CN111426843A - 毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种宿主蛋白残留的检测试剂盒。该试剂盒包括：多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。利用根据本发明实施例的试剂盒检测生物药产品中的宿主蛋白的残留，灵敏度和准确度均显著提高。

Description

毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及毕赤酵母宿主蛋白残留的检测试剂盒以及检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法。
背景技术
市面上的重组蛋白酶系由工程菌重组表达，经纯化得到重组蛋白酶。但所获得的重组蛋白酶会有宿主蛋白残留的风险，按照ICHQ6B的管理规定，宿主蛋白是生物药产品的工艺相关杂质，需要建立适合的检测方法进行严格控制。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
为此，本发明提出一种宿主蛋白残留的检测试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白，其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。根发明人发现，上述方法所获得的多克隆抗体的覆盖率，相比于现有技术，显著提高。利用根据本发明实施例的试剂盒检测生物药产品中的宿主蛋白的残留，灵敏度和准确度均显著提高。
根据本发明的实施例，上述试剂盒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，上述制备抗体的方法进一步包括将第一含有抗体的血清进行纯化处理，以便获得第一抗体；将第一抗体与所述第二抗体混合，以便获得所述多克隆抗体。进而抗体的覆盖率进一步提高。
根据本发明的实施例，所述抗原为细胞全蛋白HCPs。
根据本发明的具体实施例，所述抗原为发酵工程菌HCPs。
根据本发明的具体实施例，所述抗原为毕赤酵母HCPs。
根据本发明的具体实施例，所述第一待免疫动物和/或第二待免疫动物为新西兰大白兔。
根据本发明的实施例，所述发酵工程菌HCPs是通过如下方式获得的：将携带空载体的发酵工程菌进行发酵处理，以便使发酵工程菌的OD600至少达到400，优选地，不超过600，发酵液作为免疫原1(包括发酵上清和菌体)，将发酵液上清作为免疫原2，将发酵工程菌菌体作为免疫原3；将发酵液进行亲和层析处理，层析处理液作为免疫原4。发明人在抗体制备过程中，模拟工程菌发酵产品的生产工艺，采用携带空载载体的发酵工程菌进行发酵，以获得免疫原。发明人发现，将发酵过程后上述四种免疫原分别作为免疫原免疫个体，再把获得的抗体混合，相比上述任意一种单一免疫原作为免疫原免疫个体，获得的抗体，其覆盖率进一步显著提高。
根据本发明的具体实施例，所述发酵液进行亲和层析处理是通过如下方式进行的：采用博格隆的EzFast protein A Diamond亲和层析柱，偶联约10～30mg的抗含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs的多克隆抗体，然后再上样1～1.5mg的含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs，收集其穿透液，即为所需的免疫原4。
根据本发明的具体实施例，进一步包括分别将所述免疫原1、免疫原2、免疫原3以及免疫原4与弗氏完全佐剂等体积混合，以便获得免疫原混合液1、免疫原混合液2、免疫原混合液3以及免疫原混合液4。弗氏完全佐剂是一种油包水的乳浊液，含结核分枝杆菌的细胞壁成分。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。
根据本发明的具体实施例，进一步包括分别将所述免疫原1、免疫原2、免疫原3以及免疫原4与弗氏不完全佐剂等体积混合，以便获得免疫原混合液A、免疫原混合液B、免疫原混合液C以及免疫原混合液D。弗氏不完全佐剂不含结核分枝杆菌成分。
