DE2166716C3 - Opiumalkaloid-Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents
Opiumalkaloid-Antigene und Verfahren zu ihrer HerstellungInfo
- Publication number
- DE2166716C3 DE2166716C3 DE2166716A DE2166716A DE2166716C3 DE 2166716 C3 DE2166716 C3 DE 2166716C3 DE 2166716 A DE2166716 A DE 2166716A DE 2166716 A DE2166716 A DE 2166716A DE 2166716 C3 DE2166716 C3 DE 2166716C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- opium alkaloid
- protein
- opium
- alkaloid
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
- A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
- A61K47/643—Albumins, e.g. HSA, BSA, ovalbumin or a Keyhole Limpet Hemocyanin [KHL]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft Opiumalkaloid-Antigene und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Die große Zunahme des Verbrauchs von Narkotika einschließlich der Opiumalkaloide durch die Bevölkerung
im allgemeinen hat das Bedürfnis mit sich gebracht, analytische Arbeitsweisen für die Bestimmung solcher
Substanzen in biologischen Fluida zu verbessern. In vielen Fällen sind medizinische Behandlungszentren
gezwungen, die Identität eines von einem Patienten genommenen Narkotikums zu bestimmen, welcher sich
in einem komatösen Zustand befindet und daher unfähig ist, eine solche Information dem behandelnden Arzt zu
liefern. Gegenwärtige Verfahren für die Identifizierung
κι von Opiumaikaloiden erfordern Extraktions- und
Dünnschichtchromatographieverfahren. Diese Arbeitsweisen haben den Nachteil, einen verhältnismäßig
großen Zeitaufwand zu erfordern, mühselig und wenig empfindlich zu sein. Eine schnellere und hochwirksame
r, Prüfung auf die Anwesenheit von Opiumaikaloiden in
biologischen Fluida würde daher einen außergewöhnlich wichtigen technischen Fortschritt bedeuten.
Es ist bereits bekannt, daß verschiedene kleine Moleküle (Haptene), welche an sich völlig frei von
'η Antigenwirkung sind, die Antigeneigenschaften eines
Proteins modifizieren können, wenn das kleine Molekül kombiniert wird mit dem Protein durch stabile
kovalente Bindungen. So offenbart die US-Patentschrift No. 23 72 066, daß Antigene hergestellt werden können
j-, durch Kombinieren von Histaminen oder histaminartigen
Verbindungen mittels Bindung des Imidazolrings an ein gewünschtes Protein durch ein Radikal, welches eine
Gruppe enthält die mit dem Protein kuppeln kann. Diese Antigene werden verwendet entweder durch
in direkte Injektion in ein Lebewesen, wodurch Resistenz,
Widerstandsfähigkeit oder aktive Immunität in diesem Lebewesen entwickelt wird, oder durch Injektion in
Gasttiere, aus welchen für den Haptenteil spezifische Antikörper, z. B. das Histamin oder die histaminartige
ο Substanz, entwickelt werden. In ähnlicher Weise
offenbart Landsteiner in »Specificity of Serological Reactions«, Harvard University Press, Cambridge,
Massachusetts (1945) die Verwendung von p-Aminobenzolarsonsäure als ein Hapten, welches, wenn an ein
κι Protein gekuppelt, imstande war, spezifische Antikörper
in einem Gasttier zu erzeugen.
Die neuen erfindungsgemäßen Antigene bestehen aus einem Opiumalkaloidhaptentcil, gekuppelt an ein
immunogenes Trägermaterial. In bevorzugten Ausfüh-
i, rungsformen ist das Opiumalkaloid kovalent an ein
Proteinmolekül durch eine Carboxy-nieder-Alkyl-Bindungsgruppe
über eine Peptidbindung gekuppelt. Diese Peptidbindung umfaßt die Aminogruppe des Proteinmoleküls
und die Carboxygruppe der Carboxy-nieder-
Ii Alkyl-Bindungsgruppe. Diese Bindungsgruppe ist an das
Opiumalkaloid als ein Derivat der phenolischen Hydroxylgruppe gebunden.
Der hier benutzte Ausdruck »nieder Alkyl« soll gerad- oder verzweigtkettige, gesättigte Kohlenwasser-
,, Stoffreste mit I bis 6 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Äthyl, Propyl u. dgl. umfassen.
