CN113968853B

CN113968853B - 阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN113968853B
Application number: CN202010714543.5A
Authority: CN
Inventors: 江海洋; 沈建忠; 丁双阳; 王梓乐; 郑丕苗; 温凯
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-09-16
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN113968853A

Abstract

本发明公开了一种阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。所述阿托品类生物碱半抗原的结构式如式I所示，按照下述方法制备：1)以吡啶作为溶剂，托品醇与琥珀酸酐进行反应；2)向步骤1)反应后的反应液中再次加入所述琥珀酸酐，进行搅拌，即得所述阿托品类生物碱半抗原。可采用活泼酯法将载体蛋白偶联于半抗原的羧基碳上得到阿托品类生物碱人工抗原。本发明还提供了一种阿托品类生物碱的单克隆抗体，通过阿托品类生物碱人工抗原免疫实验动物(雌性BALB/c小鼠)，经过细胞融合、筛选和体外诱生得到。阿托品类生物碱的单克隆抗体可用于制备阿托品类生物碱检测试剂或试剂盒。本发明在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

Description

阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用，属于食品安全领域。

背景技术

阿托品类生物碱主要是由曼陀罗、天仙子等茄科植物产生的次生代谢物，它们是一种基于托烷环与各种酸酯化形成的化合物，主要包括阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱等。阿托品类生物碱本质是M-胆碱受体阻断剂，它们可以拮抗乙酰胆碱或其拟似药的毒蕈碱样作用，在临床上具有广泛应用。然而其毒理作用与药理作用密切相关，正常剂量用药，不会引起动物产生不良反应，且由于代谢迅速，几乎不会残留在动物组织中，但若涉及食用经茄科植物混入污染的饲料或没有严格遵守用药剂量规定，可能会导致动物在极短的时间内出现高热、口舌干燥、视力模糊、胃肠动力低下以及狂躁等不良反应，严重时甚至死亡。此外，在屠宰前通过静脉将大量的阿托品类生物碱注射给动物以谋求更高经济利益的非法行为，不仅会造成动物产生不良反应，这一行为还将造成该类生物碱在动物组织中的大量残留，并通过食物链对消费者的身体健康造成严重威胁。

我国GB 31650-2019号文件中对阿托品和东莨菪碱作出了规定，在推荐治疗剂量下，阿托品可用于所有食品动物且不需要制定最高残留限量，东莨菪碱可用于牛、羊、猪，也不需要制定最高残留限量。欧盟也表明在良好规范用药的前提下不需要为阿托品类生物碱制定残留限量。然而近年来，鉴于过量摄入阿托品类生物碱引发的中毒事件的频频发生，欧洲食品安全局(EFSA)对食品和饲料中的阿托品类生物碱进行了一次风险评估，将阿托品与东莨菪碱的急性参考总剂量定为0.016μg/kg，并建议各个国家对食品中阿托品和东莨菪碱的污染水平给予更加科学的关注。在此背景下，2015年欧盟委员会规定农产品中阿托品和东莨菪碱的含量最好低于5μg/kg，不得超过10μg/kg，配料、食品补充剂、凉茶以及各种加工食品中的含量不得高于2μg/kg。2016年，欧盟在欧洲议会上通过了婴儿食品中阿托品和东莨菪碱的法定限量为1μg/kg的规定。即使作为药物，在正常治疗剂量的情况下使用几乎不会造成动物组织中的残留，但随着动物养殖过程中阿托品类生物碱非法使用行为的出现，对阿托品类生物碱残留进行监测是具有极大的现实意义和必要性的。

目前，仪器方法是最多应用于阿托品类生物碱检测的方法。仪器方法最大的优点在于其具有足够的灵敏度和准确性，但是仪器价格昂贵，对检测环境以及操作人员的专业性要求较高，并且需要复杂的前处理程序，因此仪器方法并不能适应多种类、大量样本的初步筛查或是动物源性食品全产业链多环节的残留快速筛查，而以抗原抗体特异性识别反应为核心的免疫学方法更能够适应这一需求。近年来，免疫学方法因具有操作简便、检测快速、准确性高、灵敏度高、检测成本低、对操作者的要求低等优势，逐渐成为兽药残留确证前大批量样本初步筛查的有力工具。因此，建立能够同时检测多种阿托品类生物碱残留的免疫学方法对于从动物源性食品生产链多个环节进行残留监测，避免人体暴露具有极好的现实意义和应用价值。