根据本发明的实施例，所述主动免疫是通过如下方式进行的：分别利用所述免疫原混合液1、免疫原混合液2、免疫原混合液3以及免疫原混合液4对所述第一待免疫动物的四个个体进行初始免疫；每隔7～10天，分别利用所述免疫原混合液A、免疫原混合液B、免疫原混合液C以及免疫原混合液D对所述第一待免疫动物的四个个体进行加强免疫。采用包含弗氏完全佐剂的免疫原混合液对动物进行初始免疫，而采用含弗氏不完全佐剂的免疫原混合液对动物进行加强免疫，一方面有效刺激了局部免疫反应，另一方面有效减少了副作用。
根据本发明的实施例，进行被动免疫前，进一步包括将所述第一含有抗体的血清进行稀释处理。具体地，所述稀释处理的倍数为2～4倍，优选地，稀释3倍。
根据本发明的实施例，将第一次和第二次加强免疫后所获得的血清合并后，以便获得被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D。发明人发现，采用第一次和第二次加强免疫后所获得的血清，合并作为后续被动免疫用血清，可进一步提高抗体的覆盖率。
根据本发明的实施例，所述被动免疫是通过如下方式进行的：分别利用被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D对所述第二待免疫动物的四个个体进行初始免疫；每隔7～10天，分别利用所述被动免疫用血清A、被动免疫用血清B、被动免疫用血清C以及被动免疫用血清D对所述第二待免疫动物的四个个体进行加强免疫。
根据本发明的实施例，当血清中抗体滴度至少达到50万时，优选地，不超过400万时，分别对第一含有抗体的血清和第二含有抗体的血清进行纯化处理。
根据本发明的实施例，所述抗原与所述第一待免疫动物个体的质量比1:1～3:2(μg/g)。
根据本发明的实施例，所述第一含有抗体的血清与所述第二待免疫动物个体的体积质量比为1:20～1:90(ml/kg)。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括抗体稀释液、样品稀释液、reagentA、reagent B或PBST溶液。
具体地，所述抗体稀释液为碳酸钠和碳酸氢钠的水溶液，所述抗体稀释液的pH为9.5～9.7。
具体地，所述样品稀释液为BSA(牛血清蛋白)的水溶液，所述样品稀释液的pH为7.2～7.4；
具体地，所述reagent A为Streptavidin(链霉亲和素)；
具体地，所述reagent B为Biotin-HRP(辣根过氧化物酶HRP标记的生物素)；
具体地，所述PBST溶液为PBS和吐温-20的水溶液。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种检测待测样品中宿主蛋白残留的方法。根据本发明的实施例，利用前面所述的试剂盒，对待测样品按照预定操作进行孵育处理；将孵育处理后的待测样品进行酶标检测，以便获得吸光值；基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的宿主蛋白残留量。根据本发明实施例的方法检测待测样品中的宿主蛋白残留量，重复性好、准确度高。
根据本发明的实施例，所述对待测样品按照预定操作进行孵育处理包括：
(1)利用多克隆抗体对酶标板进行覆盖处理；
(2)利用封闭液对覆盖处理后的酶标板进行封闭处理；
(3)将待测样品加入封闭处理后的酶标板中进行第一孵育处理；
(4)将第一孵育处理后的酶标板进行第一清洗处理；
(5)将生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理；
(6)将第二孵育处理后的酶标板进行第二清洗处理；
(7)将SABC-HRP工作液加入第二清洗处理后的酶标板进行第三孵育处理；
(8)将第三孵育处理后的酶标板进行第三清洗处理；
(9)将第三清洗处理产物进行显色反应。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：(1)利用多克隆抗体对酶标板进行覆盖处理；(2)利用封闭液对覆盖处理后的酶标板进行封闭处理；(3)将待测样品加入封闭处理后的酶标板中进行第一孵育处理；(4)将第一孵育处理后的酶标板进行第一清洗处理；(5)将生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理；(6)将第二孵育处理产物进行显色反应；(6)将第二孵育处理后的酶标板进行第二清洗处理；(7)将SABC-HRP工作液加入第二清洗处理后的酶标板进行第三孵育处理；(8)将第三孵育处理后的酶标板进行第三清洗处理；(9)将第三清洗处理产物进行显色反应。(10)利用终止液(2mol/L硫酸溶液)终止显色反应；(11)将终止显色反应后的酶标板进行酶标检测，以便获得吸光值；(12)基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的毕赤酵母宿主蛋白残留量，其中，所述多克隆抗体如前面所限定的。根据本发明实施例的方法检测待测样品中的宿主蛋白残留量，重复性好、准确度高。
根据本发明的实施例，上述方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述待测样品为重组肠激酶。
根据本发明的实施例，所述待测样品预先进行HIS标签去除处理。发明人在实验中发现，带有HIS标签的重组肠激酶对检测体系干扰严重，发明人预先对待测样品-重组肠激酶中的HIS标签去除，可大大提高检测的准确度。
根据本发明的实施例，所述HIS标签去除处理是通过IDA-Cobalt磁珠纯化进行的。发明人尝试进行了多种可特异性结合HIS标签的磁珠，以进行磁珠纯化去除HIS标签或连接有HIS标签的重组蛋白，发明人发现，采用IDA-Cobalt磁珠纯化相比于其他可结合HIS标签的磁珠纯化，处理后的待测样品用于蛋白残留检测，检测的准确度更高。
根据本发明的实施例，利用230μg/ml～250μg/ml的所述多克隆抗体对所述酶标板进行覆盖处理。
根据本发明的实施例，将1.8μg/ml～3.0μg/ml生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理。
附图说明
图1是根据本发明实施例的主动免疫组的抗血清滴度；
图2是根据本发明实施例的被动免疫组的抗血清滴度；
图3是根据本发明实施例的抗体纯化结果图；
图4是根据本发明实施例的主动免疫组与被动免疫组抗体对Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs的识别结果；
图5是根据本发明实施例的PDQuest软件分析本发明制备抗体的覆盖率结果图；
图6是根据本发明实施例的主动免疫组抗体与混合抗体的2D-western blot图谱对比图；以及
图7是根据本发明实施例的四参数拟合曲线图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明为了能够准确地检测重组肠激酶中的毕赤酵母宿主蛋白残留量，采用了BeaverBeadsTM IDA-Cobalt磁珠对重组肠激酶样本进行前处理，选择性地去除含组氨酸标签的重组肠激酶，再用本实验室自主研发的包含自主研发的多克隆抗体的宿主蛋白残留检测试剂盒对前处理后的样本进行检测，并对该分析方法进行方法学验证。该方法重复性好、准确度高，可有效用于重组肠激酶毕赤酵母宿主蛋白残留检测。
实施例1抗毕赤酵母(Pichia Pastoris)细胞宿主蛋白的兔源多克隆抗体的制备
1)实验仪器：混合型球磨仪 厂家：德国莱驰
电子天平 厂家：梅特勒
2)实验材料：新西兰大白兔 厂家：青岛康大生物SCXK(鲁)雌2-2.5kg
PBS粉末包 厂家：BOSTER
弗氏完全佐剂 厂家：SIGMA
弗氏不完全佐剂 厂家：SIGMA
免疫原：含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs1(菌体+上清)、含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞发酵上清HCPs2、含pPIC9K空白载体的PichiaPastoris细胞菌体HCPs3、经亲和层析捕获的低免疫原性的HCPs4。
免疫原的制备过程：发酵罐配制好培养基后，经消毒冷却，将含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞接入发酵罐，通气、搅拌并调整温度为29±3℃开始发酵，过程中流加甘油及补充尿素，然后根据时间分阶段控制温度在25～33℃之间进行培养，产物表达速度随甲醇补加量递增。发酵约60小时后，加硫酸铵补充氮源，继续发酵至结束。发酵时间约90～130小时，待OD600值达到400以上但不超过600时开始收样，获取发酵液。将发酵液进行离心处理，分别获取发酵上清液和菌体，菌体于4～10℃超声破碎处理，离心处理，获得菌体上清液。分别取菌体上清液和发酵上清液于约4～10℃的条件下用3KD膜包过滤，取大于3KD的菌体HCPs和发酵上清HCPs进行冻干。免疫前分别取发酵上清HCPs冻干粉、菌体HCPs冻干粉用PBS缓冲液溶解，即为免疫原发酵上清HCPs2(免疫原2)、菌体HCPs3(免疫原3)；按蛋白含量等量混合，即为所需全蛋白HCPs1(菌体+上清)(免疫原1)；经亲和层析捕获的低免疫原性的HCPs4(免疫原4)。
亲和层析捕获的低免疫原性HCPs4的获得过程如下所述：
采用博格隆的EzFast protein A Diamond亲和层析柱，偶联约10～30mg的抗含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs的多克隆抗体，然后再上样1～1.5mg的含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs，收集其穿透液，即为所需的免疫原4(HCPs4)。
3)实验过程：
初次免疫溶液配制：分别取免疫原溶液与弗氏完全佐剂等体积混合，于混合型球磨仪上震荡使之充分乳化；
加强免疫溶液配制：分别取免疫原溶液与弗氏不完全佐剂等体积混合，于混合型球磨仪上震荡使之充分乳化。
免疫方法：采用背部多点注射法，即于家兔脊柱两旁选取多点进行皮下注射(每次免疫前均在耳沿静脉取血1-2ml，取上层血清于-20℃保存)；
免疫原注射量：约500μg/kg；
待免疫动物：2～2.5kg雌性新西兰大白兔；
注射前应排除注射器的气泡，剃取注射处的毛发，并用75％乙醇消毒暴露的皮肤，捏出皮肤，将针头以相对皮肤15°的角度进针，进针深度为1-2cm，不要刺入肌肉中，注射结束后，将针在注射处放置几秒再轻轻拔出，并用75％乙醇在注射处消毒，每次免疫取3-4个注射点。
<1>主动免疫过程：
按表1对新西兰大白兔进行主动免疫：包括一次初免，三次加强免疫。
表1：
Figure BDA0002410962700000061
<2>被动免疫过程：
将主动免疫过程中第一、二次加强免疫所取的血清按对应的兔子的组别混匀，并用0.22μm无菌滤头过滤、按100μl/管分装，置于-20℃保存。
血清每次被动免疫前解冻，用生理盐水稀释至约300μl，免疫前5分钟按对应免疫的兔子组别于耳沿静脉注射，然后再进行皮下免疫注射，每只兔子注射100μl的第一、二次加强免疫所取的血清。
按表2对新西兰大白兔进行被动免疫。
表2：
Figure BDA0002410962700000071
<3>抗血清的滴度监测：
采用间接法ELISA测定免疫后的抗血清的滴度：
主动免疫组的抗血清(含有抗体的血清)滴度如图1所示。被动免疫组的抗血清(含有抗体的血清)滴度如图2所示。
主动免疫组、被动免疫组经多次免疫后，其抗血清滴度均在50万以上，可进行全血采集。
<4>全血采集及抗体纯化
采用腹动脉采血法，采血前于新西兰大白兔的耳沿静脉处按1.2ml/kg注射3％戊巴比妥钠溶液进行麻醉，用手术剪开腹部，找到腹动脉，进行全血采集，将所得的血液于4℃静置过夜，然后于“4℃、3000rpm”的条件下离心15min，取上层血清。将上层血清用2倍体积的醋酸钠缓冲液(pH约5.0)稀释，混匀后用1M盐酸调节pH至4.8，置于磁力搅拌器上，在缓慢搅拌的过程中滴加正辛酸，使其终浓度为3.3％，于4℃静置过夜，次日将该溶液于“4℃、10000rpm”离心20min，取上清溶液，过滤，然后加入1/10体积的PBS缓冲液，混匀后再用1M氢氧化钠溶液调pH至7.4，置于磁力搅拌器上，在缓慢搅拌的过程中，每毫升溶液加入0.308g固体硫酸铵，继续搅拌30min，于4℃静置过夜，使抗体充分沉淀，然后于“4℃、10000rpm”离心20min，弃上清，加入等体积的PBS缓冲液将沉淀复溶，然后采用Protein A亲和层析进一步纯化抗体，分别收集其洗脱峰和穿透峰，采用SDS-PAGE法来评价抗体的纯化效果，实验结果如图3所示(左侧为非还原电泳，右侧为还原电泳)。可见经过Protein A亲和层析后，得到了纯度较高的抗体(即洗脱组)。
实施例2抗Pichia Pastoris细胞宿主蛋白的兔源多克隆抗体的考察
<1>利用1-D电泳-western blot考察所制备的抗体对含pPIC9K空白载体的PichiaPastoris细胞全蛋白HCPs的识别能力，结果如图4所示。
由1-D电泳-western blot图谱结果，与主动免疫组相对，对应的被动免疫组对含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs的识别条带明显增加，特别是在50KD以下的条带部分识别较主动免疫组更多，合并主动免疫组与被动免疫组的抗体作为本发明制备的抗体。
<2>利用2-D电泳-western blot对比本发明方法制备抗体与主动免疫组抗体对含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞全蛋白HCPs的覆盖率对比
本发明方法制备抗体的2-D电泳-western blot如图5所示。根据PDQuest软件分析结果：含pPIC9K空白载体的Pichia Pastoris细胞的全蛋白HCPs的银染图谱的蛋白斑点统计个数为602个；本发明自制抗体的WB图谱的斑点统计个数为552个；两张图谱匹配的共同斑点个数为258个；本发明自制抗体的覆盖率为552/(602+552-258)x100％＝61.6％。
图6是主动免疫组抗体与混合抗体的2D-western blot图谱对比，结果显示，增加了被动免疫组抗体后，2D-Western Blot的抗体识别的蛋白斑点明显增加。
进而发明人利用实施例1制备获得的多克隆抗体，制备检测重组蛋白酶样本中残留毕赤酵母蛋白的试剂盒。该试剂盒中包括：实施例1制备获得的多克隆抗体。该试剂盒中可进一步包括生物素标记的实施例1制备的多克隆抗体、样品稀释液(Sample DiluentBuffer)、抗体稀释液、reagent A、reagent B或PBST溶液。
实施例3
本实施例以检测重组肠激酶样本中毕赤酵母残留蛋白为例，详细描述本发明的检测重组蛋白酶样本中残留宿主蛋白的方法。
取重组肠激酶粉末约20mg，精密称定，加样品稀释液(本发明毕赤酵母宿主蛋白检测试剂盒中的Sample Diluent Buffer为BSA(牛血清蛋白)的水溶液，厂家：CYGNUS，货号：I028)，溶解并稀释制成每1ml约含10mg的溶液，再取上述溶液10μl，加样品稀释液990μl，充分混匀，作为供试品溶液。取解冻后的毕赤酵母宿主蛋白标准品适量，用Sample DiluentBuffer稀释配制成2000ng/ml的毕赤酵母宿主蛋白标准品溶液。取2000ng/ml的毕赤酵母宿主蛋白标准品溶液2ml，加入Sample Diluent Buffer 2ml，混匀，配制成1000ng/ml的毕赤酵母宿主蛋白标准品溶液。按照1000ng/ml的毕赤酵母宿主蛋白标准品溶液的配制方式，逐级倍比稀释成500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.3ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml的毕赤酵母宿主蛋白标准溶液系列，作为标准品溶液。
磁珠的预处理：将IDA-Cobalt磁珠置于涡旋振荡器上充分混匀，按300μl/管分装于1.5ml的洁净离心管中，进行磁性分离，弃去上清液，从磁性分离器上取下离心管；按1ml/管加入Binging buffer(量取PBS缓冲液500ml，加入氯化钠14.62g、咪唑0.34g，充分溶解、混匀)，上下翻转离心管数次，使磁珠重新悬浮，进行磁性分离，移去上清液，重复洗涤两次，移去上清液。
样品处理：分别取各浓度的毕赤酵母宿主蛋白标准品工作液系列、空白溶液、供试品溶液各800μl加入到装有预处理磁珠的离心管中，将离心管置于涡旋振荡器上振荡30min，然后将离心管置于磁性分离器上进行磁性分离，移出上清液至新的离心管中以备后续检测。
测定：用抗体稀释液(称取无水碳酸钠粉末约1.5g，碳酸氢钠约2.9g，加水溶解并定容至1000ml，测定pH值约为9.6)将发明人研发的抗毕赤酵母宿主细胞蛋白的兔源多克隆抗体稀释至240μg/ml，按100μl/well加入至96孔酶标板中，37℃孵育2h，然后倾去液体，于滤纸上拍干；按200μl/well加入封闭液(取雌兔空白血清1.5ml，加入PBST溶液定容至50ml，混匀，临用现配)，4℃封闭过夜，然后倾去液体，拍干；按100μl/well依次加入经IDA-Cobalt磁珠处理的各浓度的毕赤酵母宿主蛋白标准品工作液系列、空白溶液(Sample DiluentBuffer)、供试品溶液，三孔重复，37℃孵育1.5h，然后倾去液体，拍干；按300μl/well加入PBST溶液(取PBS粉末包一包，加水溶解完全并定容至2L，混匀，量取该PBS缓冲液1L，加入吐温-20 500μl，混匀)洗板5次，拍干；按100μl/well加入用Sample Diluent Buffer稀释的生物素标记的抗毕赤酵母宿主蛋白的兔源多克隆抗体(浓度2.2μg/ml)，37℃孵育1h，然后倾去液体，拍干；在二抗稀释液孵育期间，移取免疫染色(非荧光)二抗稀释液10ml，加入SABC-HRP Kit(厂家：碧云天，货号:P0603)中Reagent A 20μl与Reagent B 20μl，室温下(24～28℃)反应30～60min；按300μl/well加入PBST溶液洗板5次，拍干；按100μl/well加入SABC-HRP工作液(Reagent A与Reagent B按照体积比为1：1混合后得到的复合物Streptavidin-Biotin-HRP工作液)，室温下(24～28℃)孵育30min，然后倾去液体，拍干；以300μl/well加入PBST溶液洗板5次，拍干；以200μl/well加入高灵敏度的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)底物，37℃孵育15min；以50μl/well加入终止液(量取浓硫酸54.3ml，加入超纯水稀释并定容至1000ml，摇匀，放冷)，然后于酶标仪以630nm为参比波长，在波长450nm波长处测定吸光度。
根据标准毕赤酵母宿主蛋白浓度和相应的吸光度值，用四参数拟合制作标准曲线，曲线相关系数应不小于0.990，将各批供试品的吸光值代入标准曲线计算供试品中毕赤酵母宿主细胞蛋白的浓度。
实施例4
本实施例对实施例3所能准确检测的定量范围进行确定。
取1.95ng/ml～2000ng/ml的毕赤酵母的宿主蛋白标准品工作液，按实施例3中的测定方法，每份溶液平行加样两孔，测定吸光度值，根据每个浓度的吸光度值和浓度进行四参数拟合，报告各浓度点的实际浓度和吸光度值，结果如表3所示。
表3：
Figure BDA0002410962700000101
四参数拟合曲线图如图7。
四参数拟合方程：
Figure BDA0002410962700000102
相关系数r：r＝0.998
结论：结果表明标准品的蛋白浓度在1.95～2000ng/ml之间时，曲线计算结果与真实浓度值能够拟合，相关系数r，满足要求，因此该方法检测的定量范围可确定为1.95～2000ng/ml。
实施例5
本实施例对实施例3方法的专属性进行验证。
取1.953ng/ml的毕赤酵母的宿主蛋白标准品、12.5ng/ml供试品加标溶液、供试品溶液(0.1mg/ml重组肠激酶溶液)和空白溶液(即Sample Diluent Buffer)按实施例3中的测定方法测定OD值。
表4：
Figure BDA0002410962700000111
实施例6
本实施例对实施例3方法的准确度进行验证。
取150ng/ml(150％)、100ng/ml(100％)、50ng/ml(50％)准确度溶液各3份、供试品溶液2份(0.1mg/ml重组肠激酶溶液)，每份溶液平行加样两孔，按实施例3中的测定方法测定，将测得的吸光值代入标准曲线中，计算加标的回收率，报告各浓度点的宿主蛋白的浓度的实际测得值、孔间CV值、理论值、回收率单值、平均回收率、各浓度点回收率的RSD值及其95％的置信区间。
表5：
Figure BDA0002410962700000112
Figure BDA0002410962700000121
实施例7
本实施例对实施例3方法的孔间精密度进行验证。
取1.953ng/ml的毕赤酵母的宿主蛋白标准品溶液按实施例3中的测定方法测定，平行加样6孔，将测得的吸光值代入标准曲线中，报告各孔孔间精密度溶液的宿主蛋白的浓度实际测定值，并计算其RSD值。
表6：
Figure BDA0002410962700000122
实施例8
本实施例对实施例3方法的精密度进行验证。
分别配置100ng/ml(100％)准确度溶液6份，按实施例3中的测定方法测定平行加样2孔，将测得的吸光值代入标准曲线中，报告方法精密度溶液的宿主蛋白实际测定值、孔间CV值，宿主蛋白的测定均值、RSD值。
表7：
Figure BDA0002410962700000123
Figure BDA0002410962700000131
实施例9
本实施例对实施例3方法的定量限进行验证。
取50ng/ml(50％)、25ng/ml(25％)、12.5ng/ml(12.5％)准确度溶液各3份、供试品溶液2份(0.1mg/ml重组肠激酶溶液)，按实施例3中的测定方法测定，每份溶液平行加样两孔，将测得的吸光值代入标准曲线，计算加标的回收率，报告各浓度点的宿主蛋白的浓度的实际测得值、孔间CV值、理论值、回收率单值、各浓度点组的平均回收率及回收率的RSD值、LOQ值。
表8：
Figure BDA0002410962700000132
实施例10
本实施例对实施例3方法的检测限进行验证。
取空白溶液按实施例3中的测定方法进行10个复孔的吸光度测定，并求出其标准偏差(SD)，按照计算公式计算求出检测限吸光度(ALOD)，将ALOD其代入标准曲线中求得检测限浓度，并报告检测限值。
表9：
Figure BDA0002410962700000141
ALOD＝空白溶液吸光度平均值+2SD
注：该公式参考Cygnus Technologies,Inc.E.coli HCP ELISA AssayValidation Summary(F410)
实施例11
本实施例比较了现有试剂盒与自研试剂盒(对应实施例3中测定方法)对重组肠激酶的毕赤酵母的宿主蛋白的残留检测的回收率。
取100ng/ml(100％)准确度溶液、供试品溶液2份(0.1mg/ml重组肠激酶溶液)按照Cygnus(F640)毕赤酵母宿主蛋白残留检测试剂盒说明书测定方法、ArrayBridge毕赤酵母宿主蛋白残留检测试剂盒说明书测定方法、实施例3中测定方法(无IDA-Cobalt磁珠前处理)、IDA-Cobalt磁珠前处理后按Cygnus(F640)毕赤酵母宿主蛋白残留检测试剂盒说明书测定方法、实施例3中测定方法进行测定。
表10：
Figure BDA0002410962700000142
Figure BDA0002410962700000151
对比各厂家对重组肠激酶的毕赤酵母的宿主蛋白的残留检测的100％准确度的回收率，使用本实验室自研试剂盒-IDA-Cobalt磁珠处理样本时，其加标回收率符合检测标准(70～130％)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (17)

1.一种宿主蛋白残留的检测试剂盒，其特征在于，包括：
多克隆抗体以及任选的生物标记的多克隆抗体，所述多克隆抗体特异性识别所述宿主蛋白；
其中，所述多克隆抗体是通过如下方式获得的：
利用抗原对第一待免疫动物进行主动免疫，以便获得第一含有抗体的血清；
利用所述第一含有抗体的血清对第二待免疫动物进行被动免疫，以便获得第二含有抗体的血清；
将含有第二抗体的血清进行纯化处理，以便获得第二抗体，所述多克隆抗体包括所述第二抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括将第一含有抗体的血清进行纯化处理，以便获得第一抗体；
将第一抗体与所述第二抗体混合，以便获得所述多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原为细胞全蛋白HCPs，任选地，所述抗原为发酵工程菌HCPs，任选地，所述抗原为毕赤酵母HCPs，任选地，所述第一待免疫动物和/或第二待免疫动物为新西兰大白兔。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进行被动免疫前，进一步包括将所述第一含有抗体的血清进行稀释处理，任选地，所述稀释处理的倍数为2～4倍，优选地，3倍。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，当血清中抗体滴度至少达到50万时，分别对第一含有抗体的血清和第二含有抗体的血清进行纯化处理；
优选地，血清中抗体滴度不超过400万。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗原与所述第一待免疫动物个体的质量比1:1～3:2。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一含有抗体的血清与所述第二待免疫动物个体的体积质量比为1:20～1:90。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括抗体稀释液、样品稀释液、reagent A、reagent B或PBST溶液；
任选地，所述抗体稀释液为碳酸钠和碳酸氢钠的水溶液，所述抗体稀释液的pH为9.5～9.7；
任选地，所述样品稀释液为BSA的水溶液，所述样品稀释液的pH为7.2～7.4；
任选地，所述reagent A为Streptavidin；
任选地，所述reagent B为Biotin-HRP；
任选地，所述PBST溶液为PBS和吐温-20的水溶液。
9.一种检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法，其特征在于，利用权利要求1～8任一项所述的试剂盒，对待测样品按照预定操作进行孵育处理；
将孵育处理后的待测样品进行酶标检测，以便获得吸光值；
基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的宿主蛋白残留量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述对待测样品按照预定操作进行孵育处理包括：
(1)利用多克隆抗体对酶标板进行覆盖处理；
(2)利用封闭液对覆盖处理后的酶标板进行封闭处理；
(3)将待测样品加入封闭处理后的酶标板中进行第一孵育处理；
(4)将第一孵育处理后的酶标板进行第一清洗处理；
(5)将生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理；
(6)将第二孵育处理后的酶标板进行第二清洗处理；
(7)将SABC-HRP工作液加入第二清洗处理后的酶标板进行第三孵育处理；
(8)将第三孵育处理后的酶标板进行第三清洗处理；
(9)将第三清洗处理产物进行显色反应。
11.一种检测待测样品中毕赤酵母宿主蛋白残留的方法，其特征在于，
(1)利用多克隆抗体对酶标板进行覆盖处理；
(2)利用封闭液对覆盖处理后的酶标板进行封闭处理；
(3)将待测样品加入封闭处理后的酶标板中进行第一孵育处理；
(4)将第一孵育处理后的酶标板进行第一清洗处理；
(5)将生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理；
(6)将第二孵育处理后的酶标板进行第二清洗处理；
(7)将SABC-HRP工作液加入第二清洗处理后的酶标板进行第三孵育处理；
(8)将第三孵育处理后的酶标板进行第三清洗处理；
(9)将第三清洗处理产物进行显色反应。
(10)利用终止液终止显色反应；
(11)将终止显色反应后的酶标板进行酶标检测，以便获得吸光值；
(12)基于所获得的吸光值以及吸光值-蛋白浓度标准曲线，获得所述待测样品中的宿主蛋白残留量，
其中，所述多克隆抗体如权利要求1～8任一项所限定的。
12.根据权利要求9～11任一项所述的方法，其特征在于，所述待测样品为重组肠激酶。
13.根据权利要求9～11任一项所述的方法，其特征在于，所述宿主蛋白残留量为毕赤酵母宿主蛋白残留量。
14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述待测样品预先进行HIS标签去除处理。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述HIS标签去除处理是通过IDA-Cobalt磁珠纯化进行的。
16.根据权利要求10～11任一项所述的方法，其特征在于，利用230μg/ml～250μg/ml的所述多克隆抗体对所述酶标板进行覆盖处理。
17.根据权利要求10～11任一项所述的方法，其特征在于，将1.8μg/ml～3.0μg/ml生物素标记的多克隆抗体加入第一清洗处理后的酶标板进行第二孵育处理。
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