Der Ausdruck »Trägermaterial« soll solche Materialien einschließen, welche die Eigenschaft haben,
unabhängig eine immunogene Wirkung in einem
wi Gasttier, wenn in ein solches injiziert, hervorzurufen,
und welche durch kovalente Bindung an das Opiumalkaloidhapten gekuppelt werden können. Geeignete
Trägermaterialien sind beispielsweise Proteine; natürliche oder synthetische polymere Verbindungen wie
μ·. Polypeptide z.B. Polylsin; Polysaccharide; u.dgl. Ein
besonders bevorzugtes Trägermaterial für die Praxis der Erfindung ist Protein.
Die Identität des Protein-Trägermalerials, wie es bei
der Zubereitung des bevorzugten erfindungsgemäßen Antigens benutzt wird, ist nicht kritisch. Beispiele von
für die Praxis der Erfindung brauchbaren bevorzugten Proteinen sind die Serumproteine, vorzugsweise Säugetierproteine,
wie z. B. menschliches Gammaglobulin, menschliches Serumalbumin, Kaninchenserumalbumin,
Rindergammaglobulin und Rinderserumalbumin. Andere geeignete Proteinprodukte ergeben sich leicht für
den Fachmann. Im allgemeinen wird bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches für das Gasttier fremd
ist, in welchem das sich ergebende Antigen angewandt werden soll.
Das bei der Praxis der Erfindung besonders bevorzugte Opiumalkaloid ist Morphin. Andere erfindungsgemäß
brauchbare Opiumalkaloide sind beispielsweise Heroin und Codein und deren Derivate, welche
die phenolische Hydroxygruppe nicht beeinflussen. Es wurde gefunden, daß die Antikörper, welche durch die
Verwendung eines Morphinhapten-Protein-Antigens erzeugt werden, spezifisch nicht nur für das Morphin,
sondern auch für nahe verwand te Derivate, z. B. für das Codein und in geringerem Ausmaß für Nalorphin, sind.
Die erste Stufe der Herstellung des bevorzugten erfindungsgemäßen Antigens umfaßt das Überführen
des Opiumalkaloids in das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat
der phenolischen Hydroxygruppe des Alkaloids. Dies wird am zweckmäßigsten bewerkstelligt durch
Umsetzen der freien Base des Alkaloids mit einem Alkalisalz einer Halo-nieder-Alkansäure mit 1—7,
vorzugsweise I —4 Kohlenstoffatomen. Geeignete Halo-nieder-AIkansäuren für diesen Zweck sind /J-Haloessigsäure,
y-Halopropionsäiire, O-Halobuttersäure
u. dgl.
Die für die Ausführung der Erfindung brauchbaren Alkaiisalze der vorgenannten Haloalkansäuren schlie-Ben
die Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze ein, das Natriumsalz wird bevorzugt. Haloderivate der erwähnten
Alkansäuren umfassen die Chlor-, Brom-, Jod- und Fluorderivate. Bei der bevorzugtesten Ausführungsform
der Erfindung wird die freie Morphinbase in ihr 3-O-Carboxymethylderivat durclh Umsetzen mit Natrium-/?-chloracetat
übergeführt. Die erwähnte allgemeine Reaktion wird durch ihre Ausführung in Gegenwart
eines geeigneten inerten organischen Lösungsmittels, z.B. eines niederen Alkanols, wie Äthanol erleichtert.
Am besten ist das Lösungsmittelsystem wasserfrei und daher wird ein absolutes niederes Alkanol verwendet.
Für die Zwecke der Erfindung soll der Ausdruck niederes Alkanol gerad- und verzweigtkettige Alkenole
mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen umfassen.
Die Reaktion, welche die Carboxy-nieder-Alkylgruppe in das Opiumalkaloidmolekül einführt, kann zweckmäßigerweise
bei einer Temperatur zwischen etwa Raumtemperatur bis zu etwa 50"C ausgeführt werden,
obwohl höhere oder niedere Temperaturen gewünschtenfalls angewendet werden können. Bei bevorzugten
Ausführungsweisen wird Raumtemperatur für diese Reaktion angewendet.
Die Kupplung des Carboxy-nieder-Alkyl-Derivats
des Opiumalkaloids mit einem Protein zwecks Bildung des bevorzugten Antigens der Erfindung kann unter
Anwendung wohlbekannter Methoden der Proteinchemie zur Bildung von Peptidbindungen leicht bewerkstelligt
werden. So wird beispielsweise nach einer solchen Methode das Protein und ein wasserlösliches Kupplungsagens
in Wasser gelöst und anschließend wird ein großer molarer Überschuß des gewünschten Carboxynieder-Alkyl-Opiumalkaloidderivats
zugesetzt. Diese Reaktion kann bei einer Temperatur von etwa 0°C bis
etwa 5O0C ausgeführt werden, obwohl höhere oder niedrigere Temperaturen in Abhängigkeit von der Art
der Reaktanten und der Denaturisierungstemperatur des Proteins angewendet werden können. Am meisten
bevorzugt wird Raumtemperatur. Es ist erwünscht, ein schwach saures Reaktionsmedium, ζ B. ein Medium mit
einem pH im Bereich von etwa 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6,5, z. B. 5,5, anzuwenden. Geeignete wasserlösliche
Kupplungsmittel zur erfindungsgemäßen Verwendung sind z. B. wasserlösliche Carbodiimide, wie l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropylj-carbodiimid.
Nach Beendigung der obigen Kupplungsreaktion können überschüssige Haptenmoleküle und Kupplungsmittel
durch Dialyse entfernt werden. Die Dialyse kann überwacht werden durch Kontrolle des Dialysats auf die
Anwesenheit von Hapten oder Kupplungsmittel, oder stattdessen kann die Dialyse während einer vorbestimmten
Zeitperiode, z. B. 7 Tagen, durchgeführt werden. Die Dialyse wird mit destilliertem Wasser
durchgeführt, welches vorzugsweise vier- oder fünfmal pro Tag ausgewechselt wird. Gereinigtes Antigen wird
als Rückstand in dem Dialysebeutel gewonnen.
Außer Wasser können andere geeignete Lösungsmedien bei der obigen Reaktion verwendet werden,
beispielsweise 0,15 M Salzlösung (NCl), eine Ό.15Μ
Salzlösung, gepuffert mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4) oder eine 0,01 M Phosphatpufferlösung. Das
Reaktionsgemisch wird auf den gewünschten pH-Bereich durch Zusatz von verdünnter wäßriger Säure, z. B.
IN HCI gebracht. Lösungsmittel, welche Proteine denaturieren, z. B. organische Lösungsmittel wie Alkohole,
Äther usw., oder starke anorganische Säuren oder Basen, z. B. Mineralsäuren oder Alkalihydroxyde, sollten
im allgemeinen nicht gebraucht werden.
Die Höhe des molaren Überschusses an Hapten über das Protein bei der vorgenannten Reaktion wird
naturgemäß von der Identität des benutzten Opiumalkaloidderivats und dem für die Reaktion ausgewählten
Protein abhängen. Im aligemeinen wird ein molarer Überschuß im Bereich von etwa 30 bis 10 000, am
bevorzugtesten im Bereich von etwa 100 bis 1000 des Haptens in bezug auf das Protein angewendet.
Es wird im allgemeinen gefunden, daß etwa 3 bis 7 Opiumalkaloidderivatgruppen an ein Molekül des
Proteins addiert werden, in Abhängigkeit naturgemäß von der Menge des molaren Überschusses des
angewendeten Haptens. Beispielsweise werden drei bis vier Carboxymethylmorphingruppen an ein Molekül
Rinderserumalbumin (angenommenes Molekulargewicht dieses Proteins 70 000) addiert werden, wenn ein
100 molarer Überschuß des Haptens angewendet wird.
Es wird angenommen, daß die Reaktionssequenz, wie sie bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Antigens
angewendet wird, durch das folgende Reaktionsschema erläutert werden kann, worin 3-O-Carboxymethylmorphin
als beispielhafte Haptengruppe benutzt wird.
X ( ll,)„( (H) M
N CII1
Älhanol
HOOC(CH2),, --O
' N- CH,
HO
Protein-- NH2
R- N=C=N R'(carbodiimid)
O
Il
Protein —NH-C- (CH,),, O
Protein —NH-C- (CH,),, O
°xJJnch,
HO
Antigen
X bedeutet Halogen, M ist ein Alkalimetall und η ist eine ganze Zahl von 1 bis 6.
Das erfindungsgemäße Antigen kann dann verwendet werden, um Bildung spezifischer Opiumalkaloidantikörper
in dem Serum von Gasttieren zu erzeugen, indem das Antigen in einen solchen Gast wiederholt über eine
Zeitperiode injiziert wird, das Serum gesammelt, der Antikörper mit einer neutralen Salzlösung ausgefällt
und gewünschtenfalls der Antikörper durch Dialyse und Säulenchromatographie gereinigt wird.
Geeignete Gasttiere zu diesem Zweck sind Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen,
Ratten, Kühe, Schafe u.dgl. Der sich ergebende Antikörper hat eine Vielzahl aktiver Stellen, welche
selektiv mit Opiumalkaloiden, dem oben beschriebenen
Opiumalkaloidantigen oder nahe verwandten Derivaten komplexieren.
Die Bildung von spezifischen Opiumalkaloidantikörpern in den Gasttieren kann überwacht werden, indem
Blutproben aus dem Gasttier genommen werden und dazu eine Menge des Hapten-Protein-Antigens zügefügt
wird. Die Anwesenheit von Niederschlag zeigt Antikörperaktivität an. Die Antigenbehandlung des
Tieres kann fortgesetzt werden, bis der Antikörpergehalt einen gewünschten Aktivitätsgrad erreicht. Für die
Zwecke dieser Anwendung wird der Antikörpergehalt definiert als die maximal K mzentration an ausgefälltem
Protein im Anschluß an den Zusatz verschiedener bekannter Konzentrationen von Antigenen zu festgelegten
Seriumvolumina, z. B. 0,5 ml.
Die Antikörper können aus dem Serum der behandelten Gasttiere durch Anwendung bekannter
biochemischer Methoden isoliert werden. Beispielsweise können die aus der Behandlung von Gasttieren
erhaltenen Sera mit einem neutralen Salz behandelt werden, welches Fällung der erwünschten spezifischen
Antikörper bewirkt Geeignete neutrale Salze für diesen Zweck sind Natriumsulfat, Magnesiumsulfat eine
Natriumhydrogenphosphaimischung oder Ammoniumsulfat Das bevorzugte neutrale Salz ist Ammoniumsulfat
Nach der Ausfällung können Reinigungsverfahren angewendet werden, wie z. B. Dialyse und Säulenchromatographie.
Der erhaltene Antikörper kann als ein
ίο Gammaglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa
160 000 gekennzeichnet werden. Dieser Antikörper komplexiert mit hohem Spezifitätsgrad mit Opiumalkaloidhaptenen
und daraus stammenden Antigenen.
Die spezifischen Antikörper sind brauchbar als Reagentien in biochemischen Prüfungen zur Bestimmung
der Anwesenheit von Opiumalkaloiden und nahe verwandten Verbindungen in biologischen Fluida. Ein
Prüfungsverfahren ist ein Immunoausfällverfahren, welches benutzt werden kann, um Nanogrammbeträge
eines Opiumalkaloids, z. B. Morphin, im Serum zu messen. Bei einem solchen Verfahren wird eine
bekannte Menge eines markierten Opiumalkaloids mit Opiumalkaloidantikörper und einem Muster vermischt,
welches die unbekannte Menge an Opiumalkaloiden
2-j enthält. Die Menge an Opiumalkaloid in dem Muster
kann bestimmt werden durch Messen des Ausmaßes an konkurrierender Inhibierung, beobachtet zwischen der
Bindung des markierten Opiumalkaloids und dem Opiumalkaloidmuster mit dem spezifischen Opiumalka-
Jd loidantikörper, und dann kann die Menge an Opiumalkaloid
in dem Muster aus einer Standardkurve berechnet werden. Geeignete markierte Opiumalkaloide
für diesen Zweck sind z. B. die isotopisch markierten Opiumalkaloide, insbesondere Tritium-markierte Opiumalkaloide
wie Dihydromorphin-H3 und Morphin-I125.
wie auch Opiumalkaloide, markiert mit einer Elektronen-Spin-Resonanzgruppe. Beispiele der Verwendung
von verschiedenen Elektronen-Spin-Resonanz-markierten Molekülen in Bioprüfungen sind zu finden in den
US-Patentschriften 34 53 288,34 81 952 und 35 07 876.