因此设计免疫半抗原分子，开发一种简单、快捷、用于多种阿托品类生物碱检测的抗体显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种阿托品类生物碱半抗原、人工抗原及其制备方法与应用。

本发明所提供的阿托品类生物碱半抗原，其结构式如式I所示；

所述阿托品类生物碱半抗原可按照下述制备方法制备：

1)以吡啶作为溶剂，托品醇与琥珀酸酐进行反应；

2)为使反应充分，向步骤1)反应后的反应液中再次加入所述琥珀酸酐，进行搅拌，即得所述阿托品类生物碱半抗原。

上述的制备方法中，步骤1)中，所述托品醇与所述琥珀酸酐的摩尔比为1：1～1.1，优选1:1.1；

所述反应的温度为40～70℃，所述反应的时间为12～24h，如在70℃下反应24h；

步骤2)中，添加的所述琥珀酸酐与所述托品醇的摩尔比为0.1～0.2:1，优选0.1:1；

所述搅拌的时间为6～12h；

所述搅拌结束后可于通风橱中氮吹除去大部分吡啶后静置使其自然挥发，形成褐色结晶，无须纯化。

本发明还提供了一种阿托品类生物碱人工抗原，由所述阿托品类生物碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；

所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中任一种，优选牛血清白蛋白或钥孔血蓝蛋白；

所述阿托品类生物碱半抗原与所述载体蛋白的偶联摩尔比约为9：1；

所述阿托品类生物碱人工抗原可以作为免疫原也可以作为包被原。

可采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于所述半抗原的羧基碳上得到所述阿托品类生物碱人工抗原。

所述阿托品类生物碱半抗原或所述阿托品类生物碱人工抗原具有下述应用：

1)制备抗阿托品类生物碱抗体；

2)检测食品或饲料中阿托品类生物碱的残留。

本发明还提供了一种阿托品类生物碱的单克隆抗体，通过所述阿托品类生物碱人工抗原免疫实验动物(雌性BALB/c小鼠)，经过细胞融合、筛选和体外诱生得到。

所述阿托品类生物碱的单克隆抗体可用于制备阿托品类生物碱检测试剂或试剂盒。

所述阿托品类生物碱的单克隆抗体具有下述应用：

1)阿托品类生物碱的免疫检测；

2)阿托品类生物碱免疫层析试纸条的制备；

3)阿托品类生物碱的胶体金检测试纸条的制备。

本发明提供了阿托品类生物碱半抗原、人工抗原及其制备方法，采用所述阿托品类生物碱人工抗原免疫动物，可得到效价高，灵敏度高并且可以同时识别阿托品(Atropine，ATR)、东莨菪碱(Scopolamine，SCO)、山莨菪碱(Anisodamine，ANI)、樟柳碱(Anisodine，ANS)、L-天仙子胺(L-Hyoscyamine，LHY)、后马托品(Homatropine，HOM)、阿朴阿托品(Apoatropine，APO)的广谱性抗体。本发明提供的阿托品类生物碱半抗原及其制备的抗体，为建立快速、简便、价廉、灵敏的同时检测多种阿托品类生物碱残留的方法提供了新手段。

本发明提供的半抗原制备方法简单，与载体蛋白的偶联物制备的单克隆抗体抗体对ATR、SCO、HOM、APO、L-天仙子胺、ANI、ANS的检测灵敏度可分别达0.05、0.24、0.07、0.14、0.14、4.93、15.52μg kg^-1，实用价值高。本发明在兽药残留检测中具有良好的应用前景。

附图说明

图1为制备本发明式I所示阿托品类生物碱半抗原的反应方程式。

图2为本发明式I所示阿托品类生物碱半抗原的质谱图。

图3为本发明半抗原与牛血清白蛋白的偶联物的MALDI-TOF-MS图，其中，图3(A)为牛血清白蛋白的MALDI-TOF-MS图，图3(B)为偶联物的MALDI-TOF-MS图。

图4为本发明利用单克隆抗体检测7种阿托品类生物碱的标准曲线图，其中，图4(A)-图4(G)依次表示检测ATR、SCO、HOM、APO、L-天仙子胺、ANI和ANS的标准曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的PBS缓冲液均为pH 7.4、0.01M的PBS缓冲液。

下述实施例中所用的碳酸盐缓冲液均为pH 9.6、0.05mol/L的碳酸钠缓冲液。

下述实施例中，NHS为N-羟基琥珀酰亚胺的缩写，EDC为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的缩写，DMF为N,N-二甲基甲酰胺的缩写，NHS、EDC、牛血清白蛋白(Albumin from bovine serum,BSA)、钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)、卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)以及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购自Sigma公司。

