胞蛋白；
步骤S102-5包括：
所述镍柱为采用Ni-NTA亲和层析介质填充的层析柱；
依次采用平衡缓冲液、所述蛋白液、所述平衡缓冲液、洗脱缓冲液过柱；
所述平衡缓冲液的配方为：24~25mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为6.8-7.2；
洗脱缓冲液的配方为：390~410mM咪唑、48~51mM磷酸盐、290~310mM氯化钠，pH调节为8.0-8.2。
2.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的配方为：1.8~2.2mM 乙二胺四乙酸、24~26mM 咪唑、49~51mM 磷酸盐和295~305mM 氯化钠，pH调节为6.8-7.2。
3.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，所述洗脱缓冲液的配方为：400mM咪唑、50mM磷酸钾、300mM氯化钠，pH调节为8.1。
4.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，取所述层析柱4~6倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以平衡所述层析柱；
取所述层析柱6~9倍柱体积的所述蛋白液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以使所述工艺特异性宿主细胞蛋白附着在所述Ni-NTA亲和层析介质；
取所述层析柱6~8倍柱体积的所述平衡缓冲液过柱，控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗涤所述Ni-NTA亲和层析介质；
取所述层析柱6~9倍柱体积的所述洗脱缓冲液过柱；控制过柱的线性流速为85~90cm/h，以洗脱附着在所述Ni-NTA亲和层析介质的所述工艺特异性宿主细胞蛋白。
5.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，在所述步骤S103中，将所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于免疫鼠和兔，以获得鼠抗体和兔抗体，获得所述鼠抗体和所述兔抗体的步骤包括：
对所述鼠进行4次免疫，第一次免疫、第二次免疫和第三次免疫的间隔时间为2周，第四次免疫与第三次免疫的间隔时间为4周，将0.5mL 1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白与0.5 mL福氏完全佐剂混合用于第一次免疫，免疫剂量为0.1mL，使用1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫，第二次免疫和第三次免疫的用量分别为0.05mL、第四次免疫的用量为0.25mL，所述鼠第四次免疫后间隔1周对所述鼠进行采血，分离血清以获得所述鼠抗体；
对所述兔进行4次免疫，第一次免疫、第二次免疫和第三次免疫的间隔时间为2周，第四次免疫与第三次免疫的间隔时间为4周，将1mL 1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白与1.5 mL福氏完全佐剂混合用于第一次免疫，免疫剂量为1 mL，使用1mg/mL的所述工艺特异性宿主细胞蛋白用于第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫，第二次免疫和第三次免疫的用量分别为0.5 mL、第四次免疫的用量为1 mL，所述兔第四次免疫后间隔1周对所述兔进行采血，分离血清后以获得所述兔抗体。
6.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，所述步骤S104包括：
提供酶标板，用19~21μg/ml第一所述动物抗体，在4℃的温度下，包被过夜，以形成第一阶段固相载体；
取300μl的1%浓度的BSA作为封闭液，加入至所述第一阶段固相载体后，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第二阶段固相载体；
选取所述第二阶段固相载体中的若干个板孔，分别加入100μl的不同浓度的所述工艺特异性宿主细胞蛋白和所述重组蛋白样本，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第三阶段固相载体；
将不同于第一所述动物抗体的第二所述动物抗体稀释500~1000倍，加入至所述第三阶段固相载体，在37℃的温度下，孵育1h，以形成第四阶段固相载体；
将与第二所述动物抗体结合的HRP偶联的二抗稀释5000-15000倍，加入至所述第四阶段固相载体，形成第五阶段固相载体；
向所述第五阶段固相载体加入3,3',5,5'-四甲基苯胺，显色时间为3-5min；
用酶标仪测定所述第五阶段固相载体中的所述板孔的A450吸光值。
7.如权利要求6所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，第一所述动物抗体为兔抗体，第二所述动物抗体为鼠抗体，所述HRP偶联的二抗为HRP偶联的羊抗鼠抗体。
8.如权利要求1所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。
9.如权利要求1-8其中任一项所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，用于检测的所述待测样本的浓度为：所述利拉鲁肽前体产品的浓度为0.25mg/mL-0.0625mg/mL，所述利拉鲁肽产品的浓度为0.5mg/mL。
10.如权利要求1-8其中任一项所述的工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法，其特征在于，在所述步骤S104中，所述工艺特异性宿主细胞蛋白的浓度梯度为：1000ng/mL、500ng/mL、250ng/mL、125ng/mL、62.5ng/mL、31.25ng/mL、15.625ng/mL、7.8125ng/mL、3.90625ng/mL。
11.一种用于权利要求1-10的检测方法的试剂盒，其特征在于，包含所述工艺特异性宿主细胞蛋白、两种所述动物抗体分别作为捕获抗体和检测抗体、以及结合所述检测抗体的HRP偶联的二抗。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311165989.7A CN117192107A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311165989.7A CN117192107A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117192107A true CN117192107A (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=88984538
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311165989.7A Pending CN117192107A (zh) | 2023-09-11 | 2023-09-11 | 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117192107A (zh) |
Citations (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060205010A1 (en) * | 2003-04-22 | 2006-09-14 | Catherine Allioux | Methods of host cell protein analysis |
| KR20080054120A (ko) * | 2006-12-12 | 2008-06-17 | 이수앱지스 주식회사 | 재조합 항체의약품의 생산시 생산세포주 유래 단백질검출을 위한 ｅｌｉｓａ 방법 |
| US20080261249A1 (en) * | 2004-01-13 | 2008-10-23 | Genentech, Inc | Detecting and Quantifying Host Cell Proteins in Recombinant Protein Products |
| WO2009132484A1 (zh) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | Vero细胞裂解蛋白、其制备方法以及包含该蛋白的vero细胞hcp检测试剂盒 |
| CN103641913A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 上海博唯生物科技有限公司 | 一种汉逊酵母hcp抗体制备方法，制得抗体及其应用 |
| CN103792366A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 |
| CN104098702A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-10-15 | 湖北工业大学 | 一种利用mfh融合蛋白制备glp-1多肽或其类似物方法和应用 |
| CN105021824A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-11-04 | 上海优者生物科技有限公司 | 用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法 |
| WO2016119639A1 (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 |
| US20160320391A1 (en) * | 2013-09-13 | 2016-11-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for detecting and quantifying host cell protein in cell lines and recombinant polypeptide products |
| CN106802349A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-06 | 广东华南联合疫苗开发院有限公司 | Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法 |
| CN106957362A (zh) * | 2016-01-12 | 2017-07-18 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用 |
| CN108103002A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-06-01 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | Mdck细胞宿主残留蛋白的制备及其用途 |
| CN109384832A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-26 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用 |
| US20190086397A1 (en) * | 2017-09-20 | 2019-03-21 | Charles River Laboratories International, Inc. | Cho host cell protein assay |
| US20190128903A1 (en) * | 2016-04-14 | 2019-05-02 | Lonza Ltd | Compositions and methods for the detection of host cell proteins |
| CN111426843A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-17 | 东莞市东阳光生物药研发有限公司 | 毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用 |
| CN112798792A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-05-14 | 东曜药业有限公司 | 一种检测cho细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法 |
| CN112812969A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-18 | 福建基诺厚普生物科技有限公司 | 一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法 |
| US20210302433A1 (en) * | 2020-03-30 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for characterizing low-abundance host cell proteins |
| CN114966038A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留sp2/0宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒 |
| CN114966041A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 |
| CN114966037A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 |
