DE2166716C3 - Opiumalkaloid-Antigene und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Opiumalkaloid-Antigene und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Die große Zunahme des Verbrauchs von Narkotika einschließlich der Opiumalkaloide durch die Bevölkerung im allgemeinen hat das Bedürfnis mit sich gebracht, analytische Arbeitsweisen für die Bestimmung solcher Substanzen in biologischen Fluida zu verbessern. In vielen Fällen sind medizinische Behandlungszentren gezwungen, die Identität eines von einem Patienten genommenen Narkotikums zu bestimmen, welcher sich in einem komatösen Zustand befindet und daher unfähig ist, eine solche Information dem behandelnden Arzt zu liefern. Gegenwärtige Verfahren für die Identifizierung

κι von Opiumaikaloiden erfordern Extraktions- und Dünnschichtchromatographieverfahren. Diese Arbeitsweisen haben den Nachteil, einen verhältnismäßig großen Zeitaufwand zu erfordern, mühselig und wenig empfindlich zu sein. Eine schnellere und hochwirksame

r, Prüfung auf die Anwesenheit von Opiumaikaloiden in biologischen Fluida würde daher einen außergewöhnlich wichtigen technischen Fortschritt bedeuten.

Es ist bereits bekannt, daß verschiedene kleine Moleküle (Haptene), welche an sich völlig frei von

'η Antigenwirkung sind, die Antigeneigenschaften eines Proteins modifizieren können, wenn das kleine Molekül kombiniert wird mit dem Protein durch stabile kovalente Bindungen. So offenbart die US-Patentschrift No. 23 72 066, daß Antigene hergestellt werden können

j-, durch Kombinieren von Histaminen oder histaminartigen Verbindungen mittels Bindung des Imidazolrings an ein gewünschtes Protein durch ein Radikal, welches eine Gruppe enthält die mit dem Protein kuppeln kann. Diese Antigene werden verwendet entweder durch

in direkte Injektion in ein Lebewesen, wodurch Resistenz, Widerstandsfähigkeit oder aktive Immunität in diesem Lebewesen entwickelt wird, oder durch Injektion in Gasttiere, aus welchen für den Haptenteil spezifische Antikörper, z. B. das Histamin oder die histaminartige

ο Substanz, entwickelt werden. In ähnlicher Weise offenbart Landsteiner in »Specificity of Serological Reactions«, Harvard University Press, Cambridge, Massachusetts (1945) die Verwendung von p-Aminobenzolarsonsäure als ein Hapten, welches, wenn an ein

κι Protein gekuppelt, imstande war, spezifische Antikörper in einem Gasttier zu erzeugen.

Die neuen erfindungsgemäßen Antigene bestehen aus einem Opiumalkaloidhaptentcil, gekuppelt an ein immunogenes Trägermaterial. In bevorzugten Ausfüh-

i, rungsformen ist das Opiumalkaloid kovalent an ein Proteinmolekül durch eine Carboxy-nieder-Alkyl-Bindungsgruppe über eine Peptidbindung gekuppelt. Diese Peptidbindung umfaßt die Aminogruppe des Proteinmoleküls und die Carboxygruppe der Carboxy-nieder-

Ii Alkyl-Bindungsgruppe. Diese Bindungsgruppe ist an das Opiumalkaloid als ein Derivat der phenolischen Hydroxylgruppe gebunden.

Der hier benutzte Ausdruck »nieder Alkyl« soll gerad- oder verzweigtkettige, gesättigte Kohlenwasser-

,, Stoffreste mit I bis 6 Kohlenstoffatomen, z. B. Methyl, Äthyl, Propyl u. dgl. umfassen.

Der Ausdruck »Trägermaterial« soll solche Materialien einschließen, welche die Eigenschaft haben, unabhängig eine immunogene Wirkung in einem

wi Gasttier, wenn in ein solches injiziert, hervorzurufen, und welche durch kovalente Bindung an das Opiumalkaloidhapten gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien sind beispielsweise Proteine; natürliche oder synthetische polymere Verbindungen wie

μ·. Polypeptide z.B. Polylsin; Polysaccharide; u.dgl. Ein besonders bevorzugtes Trägermaterial für die Praxis der Erfindung ist Protein.

Die Identität des Protein-Trägermalerials, wie es bei

der Zubereitung des bevorzugten erfindungsgemäßen Antigens benutzt wird, ist nicht kritisch. Beispiele von für die Praxis der Erfindung brauchbaren bevorzugten Proteinen sind die Serumproteine, vorzugsweise Säugetierproteine, wie z. B. menschliches Gammaglobulin, menschliches Serumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Rindergammaglobulin und Rinderserumalbumin. Andere geeignete Proteinprodukte ergeben sich leicht für den Fachmann. Im allgemeinen wird bevorzugt, ein Protein zu verwenden, welches für das Gasttier fremd ist, in welchem das sich ergebende Antigen angewandt werden soll.

Das bei der Praxis der Erfindung besonders bevorzugte Opiumalkaloid ist Morphin. Andere erfindungsgemäß brauchbare Opiumalkaloide sind beispielsweise Heroin und Codein und deren Derivate, welche die phenolische Hydroxygruppe nicht beeinflussen. Es wurde gefunden, daß die Antikörper, welche durch die Verwendung eines Morphinhapten-Protein-Antigens erzeugt werden, spezifisch nicht nur für das Morphin, sondern auch für nahe verwand te Derivate, z. B. für das Codein und in geringerem Ausmaß für Nalorphin, sind.

Die erste Stufe der Herstellung des bevorzugten erfindungsgemäßen Antigens umfaßt das Überführen des Opiumalkaloids in das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat der phenolischen Hydroxygruppe des Alkaloids. Dies wird am zweckmäßigsten bewerkstelligt durch Umsetzen der freien Base des Alkaloids mit einem Alkalisalz einer Halo-nieder-Alkansäure mit 1—7, vorzugsweise I —4 Kohlenstoffatomen. Geeignete Halo-nieder-AIkansäuren für diesen Zweck sind /J-Haloessigsäure, y-Halopropionsäiire, O-Halobuttersäure u. dgl.

Die für die Ausführung der Erfindung brauchbaren Alkaiisalze der vorgenannten Haloalkansäuren schlie-Ben die Natrium-, Kalium- und Lithiumsalze ein, das Natriumsalz wird bevorzugt. Haloderivate der erwähnten Alkansäuren umfassen die Chlor-, Brom-, Jod- und Fluorderivate. Bei der bevorzugtesten Ausführungsform der Erfindung wird die freie Morphinbase in ihr 3-O-Carboxymethylderivat durclh Umsetzen mit Natrium-/?-chloracetat übergeführt. Die erwähnte allgemeine Reaktion wird durch ihre Ausführung in Gegenwart eines geeigneten inerten organischen Lösungsmittels, z.B. eines niederen Alkanols, wie Äthanol erleichtert. Am besten ist das Lösungsmittelsystem wasserfrei und daher wird ein absolutes niederes Alkanol verwendet. Für die Zwecke der Erfindung soll der Ausdruck niederes Alkanol gerad- und verzweigtkettige Alkenole mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen umfassen.

Die Reaktion, welche die Carboxy-nieder-Alkylgruppe in das Opiumalkaloidmolekül einführt, kann zweckmäßigerweise bei einer Temperatur zwischen etwa Raumtemperatur bis zu etwa 50"C ausgeführt werden, obwohl höhere oder niedere Temperaturen gewünschtenfalls angewendet werden können. Bei bevorzugten Ausführungsweisen wird Raumtemperatur für diese Reaktion angewendet.

Die Kupplung des Carboxy-nieder-Alkyl-Derivats des Opiumalkaloids mit einem Protein zwecks Bildung des bevorzugten Antigens der Erfindung kann unter Anwendung wohlbekannter Methoden der Proteinchemie zur Bildung von Peptidbindungen leicht bewerkstelligt werden. So wird beispielsweise nach einer solchen Methode das Protein und ein wasserlösliches Kupplungsagens in Wasser gelöst und anschließend wird ein großer molarer Überschuß des gewünschten Carboxynieder-Alkyl-Opiumalkaloidderivats zugesetzt. Diese Reaktion kann bei einer Temperatur von etwa 0°C bis etwa 5O⁰C ausgeführt werden, obwohl höhere oder niedrigere Temperaturen in Abhängigkeit von der Art der Reaktanten und der Denaturisierungstemperatur des Proteins angewendet werden können. Am meisten bevorzugt wird Raumtemperatur. Es ist erwünscht, ein schwach saures Reaktionsmedium, ζ B. ein Medium mit einem pH im Bereich von etwa 3 bis 6,5, vorzugsweise 4 bis 6,5, z. B. 5,5, anzuwenden. Geeignete wasserlösliche Kupplungsmittel zur erfindungsgemäßen Verwendung sind z. B. wasserlösliche Carbodiimide, wie l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropylj-carbodiimid.

Nach Beendigung der obigen Kupplungsreaktion können überschüssige Haptenmoleküle und Kupplungsmittel durch Dialyse entfernt werden. Die Dialyse kann überwacht werden durch Kontrolle des Dialysats auf die Anwesenheit von Hapten oder Kupplungsmittel, oder stattdessen kann die Dialyse während einer vorbestimmten Zeitperiode, z. B. 7 Tagen, durchgeführt werden. Die Dialyse wird mit destilliertem Wasser durchgeführt, welches vorzugsweise vier- oder fünfmal pro Tag ausgewechselt wird. Gereinigtes Antigen wird als Rückstand in dem Dialysebeutel gewonnen.

Außer Wasser können andere geeignete Lösungsmedien bei der obigen Reaktion verwendet werden, beispielsweise 0,15 M Salzlösung (NCl), eine Ό.15Μ Salzlösung, gepuffert mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,4) oder eine 0,01 M Phosphatpufferlösung. Das Reaktionsgemisch wird auf den gewünschten pH-Bereich durch Zusatz von verdünnter wäßriger Säure, z. B. IN HCI gebracht. Lösungsmittel, welche Proteine denaturieren, z. B. organische Lösungsmittel wie Alkohole, Äther usw., oder starke anorganische Säuren oder Basen, z. B. Mineralsäuren oder Alkalihydroxyde, sollten im allgemeinen nicht gebraucht werden.

Die Höhe des molaren Überschusses an Hapten über das Protein bei der vorgenannten Reaktion wird naturgemäß von der Identität des benutzten Opiumalkaloidderivats und dem für die Reaktion ausgewählten Protein abhängen. Im aligemeinen wird ein molarer Überschuß im Bereich von etwa 30 bis 10 000, am bevorzugtesten im Bereich von etwa 100 bis 1000 des Haptens in bezug auf das Protein angewendet.

Es wird im allgemeinen gefunden, daß etwa 3 bis 7 Opiumalkaloidderivatgruppen an ein Molekül des Proteins addiert werden, in Abhängigkeit naturgemäß von der Menge des molaren Überschusses des angewendeten Haptens. Beispielsweise werden drei bis vier Carboxymethylmorphingruppen an ein Molekül Rinderserumalbumin (angenommenes Molekulargewicht dieses Proteins 70 000) addiert werden, wenn ein 100 molarer Überschuß des Haptens angewendet wird.

Es wird angenommen, daß die Reaktionssequenz, wie sie bei der Herstellung des erfindungsgemäßen Antigens angewendet wird, durch das folgende Reaktionsschema erläutert werden kann, worin 3-O-Carboxymethylmorphin als beispielhafte Haptengruppe benutzt wird.

X ( ll,)„( (H) M

N CII₁

Älhanol

HOOC(CH₂),, --O

' N- CH,

HO

Protein-- NH₂

R- N=C=N R'(carbodiimid)

O

Il
Protein —NH-C- (CH,),, O

°xJJnch,

HO

Antigen

X bedeutet Halogen, M ist ein Alkalimetall und η ist eine ganze Zahl von 1 bis 6.

Das erfindungsgemäße Antigen kann dann verwendet werden, um Bildung spezifischer Opiumalkaloidantikörper in dem Serum von Gasttieren zu erzeugen, indem das Antigen in einen solchen Gast wiederholt über eine Zeitperiode injiziert wird, das Serum gesammelt, der Antikörper mit einer neutralen Salzlösung ausgefällt und gewünschtenfalls der Antikörper durch Dialyse und Säulenchromatographie gereinigt wird.

Geeignete Gasttiere zu diesem Zweck sind Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Kühe, Schafe u.dgl. Der sich ergebende Antikörper hat eine Vielzahl aktiver Stellen, welche selektiv mit Opiumalkaloiden, dem oben beschriebenen Opiumalkaloidantigen oder nahe verwandten Derivaten komplexieren.

Die Bildung von spezifischen Opiumalkaloidantikörpern in den Gasttieren kann überwacht werden, indem Blutproben aus dem Gasttier genommen werden und dazu eine Menge des Hapten-Protein-Antigens zügefügt wird. Die Anwesenheit von Niederschlag zeigt Antikörperaktivität an. Die Antigenbehandlung des Tieres kann fortgesetzt werden, bis der Antikörpergehalt einen gewünschten Aktivitätsgrad erreicht. Für die Zwecke dieser Anwendung wird der Antikörpergehalt definiert als die maximal K mzentration an ausgefälltem Protein im Anschluß an den Zusatz verschiedener bekannter Konzentrationen von Antigenen zu festgelegten Seriumvolumina, z. B. 0,5 ml.

Die Antikörper können aus dem Serum der behandelten Gasttiere durch Anwendung bekannter biochemischer Methoden isoliert werden. Beispielsweise können die aus der Behandlung von Gasttieren erhaltenen Sera mit einem neutralen Salz behandelt werden, welches Fällung der erwünschten spezifischen Antikörper bewirkt Geeignete neutrale Salze für diesen Zweck sind Natriumsulfat, Magnesiumsulfat eine Natriumhydrogenphosphaimischung oder Ammoniumsulfat Das bevorzugte neutrale Salz ist Ammoniumsulfat Nach der Ausfällung können Reinigungsverfahren angewendet werden, wie z. B. Dialyse und Säulenchromatographie. Der erhaltene Antikörper kann als ein

ίο Gammaglobulin mit einem Molekulargewicht von etwa 160 000 gekennzeichnet werden. Dieser Antikörper komplexiert mit hohem Spezifitätsgrad mit Opiumalkaloidhaptenen und daraus stammenden Antigenen.

Die spezifischen Antikörper sind brauchbar als Reagentien in biochemischen Prüfungen zur Bestimmung der Anwesenheit von Opiumalkaloiden und nahe verwandten Verbindungen in biologischen Fluida. Ein Prüfungsverfahren ist ein Immunoausfällverfahren, welches benutzt werden kann, um Nanogrammbeträge eines Opiumalkaloids, z. B. Morphin, im Serum zu messen. Bei einem solchen Verfahren wird eine bekannte Menge eines markierten Opiumalkaloids mit Opiumalkaloidantikörper und einem Muster vermischt, welches die unbekannte Menge an Opiumalkaloiden

2-j enthält. Die Menge an Opiumalkaloid in dem Muster kann bestimmt werden durch Messen des Ausmaßes an konkurrierender Inhibierung, beobachtet zwischen der Bindung des markierten Opiumalkaloids und dem Opiumalkaloidmuster mit dem spezifischen Opiumalka-

Jd loidantikörper, und dann kann die Menge an Opiumalkaloid in dem Muster aus einer Standardkurve berechnet werden. Geeignete markierte Opiumalkaloide für diesen Zweck sind z. B. die isotopisch markierten Opiumalkaloide, insbesondere Tritium-markierte Opiumalkaloide wie Dihydromorphin-H³ und Morphin-I¹²⁵. wie auch Opiumalkaloide, markiert mit einer Elektronen-Spin-Resonanzgruppe. Beispiele der Verwendung von verschiedenen Elektronen-Spin-Resonanz-markierten Molekülen in Bioprüfungen sind zu finden in den US-Patentschriften 34 53 288,34 81 952 und 35 07 876.

Beispiel 1
Herstellung von Antigen

Morphin wird übergeführt in 3-O-Carboxymethylmorphin durch Umsetzung der freien Alkaloidbase mit Natrium-jS-chloracetat in absolutem Äthanol gemäß den in Houben, »Fortschritte der Heilstoffchemie«, 1, 882 (1901) und Beilstein, Band 27, 156 beschriebenen Verfahren. Das erhaltene Derivat hat nach der Umkristallisation aus heißem absolutem Äthanol einen Schmelzpunkt von 292-293° C. Die 3-O-Carboxymethylmorphinsäure ist Dragendorff-positiv und Pauly-negativ und hat ein Rf von 0,6 auf Dünnschichtkieselsäuregel-Chromatogrammen unter Verwendung von Eisessig : Methanol (1 :1) als Lösungsmittelsystem. In dem gleichen Lösungsmittelsystem hat Morphin ein Rf von 1,0. Das Carboxymethylmorphin wird gekuppelt an Rinderserumalbumin (BSA) in wäßriger Lösung in Gegenwart von wasserlöslichem Carbodiimid gemäß dem folgenden Verfahren. Im ganzen werden 8 mg Carboxymethylmorphin in 2 ml destilliertem Wasser gelöst, welches 10 mg BSA enthält. Das pH der Mischung wird auf 5,5 mit 1 N HCI eingestellt und 8 mg 1 -Äthyl-i-p-dimethyl-arnino-propyO-carbodiirnid werden zugesetzt. Die Mischung wird über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert und dann 7 Tage gegen destilliertes Wasser mit vier- bis fünfmaligem Auswech-

sein pro Tag dialysiert. !Conjugate, analysiert durch das spektrofluormetrische Verfahren von Balatre u. a., Annales Pharm. Franc. 19, 171 (1961), enthielten 3 bis 4 Carboxymethylmorphingruppen pro Molekül BSA (bei Annahme eines Molekulargewichts von 70 000 für das Protein).

Versuch 1
Herstellung des Antikörpers

Kaninchen des Neuseeland-Albino-Stammes werden mit 1 mg Carboxymethylmorphin-BSA immunisiert. Das Immunogen wird in Phosphatpuffersalzlösung von pH 7,4 gelöst, mit einem gleichen Volumen von vollständigem Freund's-Hilfsmittel emulgiert und in den Fußwulst (0,4 ml/Fußwulst) injiziert. Verstärkungsinjektionen von 100 μg Antigen im Hilfsmittel werden alle 6-8 Wochen in die Fußwülste und Seiten gegeben.

Antiserum wird 5 — 7 Tage nach den Verstärkungsinjektionen gesammelt. Blut, gesammelt aus Herzpunktur, wird bei 37°C eine Stunde inkubiert und dann über Nacht bei 4°C gehalten. Nach dem Zentrifugieren mit 5000 Umdrehungen pro Minute während 30 Minuten bei 4°C wurde Serum aus dem Klumpen abgetrennt.

Versuch 2
Radioimmunprüfung

Die Radioimmunprüfung wird ausgeführt durch Inkubierung verschiedener Verdünnungen von Antiseren, erhalten gemäß Versuche 2, über Nacht in Gegenwart von Dihydromorphin-H³ (New England nuclear, 388 mc/mM) 100 Picomolen (4000 cpm) bei 4° C.

Nach der Inkubierung wird eine neutrale gesättigte Ammoniumsulfatlösung (Volumen gleich dem Inkubieningsmedium) zu allen Röhren zugesetzt Die Ausfällung, abgesetzt durch Zentrifugieren mit 5000 Umdrehungen pro Minute während 15 Minuten bei 4° C, wird zweimal in 50%iger Ammoniumsulfatlösung gewaschen. Die gewaschenen Ausfällungen, welche an den Antikörper gebundenes Morphin enthalten, werden in 03 ml eines handelsüblichen Detergens-Solubilisierungsmittels aufgelöst, qua'ntitativ in ein Packard Tri-Carb Liquid Scintillation Spectrometer übertragen und ausgezählt Die Röhre, welche radioaktives Dihydromorphin und ein Antiserum, aber kein nichtmarkiertes Morphin enthält, dient als Maß der maximalen, an den Antikörpern gebundenen Radioaktivität Der Zusatz steigender Mengen an unmarkiertem Morphin zu einer feststehenden Menge an Dihydro-H und Antiserum führt zu einer konkurrierenden Inhibie rung des markierten Dihydromorphins für die Bildunj des Antikörper-Hapten-Komplexes. Die erhaltenei Werte folgen in der Tabelle.

Tabelle

Nanogramm nichtradioaktives
Morphin zugesetzt

% Inhibierung der Binduni von Dihydromorphin-H³

20
38
50
65
80

Die obigen Werte zeigen deutlich die Empfindlichkeil der Methode. Wenn in graphischer Form aufgetragen geben die in obiger Tabelle enthaltenen Werte ein« lineare Beziehung zwischen der Menge an zugesetzten* nichtradioaktivem Morphin und der gefundenen Pro zentzahl an Inhibierung. Mit dem Zusatz von 0,£ Nanogramm von nichtmarkiertem Morphin pro Röhre (eine Konzentration von 1 Nanogramm pro ml voi Zusatz von Ammoniumsulfat) werden 20% des markierten Dihydromorphins aus dem Antikörper verdrängt Die Spezifität des Antiserums für Morphin wird gezeigt durch Inkubierung des markierten Haptens mit normalem Kaninchenserum. Die Radioaktivität, welche in einer Ausfällung aus normalem Kaninchenserum nach dem Waschen zurückbleibt, ist ein wenig oberhalb des Nullwertes und wird von den Werten subtrahiert, welche bei allen anderen Röhren erhalten werden.

Vergleichsversuche werden mit anderen Alkaloiden durchgeführt Die inhibierende Leistung von Codein, welches Morphin-3-methyl-äther ist wird mit derjenigen von Morphin verglichen. Codein wurde sogar als wirksamer befunden als Morphin (auf Molarbasis) indem es 50% Inhibierung der Ausfällung von Radioaktivität erzeugte. Dies ist nicht überraschend weil Codein größere strukturelle Ähnlichkeit zu der immunisierenden Carboxymethylmorphingruppe als Morphin selbst zeigt Es wurde weiter gefunden, daß 500 Nanogramm Nalorphin die Fällung von Radioaktivität um etwa 35% verringern, während die gleiche Menge an Methadon wenig oder keine Inhibierung zeigt.

Claims (14)

Patentansprüche:

1. Ein Opiumalkaloid-Antigen, bestehend aus einem Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat der phenolischen Hydroxygruppe eires Opiumalkaloids, gekuppelt an ein immunogenes Trägermaterial.

2. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das immunogene Trägermaterial ein Protein ist

3. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin ist

4. Ein Opiumalkaloid-Antigen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat des Opiumalkaloids 3-O-Carboxymethylmorphin ist

5. Verfahren zur Herstellung eines Opiumalkaloid-Antigens nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß ein Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat der phenolischen Hydroxygruppe eines Opiumalkaloids mit einem immunogenen Trägermaterial umgesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein als immunogenes Trägermaterial verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß Rinderserumalbumin als Protein verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß 3-O-Carboxymethylmorphin als das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat eines Opiumalkaloids verwendet wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem leicht-sauren, wäßrigen Reaktionsmedium durchgeführt wird.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Carboxy-nieder-Alkyl-Derivat eines Opiumalkaloids in einem molaren Überschuß im Bereich von etwa 30 bis etwa 10 000, vorzugsweise im Bereich von etwa 100 bis etwa 1000, mit dem immunogenen Trägermaterial umgesetzt wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in Gegenwart eines Kupplungsmittels durchgeführt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß ein wasserlösliches Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß l-Äthyl-3-(3-Dimelhylaminopropyl)-carbodiimid als Kupplungsmittel verwendet wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion bei einer Temperatur von etwa 0 bis etwa 50⁰C und bei einem pH im Bereich von etwa 3 bis etwa 6,5, vorzugsweise von etwa 4 bis etwa 6,5, am besten bei etwa 5,5, durchgeführt wird.