实施例1、阿托品类生物碱半抗原的制备和表征

一、阿托品类生物碱半抗原的制备

式I所示阿托品类生物碱半抗原的制备，反应方程式如图1所示。

第一步：反应以吡啶作溶剂，1eq托品醇标准品与1.1eq琥珀酸酐混合，溶解于5mL圆底烧瓶中，安装回流装置，置于70℃油浴，磁力搅拌24h。

第二步：向反应液中再添加0.1eq琥珀酸酐，600r/min搅拌6h后，于通风橱中氮吹除去大部分吡啶后静置使其自然挥发，形成褐色结晶，无须纯化。

二、阿托品类生物碱半抗原的表征

质谱鉴定：式I所示阿托品类生物碱半抗原的质谱鉴定结果：MS m/z[M+H]⁺理论值：242.28；实测值：242.13，与目标产物的分子量相吻合，质谱如图2所示。

实施例2、阿托品类生物碱人工抗原的制备和表征

免疫原与包被原的制备方法中，其区别在于载体蛋白的使用类型，免疫原载体蛋白主要采用BSA与KLH，包被原载体蛋白主要采用OVA，所用偶联方法为活泼酯法。

一、阿托品类生物碱人工抗原的合成和鉴定

1、阿托品类生物碱人工抗原的制备

(1)以半抗原与BSA投料比1：100计算，然后按照半抗原：EDC：NHS＝2:3:3的摩尔质量比精确称取半抗原7.3mg，EDC 8.6mg，NHS 5.2mg分别溶解于1mL DMF中，置于磁力搅拌器上活化16h，即为溶液I。

(2)然后将20mg KLH、BSA、OVA分别溶解于10mL PBS中，放入-20℃冰箱中预冷后置于磁力搅拌器上搅拌，即为溶液II。

(3)将溶液I缓慢滴加至溶液II中，缓慢4℃搅拌24h后装入透析袋，在PBS中4℃透析72h(中间换水6次)，得到阿托品类生物碱人工抗原，-20℃保存。简称TRO-HS-BSA、TRO-HS-KLH、TRO-HS-OVA。

2、阿托品类生物碱人工抗原的鉴定

用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry,MALDI-TOF-MS)法测定TRO-HS-BSA溶液中BSA与半抗原的结合比。结果见图3。

结合比＝{M(偶联物)-M(蛋白质)}/M(半抗原)

BSA的分子量为66416.50，式I所示半抗原的分子量为241.13，由质谱最高峰值分析偶联物的分子量为68541.06，经计算得出BSA与半抗原的结合比为8.8，即TRO-HS-BSA中一个BSA分子上平均偶联8.8个半抗原。

实施例3、阿托品类生物碱单克隆抗体的制备

将实施例2制备的TRO-HS-BSA与TRO-HS-KLH两种人工抗原分别免疫8只6～8周龄BALB/c雌性小鼠。使用0.01M PBS将各免疫原用稀释至1mg/mL，与等量的弗氏佐剂乳化，形成油包水结构。除首免采用弗氏完全佐剂外，其余加强免疫一律采用弗氏不完全佐剂，免疫剂量为100μg/只，颈背部皮内多点注射。4周后进行加强免疫并且每隔3周加免1次，共加免2次，改为颈背部皮下多点注射。在两次加免后的7-10天采每只小鼠的眼眶血离心取上清进行测定，选择抗血清效价与抑制均良好的小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，经过三次单细胞团亚克隆后，进行定株及扩大培养，采取体内诱生的方式获得抗体，并使用Protein A免疫亲和柱进行纯化，最后保存于-20℃备用。

实施例4、阿托品类生物碱抗血清的测定

一、采用间接ELISA方法检测抗血清效价

具体操作步骤如下：

1)包被：将实施例2中的人工抗原TRO-HS-OVA用0.05M、pH 9.6碳酸盐缓冲液从15μg/mL进行倍比稀释，100μL/孔，置于37℃恒温培养箱孵育2h，甩干。

2)洗涤：洗涤液280μL/孔，洗涤2次，甩干。

3)封闭：封闭液150μL/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h后，甩干。

4)加样：每孔加入50μL PBS，然后将抗血清从1:1000开始进行倍比稀释，并50μL/孔加入到各稀释度的包被孔中，置于37℃恒温培养箱孵育30min，洗涤3次后甩干；加入1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠抗体，100μL/孔，置于37℃恒温培养箱孵育30min，洗涤5次甩干。