| WO2022256613A1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | Genentech, Inc. | Identification and quantitation of residual host cell proteins in protein samples |
-
2023
- 2023-09-11 CN CN202311165989.7A patent/CN117192107A/zh active Pending
Patent Citations (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20060205010A1 (en) * | 2003-04-22 | 2006-09-14 | Catherine Allioux | Methods of host cell protein analysis |
| US20080261249A1 (en) * | 2004-01-13 | 2008-10-23 | Genentech, Inc | Detecting and Quantifying Host Cell Proteins in Recombinant Protein Products |
| KR20080054120A (ko) * | 2006-12-12 | 2008-06-17 | 이수앱지스 주식회사 | 재조합 항체의약품의 생산시 생산세포주 유래 단백질검출을 위한 ｅｌｉｓａ 방법 |
| WO2009132484A1 (zh) * | 2008-04-30 | 2009-11-05 | 上海泽润生物科技有限公司 | Vero细胞裂解蛋白、其制备方法以及包含该蛋白的vero细胞hcp检测试剂盒 |
| US20160320391A1 (en) * | 2013-09-13 | 2016-11-03 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for detecting and quantifying host cell protein in cell lines and recombinant polypeptide products |
| CN103641913A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-19 | 上海博唯生物科技有限公司 | 一种汉逊酵母hcp抗体制备方法，制得抗体及其应用 |
| CN103792366A (zh) * | 2014-01-21 | 2014-05-14 | 内蒙古必威安泰生物科技有限公司 | 口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 |
| CN104098702A (zh) * | 2014-07-23 | 2014-10-15 | 湖北工业大学 | 一种利用mfh融合蛋白制备glp-1多肽或其类似物方法和应用 |
| WO2016119639A1 (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-04 | 武汉禾元生物科技股份有限公司 | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 |
| CN105884886A (zh) * | 2015-01-26 | 2016-08-24 | 武汉大学 | 检测重组蛋白提取物中残留杂蛋白的特异性抗体及检测试剂 |
| CN105021824A (zh) * | 2015-07-06 | 2015-11-04 | 上海优者生物科技有限公司 | 用于定量检测生物医药制品中残留cho宿主细胞蛋白的elisa试剂盒及其使用方法 |
| CN106957362A (zh) * | 2016-01-12 | 2017-07-18 | 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 | 一种毕赤酵母宿主蛋白抗体的制备方法及其应用 |
| US20190128903A1 (en) * | 2016-04-14 | 2019-05-02 | Lonza Ltd | Compositions and methods for the detection of host cell proteins |
| CN106802349A (zh) * | 2016-12-30 | 2017-06-06 | 广东华南联合疫苗开发院有限公司 | Sf昆虫细胞宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法 |
| US20190086397A1 (en) * | 2017-09-20 | 2019-03-21 | Charles River Laboratories International, Inc. | Cho host cell protein assay |
| CN108103002A (zh) * | 2017-11-30 | 2018-06-01 | 武汉生物制品研究所有限责任公司 | Mdck细胞宿主残留蛋白的制备及其用途 |
| CN109384832A (zh) * | 2018-09-29 | 2019-02-26 | 北京民海生物科技有限公司 | 重组型疫苗宿主蛋白抗体的制备方法及其应用 |
| CN111426843A (zh) * | 2020-03-13 | 2020-07-17 | 东莞市东阳光生物药研发有限公司 | 毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用 |
| US20210302433A1 (en) * | 2020-03-30 | 2021-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods for characterizing low-abundance host cell proteins |
| CN112798792A (zh) * | 2020-12-29 | 2021-05-14 | 东曜药业有限公司 | 一种检测cho细胞宿主蛋白残留的试剂盒及检测方法 |
| CN112812969A (zh) * | 2021-01-12 | 2021-05-18 | 福建基诺厚普生物科技有限公司 | 一种基因工程重组表达多肽的系统纯化方法 |
| WO2022256613A1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | Genentech, Inc. | Identification and quantitation of residual host cell proteins in protein samples |
| CN114966038A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留sp2/0宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒 |
| CN114966041A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留大肠杆菌宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 |
| CN114966037A (zh) * | 2022-04-13 | 2022-08-30 | 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 | 精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| CATHERINE E M HOGWOOD等: "Measurement and control of host cell proteins (HCPs) in CHO cell bioprocesses", CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY, vol. 30, 15 July 2014 (2014-07-15), pages 153 - 160, XP055378440, DOI: 10.1016/j.copbio.2014.06.017 * |
| N DAGOUASSAT等: "Development of a quantitative assay for residual host cell proteins in a recombinant subunit vaccine against human respiratory syncytial virus", J IMMUNOL METHODS, vol. 251, no. 1, 1 May 2001 (2001-05-01), pages 152 - 153 * |
| 张成林: "《高等学校生物技术专业教材 工业微生物分子生物学实验原理与技术》", 31 July 2022, 中国轻工业出版社, pages: 127 - 21 * |
| 李朋彦等: "利拉鲁肽前体肽GLP-1(7-37)K34R在大肠埃希菌中的表达与优化", 医药导报, vol. 40, no. 6, 28 June 2021 (2021-06-28), pages 730 - 731 * |
| 蔡威特等: "汉逊酵母宿主细胞蛋白抗体制备的研究", 食品与发酵科技, vol. 53, no. 04, 25 August 2017 (2017-08-25), pages 12 - 15 * |
| 邓春平等: "重组人抗TNFα单抗制品中CHO宿主细胞蛋白质残留夹心ELISA检测方法的建立及验证", 中国生物制品学杂志, vol. 33, no. 08, 10 August 2020 (2020-08-10), pages 925 - 928 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR20070100307A (ko) | 가용성 다중 막관통 단백질의 생산 방법 | |
| CN110684740B (zh) | 一种抗人泛素羧基末端水解酶-1(uch-l1)的单克隆抗体及其应用 | |
| CN104059133A (zh) | 一类突变的具有高耐碱特性的蛋白a及其应用 | |
| Martens et al. | Fully automated production of potential Malaria vaccines with Pichia pastoris in integrated processing | |
| Bhardwaj et al. | Production of recombinant PvDBPII, receptor binding domain of Plasmodium vivax Duffy binding protein, and evaluation of immunogenicity to identify an adjuvant formulation for vaccine development | |
| CN113980145A (zh) | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN114276445B (zh) | 轮状病毒重组蛋白特异性抗体、质粒载体及方法 | |
| CN112142851B (zh) | 一种狂犬病毒表面的亚单位融合蛋白tG及其制备方法和应用 | |
| JP2904516B2 (ja) | ストレプトリシン０抗原誘導体、その製造方法およびその用途 | |
| CN111875676A (zh) | 非洲猪瘟病毒免疫原的p49突变蛋白、重组载体、大肠杆菌基因工程菌及制备方法和应用 | |
| CN104610443B (zh) | 一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途 | |
| EP0763100B1 (en) | Method of purification of clostridium difficile toxin a and production of mono-specific antibodies | |
| CN116284338A (zh) | 一种重组人载脂蛋白ApoE及其多克隆抗体的制备方法 | |
| CN117192107A (zh) | 一种工艺特异性宿主细胞蛋白残留的检测方法及试剂盒 | |
| CN111234025A (zh) | 抗右旋氧氟沙星抗体的Fab片段及其制备与应用 | |
| CN111018998A (zh) | 一种莱姆重组融合蛋白OspC-VlsE及其应用 | |
| CN104749371B (zh) | 人肾母细胞瘤过度表达基因编码蛋白酶联免疫试剂盒 | |
| RU2141531C1 (ru) | Способ получения рекомбинантного инсулина человека | |
| JP6811725B2 (ja) | 組換えタンパク質の生成方法 | |
| Tripathi et al. | Evaluation of antibody response against recombinant domain III proteins of dengue virus type 1 and 2 | |
| CN109797143B (zh) | 一种包含大肠杆菌β半乳糖苷酶受体的试剂 | |
| CN110894236A (zh) | 一种抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体及其应用 | |
| CN110172434A (zh) | 一种生产人胱抑素c的基因工程菌及方法 | |
| CN116789766B (zh) | 一种用于载脂蛋白ai的纳米抗亲和介质制备方法及载脂蛋白ai的纯化方法 | |
| CN117624374A (zh) | 高致病性冠状病毒受体结合域异源多聚体蛋白及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |