DE2800783A1 - Bestimmung von cholecalciferol - Google Patents
Bestimmung von cholecalciferolInfo
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Description
Patentanwälte
Dr. F- arz Lxisrer 9 Q η η 7 ft *3
DipL-lng- He! ^r ι.. >β>κι ^r
8000 Munchsn 20
(.ucile-Grahn-St,·. 22. Tel. (039JW29'
RAN 4093/21
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Bestiinmuna von Cholecalciferol
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von
Cholecalciferol und von optischen Enantiomeren und Racematen davon. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein
Radioimmunverfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von
Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol und von optischen Enantiomeren und Racematen davon.
Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren ist relativ
einfach und empfindlich. Ferner erfordert das erfindungsgemässe
Radioimmunverfahren bedeutend kleinere Mengen an biologischen
Flüssigkeiten als bisher.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich, in einem spezifischen Aspekt, auf ein Hapten, welches zur Herstellung von
Antigenen geeignet ist. Dieses Hapten ist eine Verbindung der allgemeinen Formel
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Hen/14.12.1977
Hen/14.12.1977
2B00783
H3
ο-·
CO(CH2)nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis IO bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist η die Zahl
2 oder 3. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist η die Zahl 2, d.h. die Verbindung der Formel I ist Cholecalciferol-hemisuccinat.
Verbindungen der Formel I und optische Enantiomere und Racemate davon können hergestellt werden, indem man eine Verbindung
der allgemeinen Formel
;h3
H3
Il
HO·'"
809829/0759
oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon
mit einem Anhydrid der allgemeinen Formel
III
worin η die obige Bedeutung besitzt, umsetzt.
Das obige Verfahren wird in Anwesenheit eines tertiären Amins, welches als Lösungsmittel und Reaktionsbeschleuniger
dient, durchgeführt. Geeignete tertiäre Amine sind aliphatische Amine (z.B. Triäthylamin, Tripropylamin, Tributylamin und dergleichen)
und heteroaromatische Amine (z.B. Pyridin, Picolin, Lutidin, Collidin, Chinolin und dergleichen). Aromatische
tertiäre Amine sind bevorzugt, wobei Pyridin besonders bevorzugt ist.
Das bevorzugte Anhydrid ist Bernsteinsäureanhydrid.
Die Reaktionstemperatur ist nicht wirklich kritisch. Vorzugsweise liegt sie jedoch zwischen ungefähr O°C und dem
Siedepunkt des Reaktionsgemisches. Eine Reaktionstemperatur von 100 C ist besonders bevorzugt.
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Weil Cholecalciferol etwas lichtempfindlich ist, erfolgt
die Reaktion vorzugsweise, aber nicht zwingend, im Dunkeln. Unter diesen Bedingungen sind die Ausbeuten am gewünschten
Hapten etwas besser, als wenn die Reaktion unter normalen Bedingungen durchgeführt wird. Weiter ist es von Vorteil, aber
nicht zwingend, die Reaktion in inerter Atmosphäre (z.B. Stickstoff, Argon und dergleichen) durchzuführen, wobei eine Argonatmosphäre
bevorzugt ist.
Zur Herstellung eines Antigens kann die Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon
über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Trägermaterial kovalent gebunden werden.
Der hier verwendete Ausdruck "immunogenes Trägermaterial" umfasst solche Materialien, die bei ihrer Injizierung in Wirtstiere
selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen und die mittels einer kovalenten Bindung an die beschriebene
Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien
sind z.B. Proteine; natürliche oder synthetische polymere Stoffe, wie Polypeptide (z.B. Polylysin und Copolymere
von anderen Aminosäuren); Polysaccharide; und dergleichen. Bevorzugte
Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide, wobei Proteine besonders bevorzugt sind.
Die Art des als immunogenes Trägermaterial verwendeten Proteins spielt keine besondere Rolle. Beispiele für bevorzugte
Proteine sind Säugetier-Serumproteine, wie menschliches γ-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin,
methyliertes Rinderserumalbumin, Hasenserumalbumin und Rinder-y-Globulin.
Rinderserumalbumin ist bevorzugt. Es liegt im Vermögen des Fachmannes, weitere geeignete Proteine zu verwenden. Obwohl
es nicht unbedingt notwendig ist, werden im allgemeinen bevorzugt solche Proteine verwendet, die für das mit dem Antigen zu
behandelnde Wirtstier artfremd sind.
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Die kovalente Bindung einer Verbindung der Formel I oder eines optischen Enantiomers oder Racemats davon an ein immunogenes
Trägermaterial kann in der für die Herstellung von Esteroder Amidbindungen üblichen Art erfolgen.
In einer Ausführungs£orm kann z.B. eine Verbindung der
Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon vor der Kupplung an ein immunogenes Trägermaterial in eine
isolierbare aktivierte Form übergeführt werden. Eine geeignete isolierbare aktivierte Form ist der N-Hydroxysuccinimidester.
Es können auch Verfahren benützt werden, in welchen es
nicht notwendig ist, ein aktiviertes Derivat einer Verbindung der Formel I oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats
davon zu isolieren. Dies kann z.B. durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens
oder durch Verwendung von EEDQ (N-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin) als Kupplungsmittel erreicht
werden.
Es können auch noch andere Kupplungsverfahren verwendet werden. So kann z.B. die Kupplung einer Verbindung der allgemeinen
Formel I oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon an ein immunogenes Trägermaterial in Gegenwart eines
Cafbodiimids, wie z.B. l-Aethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid,
erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die kovalente Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel I
oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon an ein immunogenes Trägermaterial durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens.
In diesem Verfahren wird die Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon in einem
inerten, wasserlöslischen organischen Lösungsmittel (z.B. ein cyclischer Aether wie Dioxan) gelöst und die Lösung mit einem
Tri(niederalkyl)amin, wie z.B. Tri-(η-butyl)amin, neutralisiert.
Anschliessend wird ein Halogenameisensäureniederalkylester, wie z.B. Chlorameisensäureisobutylester, zugegeben. Die erhaltene
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Lösung wird dann bei einer Temperatur zwischen etwa O bis 8 C
einer Lösung des immunogenen Trägermaterials in Wasser oder in einer 1:1 Mischung von Wasser und eines wasserlöslichen organischen
Lösungsmittels (z.B. ein cyclischer Aether wie Dioxan) zugegeben, wobei die Lösung des immunogenen Trägermaterials
vorher mit Hilfe einer Lösung eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, alkalisch gemacht wird. Die Kupplungsreaktion
wird während einer Zeitdauer, welche zwischen 30 Minuten und einer ganzen Nacht liegt, fortgesetzt. Nach Dialyse, Ansäuerung ·
und Zentrifugieren des gebildeten Niederschlages wird das gewünschte Antigen erhalten.
Die mit Hilfe des obigen Verfahrens hergestellten Antigene können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber
Cholecalciferol oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon spezifischen Antikörpern in Wirtstieren zu induzieren,
indem man das Antigen, vorzugsweise unter Zusatz eines üblichen Hilfsstoffes, diesen Wirtstieren injiziert. Geeignete Wirtstiere
sind z.B. Säugetiere, wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Rinder oder Schafe. Erhöhte Antikörpertiter
können durch wiederholtes Injizieren über einen gewissen Zeitraum erreicht werden. Die erhaltenen Antisera reagieren
unter Komplexbildung mit Cholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon oder mit einem mit Hilfe dieser
Verbindungen wie oben beschrieben hergestellten Antigen.
Die auf diese Weise hergestellten Antikörper dienen als Reagenz zur Bestimmung des Gehalts an Cholecalciferol, oder
eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise Plasma.
Weiter ergeben sie eine Kreuzreaktion mit la,25-Dihydroxycholecalciferol
und können dementsprechend auch zur Bestimmung dieses Cholecalciferolmetabolits eingesetzt werden.
35
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung
ein Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol
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oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer
Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten Cholecalciferols oder
eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit diesem Cholecalciferol oder mit einem
optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren
oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend
aus einer Verbindung der Formel I oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche kovalent an ein immunogenes
Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurdej den
Bindungsgrad des markierten Cholecalciferols oder optischen
Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Cholecalciferols oder optischen Enantiomers
oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter
Mengen des Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem
radioaktiv markierten Cholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten
worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Cholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon
bestimmt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das radioaktiv markierte Cholecalciferol oder ein optisches
Enantiomeres oder Racemat davon vorzugsweise mit Tritium ( H),
C oder Jod 125 (I) markiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Radioimmunverfahren zur Bestimmung von la,25-Dihydroxycholecalciferol
oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen
Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit
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diesem Ια,-25-Dihydroxycholecalciferol oder mit einem optischen
Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat
davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer
Verbindung der Formel I oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche kovalent an ein immunogenes Trägermaterial
gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen
Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen
Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen
bekannter Mengen des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines
optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferol
oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad
für jede bekannte Menge des la-Dihydroxycholecalciferols oder
optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das radioaktiv markierte la,25-Dihydroxycholecalciferol oder ein
optisches Enantiomeres oder Racemat davon vorzugsweise mit Tritium (3H), 14C oder Jod 125 (125I) markiert.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele
illustriert.
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Cholecalciferolhemisuccinat
Eine Mischung von 5,0 g (13 iriMol) Cholecalciferol und
5,0 g (13 mMol) Bernsteinsäureanhydrid in 50 ml wasserfreiem
Pyridin wird während 20 Stunden im Dunkeln unter Argonatmosphäre auf 100 C erhitzt. Die Mischung wird im Vakuum abgedampft und
der Rückstand in Aethylacetat/Benzol (1:1) gelöst. Die Lösung wird mit 2-N Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen. Die
organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulphat getrocknet, filtriert und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand
(6,21 g) wird über 500 g Merck Silikagel 60 chromatographiert.
Es wird mit Chloroform/Methanol (9:1) eluiert. Das erhaltene Produkt wird durch Auflösung in Dichlormethan und Fällung mit
Aceton weiter gereinigt. Man erhält 1,65 g (26%) reines Cholecalciferolhemisuccinat
als ein weisses amorphes Pulver.
Beispiel 2 20
Kupplung von Cholecalciferolhemisuccinat an Rinderserumalbumin .
10 mg (20,6 μΜοΙ) Cholecalciferolhemisuccinat werden in
o,5 ml Dioxan gelöst. 25 μΐ (107 μΜοΙ) Tri-n-butylamin und
anschliessend 20 μΐ (158 μΜοΙ) Chlorameisensäureisobuty!ester
werden zugesetzt und die Mischung wird gemischt. Die Mischung wird mit Eis gekühlt und während 20 Minuten reagieren gelassen.
Die Mischung wird dann tropfenweise einer Lösung von 50 mg (0,6 μΜοΙ) Rinderserumalbumin in 2,5 ml Dioxan/Wasser (1:1)
zugegeben unter Zusatz von 50 μΐ IN Natriumhydroxid. Die
Mischung wird kontinuierlich gerührt und während 4 Stunden in Eis gekühlt. Die Mischung wird anschliessend Übernacht gegen
laufendes Wasser dialysiert. Das Produkt wird durch Einstellen des Pjj-Wertes auf 4,5 mit 0,1-N Chlorwasserstoff säure gefällt
und zentrifugiert (lOOO g, lo Minuten). Der erhaltene Niederschlag
wird in 2 ml Wasser wiederaufgelöst und der P -Wert
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wird mit O,l-N Natriumhydroxidlösung auf 5,5 eingestellt. Das
Produkt wird zweimal umkristallisiert. Das erhaltene Produkt wird erneut aufgelöst, gegen laufendes Wasser dialysiert und
lyophilisiert. Man erhält 33,3 mg an Produkt.
Beispiel 3 Immunisierung und Antikörperherstellung.
Zwölf männliche Hasen werden intradermal mit dem gemäss Beispiel 2 hergestellten Cholecalciferolhemisuccinat-Rinderserum
Albumin Konjugat beimpft. Wie aus der nachstehenden Tabelle
hervorgeht, werden drei verschiedene Arten von Hasen und drei verschiedene Dosen an Konjugat verwendet:
Anzahl und Art der Hasen, welche mit verschiedenen Dosen an Konjugat behandelt v/erden.
| Art der Hasen | Dosis an Konjugat pro Hase |
100 Mg | 200 ug |
| New Zeeland White | 50 μg | 3 | - |
| White Half Lop | 3 | - | 3 |
| Sandy Half Lop | - | - | 3 |
| - |
Zur Immunisierung von jedem Hasen wird die geeignete Dosis an Konjugat in 1 ml normaler Kochsalzlösung gelöst und mit
1 ml von "vollständigem Freund1s-Hilfsstoff" vermischt
(Calbiochem Modifizierung). Die erhaltene 2 ml-Lösung wird,
unterteilt in ungefähr 30 Portionen,intradermal in die rasierte Haut auf der lateralen Seite des Hinterteils der Hasen eingespritzt.
Den 6 Hasen, welche 200 \xq Konjugatdosen erhalten,
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wird vor der Immunisierung Blut aus den Ohradern genommen.
Drei Wochen nach den ursprünglichen Injektionen und anschliessend in einem Zeitintervall von ein oder zwei Wochen wird allen
Hasen Blut aus den Ohradern entnommen. Die Hasen, welche 50 μg
und 100 \iq Konjugatdosen erhalten, werden durch die intramuskuläre
Injektion von respektive 50 ng und 100 pg Konjugat
Tage nach der ursprünglichen Injektion stimuliert. Das gesammelte Hasenblut wird koagulieren gelassen und das Serum wird
innerhalb drei Stunden nach Sammeln getrennt und in aliquoten
Mengen bei -200C aufbewahrt.
Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol
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H-Cholecalciferol
Cholecalciferol
Antiserum in Phosphat-Puffer
NaH3PO4, Na3HPO4
NaH3PO4, Na3HPO4
Natriumbarbiton
Natriumacetat
Chlorwasserstoffsäure
Methanol
Dextran T 40
Dextran T 40
Aktivkohle Norit OL
Triton XlOO Scintillation Grade
Biofluor Scintillation System
Puffer:
0,05-M Phosphatpuffer; pH 7,5
(a) 0,05-M NaH2PO4 2H2O 7,8 g/l
(b) 0,05-M Na2HPO4 7,098 g/l
(a) und (b) in einem Verhältnis von 160 ml: 640 ml gemischt.
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Natriumbarbiton 2,943 g
Natriumacetat 1,943 g
Natriumchlorid 15,3 g
Destilliertes Wasser 1900 ml
0,1-N HCl 57 ml
Dextran beschichtete Aktivkohle:
5% Aktivkohle und 0,25% Dextran T 40 in Barbitonacetat Puffer. Die Mischung wird 30 Minuten vor Verwendung hergestellt
und bei 4 C ständig gerührt.
0,5 ml Phosphat-Puffer enthaltend Antiserum (Verdünnung 1/2000);
20 μΐ Methanol;
2500 Impulse/Minute "^-Cholecalciferol - 8000
d.p.m. (Desintegrationen pro Minute - 15Ö pg (Picograms) ;
Standard Lösungen von Cholecalciferol (0, 250 pg, 500 pg, 1 ng, 2 ng, 4 ng und 8 ng pro Röhrchen) in
Methanol;
10 μΐ Triton XlOO 1:36 in Phosphat-Puffer;
250 μΐ Dextran beschichtete Aktivkohle.
Verfahren:
1. Eine aliquote Menge an Serum erhalten gemäss Beispiel
von ihrer Lagerung:
Phosphat-Puffer verdünnt.
Phosphat-Puffer verdünnt.
wird von ihrer Lagerungstemperatur (-20 C) aufgetaut und in
2. Standardlösungen von nicht-markiertem Cholecalciferol
(ο, 250 pg, 500 pg, 1 ng, 2 ng, 4 ng und 8 ng pro Röhrchen) in Methanol werden den verschiedenen Teströhrchen zugegeben.
3. H-Cholecalciferol wird in die Teströhrchen gegeben.
In jedem Teströhrchen ist das radioaktiv markierte Cholecalciferol in 100 μΐ Methanol gelöst.
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4. Der Inhalt der Teströhrchen wird unter sauerstofffreiem Stickstoff getrocknet.
5. Der Rückstand in jedem Teströhrchen wird in 20 μΐ
Methanol wieder aufgelöst.
6. 0,5 ml Antiserum in Puffer wird jedem Teströhrchen zugesetzt. Der Puffer ist 0,05-M Phosphat-Puffer vom pH 7,5.
7. Der Teströhrcheninhalt wird in einem Vortexmischer gemischt.
8. Die Teströhrchen werden während 1 Stunde bei 25°C inkubiert.
9. Die Teströhrchen werden während 10 Minuten in Eiswasser
gelegt.
10. Jedem Teströhrchen werden 10 μΐ Triton XlOO verdünnt
(1:36) in Phosphat-Puffer zugegeben. Der Teströhrcheninhalt wird in einem Vortexmischer gemischt und die Teströhrchen
werden 10 Minuten stehengelassen.
11. Jedem Teströhrchen werden 250 μΐ Dextran beschichtete
Aktivkohle zugegeben. Der Inhalt der Teströhrchen wird in einem Vortexmischer gemischt und während 12,5 Minuten zentrifugiert
(1800 Umdrehungen/Minute).
12. Aliquote Probemengen (0,5 ml) von der überstehenden Lösung werden in Zählfläschchen gegeben. 5 ml Biofluor Scintillationsflüssigkeit
wird jedem Zählfläschchen zugesetzt. Nach Mischung wird die Radioaktivität gemessen.
13. Die bei verschiedenen Konzentrationen an nicht-markiertem
Cholecalciferol gemessenen Impulse per Minute werden zur Herstellung einer Standardkurve benützt.
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Ί Das obige Verfahren wird mit Serumproben menschlicher
Herkunft an Stelle der Standardlösung von nicht-markiertem Cholecalciferol wiederholt. Vor Durchführung des Verfahrens
werden diese Proben mit Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert, getrocknet, in 7,5-prozentigem Aether in Hexan wiederaufgelöst
und an Kieselsäure chromatographiert. Die Menge an Cholecalciferol in der unbekannten Probe wird durch Vergleich mit der
Standardkurve bestimmt.
Radioimmunverf ahr en zur Bestimmung von lct,25-Dihydroxycholecalciferol
Das Verfahren von Beispiel 4 wird mit H-la,25-Dihydroxycholecalciferol
anstatt H-Cholecalciferol und lcc,25-Dihydroxycholecalciferol
anstatt Cholecalciferol wiederholt.
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Claims (11)
1.) Reagenz zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol enthaltend ein Antikörper erhalten
indem man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel
o-
COOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon, welche
über eine Carboxylgruppe kovalent an ein immunogenes Trägermaterial
gebunden sind, einem Wirtstier injiziert.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I η 2 oder 3 ist.
3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I Cholecalciferolhemisuccinat
ist.
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Trägermaterial ein Protein
ist.
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ORiQlNAL. INSPECTED
■*"■
5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Rinderserumalbumin ist.
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6- Reagenziengarnitur zur Bestimmung von Cholecalciferol
oder la,25-Dihydroxycholecalciferol enthaltend ein Reagenz
gemäss einem der Ansprüche 1 bis
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7. Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol
oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer
bekannten Menge eines radioaktiv markierten Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem
Antikörper, der mit diesem Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv
markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt,
wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel
Ο-*
H3
CO(CH2}nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche
kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten
Cholecalciferols oder optischen Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Cholecalciferols
oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht,
die durch Hinzufügen bekannter Mengen des Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem
definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten Cholecalci-
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ferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und
dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Cholecalciferols oder optischen
Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
8. Radioiiranunverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet,
dass das radioaktiv markierte Cholecalciferol H-Cholecalciferol ist.
9. Radioimmunverfahren zur Bestimmung von la,25-Dihydroxycholecalciferol
oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die
Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren
oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit diesem la,25-Dihydroxycholecalcif
erol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol
oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper
durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel
H3
o··
CO(CH2) nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet
809829/0759
oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche
!covalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten
la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomeren
oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen
la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomers oder
Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen
des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen
Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferol
oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede
bekannte Menge des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen
Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
10. Radioimmunverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,
dass das radioaktiv markierte la,25-Dihydroxychole~
3
calciferol H-Ia,25-Dihydroxycholecalciferol ist.
calciferol H-Ia,25-Dihydroxycholecalciferol ist.
11. Verwendung eines Antikörpers erhalten indem man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel
CO(CH2) pCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon, welche
20 über eine Carboxylgruppe kovalent an ein immunogenes Trägermaterial
gebunden sind, einem Wirtstier injiziert, zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol.
809829/0759
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB539/77A GB1589921A (en) | 1977-01-07 | 1977-01-07 | Radioimmunoassay for the determination of cholecalciferol |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE2800783A1 true DE2800783A1 (de) | 1978-07-20 |
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ID=9706138
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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