5)显色：每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

6)终止和测定：每孔加入50μL终止液(2M H₂SO₄)，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

7)结果判读：以OD₄₅₀值≥阴性对照孔的2.1倍(即P/N≥2.1)所对应的血清最高稀释倍数即为血清的ELISA效价。

二、最低检测限、半数抑制以及特异性的检测

具体操作步骤如下：

1)用上述间接ELISA方法确定以TRO-HS-OVA作为包被原，以TRO-HS-KLH免疫小鼠进行细胞融合生产抗体，以OD₄₅₀值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。

2)包被：将包被原用包被缓冲液稀释243000倍，100μL/孔，置于37℃恒温培养箱孵育2h。

3)洗涤和封闭：方法操作同上述间接ELISA法。

4)分别配置阿托品类生物碱标准溶液：将7种生物碱标准品用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液配制成2mg/mL的母液，然后，在加样前，再用0.01mol/L，pH7.4的PBS溶液倍比稀释成梯度为0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29μg/L的ATR、APO、HOM与L-天仙子胺标准溶液，梯度为0、0.03、0.09、0.27、0.81、2.43、7.29、21.87μg/L SCO标准溶液，梯度为0、0.3、0.9、2.7、8.1、24.3、72.9、218.7μg/L ANI和ANS标准溶液。

5)加样：每孔加入50μL倍比稀释的各浓度标准品，然后再加入50μL/孔最适稀释倍数的抗体，37℃反应30min。充分洗涤后，加入1：5000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100μL/孔，37℃反应30min。

6)显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μL的TMB显色液，37℃避光反应15min。

7)终止和测定：每孔加入50μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD₄₅₀值。

8)数据处理：以各标准品浓度为横坐标，以各浓度对应的OD_450nm值为纵坐标，使用Origin软件，按照四参数对数拟合绘制标准曲线，如图4所示，通过计算IC₅₀值(半数抑制浓度)判定抗体对阿托品类生物碱是否具有识别。

结果显示，所获得单克隆抗体对ATR、SCO、HOM、APO、L-天仙子胺、ANI、ANS的检测灵敏度可分别达0.05、0.24、0.07、0.14、0.14、4.93、15.52μg kg^-1。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.式I所示阿托品类生物碱半抗原；

2.权利要求1所述阿托品类生物碱半抗原的制备方法，包括如下步骤：

1)以吡啶作为溶剂，托品醇与琥珀酸酐进行反应；

2)向步骤1)反应后的反应液中再次加入所述琥珀酸酐，进行搅拌，即得所述阿托品类生物碱半抗原。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述托品醇与所述琥珀酸酐的摩尔比为1：1～1.1；

所述反应的温度为40～70℃，所述反应的时间为12～24h；

步骤2)中，添加的所述琥珀酸酐与所述托品醇的摩尔比为0.1～0.2:1；

所述搅拌的时间为6～12h。

4.一种阿托品类生物碱人工抗原，由权利要求1所述阿托品类生物碱半抗原与载体蛋白偶联后得到；

所述载体蛋白选自牛血清白蛋白、卵清蛋白和钥孔血蓝蛋白中任一种。

5.权利要求4所述阿托品类生物碱人工抗原的制备方法，包括如下步骤：

采用活泼酯法将所述载体蛋白偶联于权利要求1所述半抗原的羧基碳上即得。

6.权利要求1所述阿托品类生物碱半抗原或权利要求4所述阿托品类生物碱人工抗原在下述1)或2)中的应用：

1)制备抗阿托品类生物碱抗体；

2)检测食品或饲料中阿托品类生物碱的残留。

7.由权利要求4所述阿托品类生物碱人工抗原制备得到的阿托品类生物碱的单克隆抗体。

8.由权利要求7所述阿托品类生物碱的单克隆抗体制备的阿托品类生物碱检测试剂或试剂盒。

9.权利要求7所述阿托品类生物碱的单克隆抗体在下述1)-3)中任一种中的应用：

1)阿托品类生物碱的免疫检测；

2)阿托品类生物碱的免疫层析试纸条的制备；

3)阿托品类生物碱的胶体金检测试纸条的制备。

10.根据权利要求6或9所述的应用，其特征在于：所述抗阿托品类生物碱为阿托品、东莨菪碱、山莨菪碱、樟柳碱、L-天仙子胺、后马托品和阿朴阿托品中至少一种。