Beispiel 1
Herstellung von Antigen
Herstellung von Antigen
Morphin wird übergeführt in 3-O-Carboxymethylmorphin
durch Umsetzung der freien Alkaloidbase mit Natrium-jS-chloracetat in absolutem Äthanol gemäß den
in Houben, »Fortschritte der Heilstoffchemie«, 1, 882 (1901) und Beilstein, Band 27, 156 beschriebenen
Verfahren. Das erhaltene Derivat hat nach der Umkristallisation aus heißem absolutem Äthanol einen
Schmelzpunkt von 292-293° C. Die 3-O-Carboxymethylmorphinsäure
ist Dragendorff-positiv und Pauly-negativ und hat ein Rf von 0,6 auf Dünnschichtkieselsäuregel-Chromatogrammen
unter Verwendung von Eisessig : Methanol (1 :1) als Lösungsmittelsystem. In dem
gleichen Lösungsmittelsystem hat Morphin ein Rf von 1,0. Das Carboxymethylmorphin wird gekuppelt an
Rinderserumalbumin (BSA) in wäßriger Lösung in Gegenwart von wasserlöslichem Carbodiimid gemäß
dem folgenden Verfahren. Im ganzen werden 8 mg Carboxymethylmorphin in 2 ml destilliertem Wasser
gelöst, welches 10 mg BSA enthält. Das pH der Mischung wird auf 5,5 mit 1 N HCI eingestellt und 8 mg
1 -Äthyl-i-p-dimethyl-arnino-propyO-carbodiirnid werden
zugesetzt. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und dann 7 Tage gegen
destilliertes Wasser mit vier- bis fünfmaligem Auswech-
sein pro Tag dialysiert. !Conjugate, analysiert durch das
spektrofluormetrische Verfahren von Balatre u. a., Annales Pharm. Franc. 19, 171 (1961), enthielten 3 bis 4
Carboxymethylmorphingruppen pro Molekül BSA (bei Annahme eines Molekulargewichts von 70 000 für das
Protein).
Versuch 1
Herstellung des Antikörpers
Herstellung des Antikörpers
Kaninchen des Neuseeland-Albino-Stammes werden mit 1 mg Carboxymethylmorphin-BSA immunisiert.
Das Immunogen wird in Phosphatpuffersalzlösung von pH 7,4 gelöst, mit einem gleichen Volumen von
vollständigem Freund's-Hilfsmittel emulgiert und in den Fußwulst (0,4 ml/Fußwulst) injiziert. Verstärkungsinjektionen
von 100 μg Antigen im Hilfsmittel werden alle 6-8 Wochen in die Fußwülste und Seiten gegeben.
Antiserum wird 5 — 7 Tage nach den Verstärkungsinjektionen gesammelt. Blut, gesammelt aus Herzpunktur,
wird bei 37°C eine Stunde inkubiert und dann über Nacht bei 4°C gehalten. Nach dem Zentrifugieren mit
5000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten bei 4°C wurde Serum aus dem Klumpen abgetrennt.
Versuch 2
Radioimmunprüfung
Radioimmunprüfung
Die Radioimmunprüfung wird ausgeführt durch Inkubierung verschiedener Verdünnungen von Antiseren,
erhalten gemäß Versuche 2, über Nacht in Gegenwart von Dihydromorphin-H3 (New England
nuclear, 388 mc/mM) 100 Picomolen (4000 cpm) bei 4° C.
Nach der Inkubierung wird eine neutrale gesättigte Ammoniumsulfatlösung (Volumen gleich dem Inkubieningsmedium)
zu allen Röhren zugesetzt Die Ausfällung, abgesetzt durch Zentrifugieren mit 5000 Umdrehungen
pro Minute während 15 Minuten bei 4° C, wird zweimal in 50%iger Ammoniumsulfatlösung gewaschen.
Die gewaschenen Ausfällungen, welche an den Antikörper gebundenes Morphin enthalten, werden in
03 ml eines handelsüblichen Detergens-Solubilisierungsmittels
aufgelöst, qua'ntitativ in ein Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer übertragen
und ausgezählt Die Röhre, welche radioaktives Dihydromorphin und ein Antiserum, aber kein nichtmarkiertes
Morphin enthält, dient als Maß der maximalen, an den Antikörpern gebundenen Radioaktivität
Der Zusatz steigender Mengen an unmarkiertem Morphin zu einer feststehenden Menge an Dihydro-H
und Antiserum führt zu einer konkurrierenden Inhibie rung des markierten Dihydromorphins für die Bildunj
des Antikörper-Hapten-Komplexes. Die erhaltenei Werte folgen in der Tabelle.
Nanogramm nichtradioaktives
Morphin zugesetzt
Morphin zugesetzt
% Inhibierung der Binduni von Dihydromorphin-H3
20
38
50
65
80
38
50
65
80
Die obigen Werte zeigen deutlich die Empfindlichkeil der Methode. Wenn in graphischer Form aufgetragen
geben die in obiger Tabelle enthaltenen Werte ein« lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetzten*
nichtradioaktivem Morphin und der gefundenen Pro zentzahl an Inhibierung. Mit dem Zusatz von 0,£
Nanogramm von nichtmarkiertem Morphin pro Röhre (eine Konzentration von 1 Nanogramm pro ml voi
Zusatz von Ammoniumsulfat) werden 20% des markierten Dihydromorphins aus dem Antikörper verdrängt
Die Spezifität des Antiserums für Morphin wird gezeigt durch Inkubierung des markierten Haptens mit
normalem Kaninchenserum. Die Radioaktivität, welche in einer Ausfällung aus normalem Kaninchenserum nach
dem Waschen zurückbleibt, ist ein wenig oberhalb des Nullwertes und wird von den Werten subtrahiert,
welche bei allen anderen Röhren erhalten werden.
Vergleichsversuche werden mit anderen Alkaloiden durchgeführt Die inhibierende Leistung von Codein,
welches Morphin-3-methyl-äther ist wird mit derjenigen von Morphin verglichen. Codein wurde sogar als
wirksamer befunden als Morphin (auf Molarbasis) indem es 50% Inhibierung der Ausfällung von
Radioaktivität erzeugte. Dies ist nicht überraschend weil Codein größere strukturelle Ähnlichkeit zu der
immunisierenden Carboxymethylmorphingruppe als Morphin selbst zeigt Es wurde weiter gefunden, daß 500
Nanogramm Nalorphin die Fällung von Radioaktivität um etwa 35% verringern, während die gleiche Menge
an Methadon wenig oder keine Inhibierung zeigt.
Claims (14)
1. Ein Opiumalkaloid-Antigen, bestehend aus
einem Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat der phenolischen
Hydroxygruppe eires Opiumalkaloids, gekuppelt an ein immunogenes Trägermaterial.
2. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunogene
Trägermaterial ein Protein ist
3. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin
ist
4. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das
Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat des Opiumalkaloids 3-O-Carboxymethylmorphin ist
5. Verfahren zur Herstellung eines Opiumalkaloid-Antigens nach einem der vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet, daß ein Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat der phenolischen Hydroxygruppe
eines Opiumalkaloids mit einem immunogenen Trägermaterial umgesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet,
daß ein Protein als immunogenes Trägermaterial verwendet wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Rinderserumalbumin als Protein
verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß 3-O-Carboxymethylmorphin
als das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat eines Opiumalkaloids verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in
einem leicht-sauren, wäßrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat
eines Opiumalkaloids in einem molaren Überschuß im Bereich von etwa 30 bis etwa 10 000, vorzugsweise im Bereich von etwa 100 bis
etwa 1000, mit dem immunogenen Trägermaterial umgesetzt wird.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10,
dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt
wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch
gekennzeichnet, daß ein wasserlösliches Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß l-Äthyl-3-(3-Dimelhylaminopropyl)-carbodiimid
als Kupplungsmittel verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer
Temperatur von etwa 0 bis etwa 500C und bei einem pH im Bereich von etwa 3 bis etwa 6,5, vorzugsweise
von etwa 4 bis etwa 6,5, am besten bei etwa 5,5, durchgeführt wird.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US3699970A | 1970-05-13 | 1970-05-13 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2166716A1 DE2166716A1 (de) | 1975-04-24 |
DE2166716B2 DE2166716B2 (de) | 1979-09-27 |
DE2166716C3 true DE2166716C3 (de) | 1980-06-12 |
Family
ID=21891894
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE2166716A Expired DE2166716C3 (de) | 1970-05-13 | 1971-05-11 | Opiumalkaloid-Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
CA (1) | CA966778A (de) |
DE (1) | DE2166716C3 (de) |
DK (1) | DK142145B (de) |
GB (1) | GB1320056A (de) |
SE (4) | SE389739B (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4104367A (en) * | 1976-10-13 | 1978-08-01 | Hoffmann-La Roche Inc. | Radioimmunoassay for methadone |
CN113968853B (zh) * | 2020-07-22 | 2022-09-16 | 中国农业大学 | 阿托品类生物碱的半抗原、人工抗原及其制备方法与应用 |
-
1971
- 1971-05-11 DE DE2166716A patent/DE2166716C3/de not_active Expired
- 1971-05-12 DK DK228271AA patent/DK142145B/da unknown
- 1971-05-12 CA CA112,764A patent/CA966778A/en not_active Expired
- 1971-05-13 GB GB1462971*[A patent/GB1320056A/en not_active Expired
- 1971-05-13 SE SE7408141A patent/SE389739B/xx not_active IP Right Cessation
- 1971-05-13 SE SE7106271A patent/SE389737B/xx unknown
-
1974
- 1974-06-19 SE SE7408140A patent/SE417970B/xx not_active IP Right Cessation
- 1974-06-19 SE SE7408141A patent/SE7408141L/xx unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
SE389737B (sv) | 1976-11-15 |
DK142145C (de) | 1981-02-02 |
SE389739B (sv) | 1976-11-15 |
DE2123300A1 (de) | 1971-11-25 |
DE2166716B2 (de) | 1979-09-27 |
SE417970B (sv) | 1981-04-27 |
DK142145B (da) | 1980-09-08 |
GB1320056A (en) | 1973-06-13 |
SE7408140L (de) | 1974-06-19 |
CA966778A (en) | 1975-04-29 |
SE7408141L (de) | 1974-06-19 |
DE2166716A1 (de) | 1975-04-24 |
DE2123300B2 (de) | 1976-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE2202441C3 (de) | ||
US3775536A (en) | Opium alkaloid antigens and antibodies specific therefor | |
DE2806146C2 (de) | Tumor-spezifisches Glykoprotein und dessen Verwendung zur Krebsdiagnose beim Menschen | |
DE2805663C3 (de) | ||
DE69113114T2 (de) | Test für Phencyclidin und Phencyclidin-Metaboliten, Tracer, Immunogene, Antikörper und Reagenzsatz dafür. | |
EP0013930B1 (de) | Immunogen, Antikörper für ein Thymus-Hormon, markiertes Thymus-Hormon und Verfahren zur Bestimmung dieses Thymushormons | |
DE2716536C2 (de) | Methadon-Antigene und Verfahren zur Herstellung dieser | |
DE69922990T2 (de) | Herstellungsverfahren von festphasekonjugateimpfstoffen | |
DE2548196C2 (de) | Antigene auf Basis von Methaqualon- Hapten sowie deren Verwendung | |
EP0183901B1 (de) | Bifunktionelle Haptene, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung | |
DE60035267T2 (de) | Verfahren zur analyse der menge an intraabdominalem fettgewebe | |
DE2310280A1 (de) | Tubocurarin-antigene | |
DE2166716C3 (de) | Opiumalkaloid-Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung | |
DE2755008A1 (de) | Verfahren zur immunologischen bestimmung mit hilfe von enzym-markierungen | |
EP0124779A2 (de) | Radioimmunverfahren für Thymosin beta 4 | |
DE3114362C2 (de) | Verfahren zur Herstellung eines Antikörpers bzw. Antiserums, Verwendung dieses Verfahrens zur Gewinnung von Säugetierzellen, welche fähig sind, einen solchen Antikörper zu erzeugen und Verwendung des so hergestellten Antikörpers bzw. Antiserums zur Immunoprüfung | |
DE2738156A1 (de) | Bestimmung von catecholaminen | |
DE2714751A1 (de) | Herstellung von alpha-l-antikoerpern, reinigung von alpha-l-antigenen und reagenz fuer die bestimmung von alpha-l-antikoerpern und alpha-l-antigenen | |
DE2123300C3 (de) | Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Opiumalkaloiden | |
DE69902419T2 (de) | Farbstoff-markierte Proteinkonjugat und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE2905883A1 (de) | Radioimmuntest fuer clonidin | |
DE2800783A1 (de) | Bestimmung von cholecalciferol | |
DE2126128A1 (de) | Medizinisches Testverfahren, Reagens und Additiv zur Durchführung des Verfahrens | |
DE2733561C3 (de) | Spezifisches Reagens für den Immuntest für Thymopoietin | |
EP0121912A1 (de) | Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Thymosin-beta-4 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OD | Request for examination | ||
C3 | Grant after two publication steps (3rd publication) | ||
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |