DE2800783A1 - Bestimmung von cholecalciferol - Google Patents

Bestimmung von cholecalciferol

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DE2800783A1
DE2800783A1 DE19782800783 DE2800783A DE2800783A1 DE 2800783 A1 DE2800783 A1 DE 2800783A1 DE 19782800783 DE19782800783 DE 19782800783 DE 2800783 A DE2800783 A DE 2800783A DE 2800783 A1 DE2800783 A1 DE 2800783A1
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Germany
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racemate
cholecalciferol
optical enantiomer
dihydroxycholecalciferol
optical
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DE19782800783
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Enrico Baggiolini
@@ Fairney Angela
Milan Radoje Uskokovic
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F Hoffmann La Roche AG
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F Hoffmann La Roche AG
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    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Description

Patentanwälte
Dr. F- arz Lxisrer 9 Q η η 7 ft *3
DipL-lng- He! ^r ι.. >β>κι ^r
8000 Munchsn 20
(.ucile-Grahn-St,·. 22. Tel. (039JW29'
RAN 4093/21
F. Hoffmann-La Roche & Co. Aktiengesellschaft, Basel/Schweiz
Bestiinmuna von Cholecalciferol
Die vorliegende Erfindung betrifft die Bestimmung von Cholecalciferol und von optischen Enantiomeren und Racematen davon. Genauer gesagt bezieht sich die Erfindung auf ein Radioimmunverfahren und ein Reagenz zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol und von optischen Enantiomeren und Racematen davon.
Das erfindungsgemässe Bestimmungsverfahren ist relativ einfach und empfindlich. Ferner erfordert das erfindungsgemässe Radioimmunverfahren bedeutend kleinere Mengen an biologischen Flüssigkeiten als bisher.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich, in einem spezifischen Aspekt, auf ein Hapten, welches zur Herstellung von Antigenen geeignet ist. Dieses Hapten ist eine Verbindung der allgemeinen Formel
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Hen/14.12.1977
2B00783
H3
ο-·
CO(CH2)nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis IO bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon.
• In einer bevorzugten Ausführungsform ist η die Zahl 2 oder 3. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist η die Zahl 2, d.h. die Verbindung der Formel I ist Cholecalciferol-hemisuccinat.
Verbindungen der Formel I und optische Enantiomere und Racemate davon können hergestellt werden, indem man eine Verbindung der allgemeinen Formel
;h3
H3
Il
HO·'"
809829/0759
oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon mit einem Anhydrid der allgemeinen Formel
III
worin η die obige Bedeutung besitzt, umsetzt.
Das obige Verfahren wird in Anwesenheit eines tertiären Amins, welches als Lösungsmittel und Reaktionsbeschleuniger dient, durchgeführt. Geeignete tertiäre Amine sind aliphatische Amine (z.B. Triäthylamin, Tripropylamin, Tributylamin und dergleichen) und heteroaromatische Amine (z.B. Pyridin, Picolin, Lutidin, Collidin, Chinolin und dergleichen). Aromatische tertiäre Amine sind bevorzugt, wobei Pyridin besonders bevorzugt ist.
Das bevorzugte Anhydrid ist Bernsteinsäureanhydrid.
Die Reaktionstemperatur ist nicht wirklich kritisch. Vorzugsweise liegt sie jedoch zwischen ungefähr O°C und dem Siedepunkt des Reaktionsgemisches. Eine Reaktionstemperatur von 100 C ist besonders bevorzugt.
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Weil Cholecalciferol etwas lichtempfindlich ist, erfolgt die Reaktion vorzugsweise, aber nicht zwingend, im Dunkeln. Unter diesen Bedingungen sind die Ausbeuten am gewünschten Hapten etwas besser, als wenn die Reaktion unter normalen Bedingungen durchgeführt wird. Weiter ist es von Vorteil, aber nicht zwingend, die Reaktion in inerter Atmosphäre (z.B. Stickstoff, Argon und dergleichen) durchzuführen, wobei eine Argonatmosphäre bevorzugt ist.
Zur Herstellung eines Antigens kann die Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon über die Carboxylgruppe an ein immunogenes Trägermaterial kovalent gebunden werden.
Der hier verwendete Ausdruck "immunogenes Trägermaterial" umfasst solche Materialien, die bei ihrer Injizierung in Wirtstiere selbständig eine immunogene Reaktion im Wirtstier hervorrufen und die mittels einer kovalenten Bindung an die beschriebene Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon gekuppelt werden können. Geeignete Trägermaterialien sind z.B. Proteine; natürliche oder synthetische polymere Stoffe, wie Polypeptide (z.B. Polylysin und Copolymere von anderen Aminosäuren); Polysaccharide; und dergleichen. Bevorzugte Trägermaterialien sind Proteine und Polypeptide, wobei Proteine besonders bevorzugt sind.
Die Art des als immunogenes Trägermaterial verwendeten Proteins spielt keine besondere Rolle. Beispiele für bevorzugte Proteine sind Säugetier-Serumproteine, wie menschliches γ-Globulin, menschliches Serumalbumin, Rinderserumalbumin, methyliertes Rinderserumalbumin, Hasenserumalbumin und Rinder-y-Globulin. Rinderserumalbumin ist bevorzugt. Es liegt im Vermögen des Fachmannes, weitere geeignete Proteine zu verwenden. Obwohl es nicht unbedingt notwendig ist, werden im allgemeinen bevorzugt solche Proteine verwendet, die für das mit dem Antigen zu behandelnde Wirtstier artfremd sind.
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Die kovalente Bindung einer Verbindung der Formel I oder eines optischen Enantiomers oder Racemats davon an ein immunogenes Trägermaterial kann in der für die Herstellung von Esteroder Amidbindungen üblichen Art erfolgen.
In einer Ausführungs£orm kann z.B. eine Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon vor der Kupplung an ein immunogenes Trägermaterial in eine isolierbare aktivierte Form übergeführt werden. Eine geeignete isolierbare aktivierte Form ist der N-Hydroxysuccinimidester.
Es können auch Verfahren benützt werden, in welchen es nicht notwendig ist, ein aktiviertes Derivat einer Verbindung der Formel I oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu isolieren. Dies kann z.B. durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens oder durch Verwendung von EEDQ (N-Aethoxycarbonyl-2-äthoxy-l,2-dihydrochinolin) als Kupplungsmittel erreicht werden.
Es können auch noch andere Kupplungsverfahren verwendet werden. So kann z.B. die Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon an ein immunogenes Trägermaterial in Gegenwart eines Cafbodiimids, wie z.B. l-Aethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid, erfolgen.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die kovalente Kupplung einer Verbindung der allgemeinen Formel I oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon an ein immunogenes Trägermaterial durch Gebrauch des Mischanhydrid-Verfahrens. In diesem Verfahren wird die Verbindung der Formel I oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon in einem inerten, wasserlöslischen organischen Lösungsmittel (z.B. ein cyclischer Aether wie Dioxan) gelöst und die Lösung mit einem Tri(niederalkyl)amin, wie z.B. Tri-(η-butyl)amin, neutralisiert. Anschliessend wird ein Halogenameisensäureniederalkylester, wie z.B. Chlorameisensäureisobutylester, zugegeben. Die erhaltene
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Lösung wird dann bei einer Temperatur zwischen etwa O bis 8 C einer Lösung des immunogenen Trägermaterials in Wasser oder in einer 1:1 Mischung von Wasser und eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels (z.B. ein cyclischer Aether wie Dioxan) zugegeben, wobei die Lösung des immunogenen Trägermaterials vorher mit Hilfe einer Lösung eines Alkalimetallhydroxids, wie Natriumhydroxid, alkalisch gemacht wird. Die Kupplungsreaktion wird während einer Zeitdauer, welche zwischen 30 Minuten und einer ganzen Nacht liegt, fortgesetzt. Nach Dialyse, Ansäuerung · und Zentrifugieren des gebildeten Niederschlages wird das gewünschte Antigen erhalten.
Die mit Hilfe des obigen Verfahrens hergestellten Antigene können verwendet werden, um die Bildung von gegenüber Cholecalciferol oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon spezifischen Antikörpern in Wirtstieren zu induzieren, indem man das Antigen, vorzugsweise unter Zusatz eines üblichen Hilfsstoffes, diesen Wirtstieren injiziert. Geeignete Wirtstiere sind z.B. Säugetiere, wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Rinder oder Schafe. Erhöhte Antikörpertiter können durch wiederholtes Injizieren über einen gewissen Zeitraum erreicht werden. Die erhaltenen Antisera reagieren unter Komplexbildung mit Cholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon oder mit einem mit Hilfe dieser Verbindungen wie oben beschrieben hergestellten Antigen.
Die auf diese Weise hergestellten Antikörper dienen als Reagenz zur Bestimmung des Gehalts an Cholecalciferol, oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in biologischen Flüssigkeiten, vorzugsweise Plasma.
Weiter ergeben sie eine Kreuzreaktion mit la,25-Dihydroxycholecalciferol und können dementsprechend auch zur Bestimmung dieses Cholecalciferolmetabolits eingesetzt werden. 35
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol
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oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit diesem Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel I oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurdej den Bindungsgrad des markierten Cholecalciferols oder optischen Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Cholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Cholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das radioaktiv markierte Cholecalciferol oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon vorzugsweise mit Tritium ( H), C oder Jod 125 (I) markiert.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Radioimmunverfahren zur Bestimmung von la,25-Dihydroxycholecalciferol oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit
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diesem Ια,-25-Dihydroxycholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel I oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des la-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird das radioaktiv markierte la,25-Dihydroxycholecalciferol oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon vorzugsweise mit Tritium (3H), 14C oder Jod 125 (125I) markiert.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele illustriert.
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Beispiel 1
Cholecalciferolhemisuccinat
Eine Mischung von 5,0 g (13 iriMol) Cholecalciferol und 5,0 g (13 mMol) Bernsteinsäureanhydrid in 50 ml wasserfreiem Pyridin wird während 20 Stunden im Dunkeln unter Argonatmosphäre auf 100 C erhitzt. Die Mischung wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Aethylacetat/Benzol (1:1) gelöst. Die Lösung wird mit 2-N Chlorwasserstoffsäure und Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über wasserfreiem Natriumsulphat getrocknet, filtriert und im Vakuum abgedampft. Der Rückstand (6,21 g) wird über 500 g Merck Silikagel 60 chromatographiert. Es wird mit Chloroform/Methanol (9:1) eluiert. Das erhaltene Produkt wird durch Auflösung in Dichlormethan und Fällung mit Aceton weiter gereinigt. Man erhält 1,65 g (26%) reines Cholecalciferolhemisuccinat als ein weisses amorphes Pulver.
Beispiel 2 20
Kupplung von Cholecalciferolhemisuccinat an Rinderserumalbumin .
10 mg (20,6 μΜοΙ) Cholecalciferolhemisuccinat werden in o,5 ml Dioxan gelöst. 25 μΐ (107 μΜοΙ) Tri-n-butylamin und anschliessend 20 μΐ (158 μΜοΙ) Chlorameisensäureisobuty!ester werden zugesetzt und die Mischung wird gemischt. Die Mischung wird mit Eis gekühlt und während 20 Minuten reagieren gelassen. Die Mischung wird dann tropfenweise einer Lösung von 50 mg (0,6 μΜοΙ) Rinderserumalbumin in 2,5 ml Dioxan/Wasser (1:1) zugegeben unter Zusatz von 50 μΐ IN Natriumhydroxid. Die Mischung wird kontinuierlich gerührt und während 4 Stunden in Eis gekühlt. Die Mischung wird anschliessend Übernacht gegen laufendes Wasser dialysiert. Das Produkt wird durch Einstellen des Pjj-Wertes auf 4,5 mit 0,1-N Chlorwasserstoff säure gefällt und zentrifugiert (lOOO g, lo Minuten). Der erhaltene Niederschlag wird in 2 ml Wasser wiederaufgelöst und der P -Wert
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wird mit O,l-N Natriumhydroxidlösung auf 5,5 eingestellt. Das Produkt wird zweimal umkristallisiert. Das erhaltene Produkt wird erneut aufgelöst, gegen laufendes Wasser dialysiert und lyophilisiert. Man erhält 33,3 mg an Produkt.
Beispiel 3 Immunisierung und Antikörperherstellung.
Zwölf männliche Hasen werden intradermal mit dem gemäss Beispiel 2 hergestellten Cholecalciferolhemisuccinat-Rinderserum Albumin Konjugat beimpft. Wie aus der nachstehenden Tabelle hervorgeht, werden drei verschiedene Arten von Hasen und drei verschiedene Dosen an Konjugat verwendet:
Tabelle
Anzahl und Art der Hasen, welche mit verschiedenen Dosen an Konjugat behandelt v/erden.
Art der Hasen Dosis an Konjugat pro
Hase
100 Mg 200 ug
New Zeeland White 50 μg 3 -
White Half Lop 3 - 3
Sandy Half Lop - - 3
-
Zur Immunisierung von jedem Hasen wird die geeignete Dosis an Konjugat in 1 ml normaler Kochsalzlösung gelöst und mit 1 ml von "vollständigem Freund1s-Hilfsstoff" vermischt (Calbiochem Modifizierung). Die erhaltene 2 ml-Lösung wird, unterteilt in ungefähr 30 Portionen,intradermal in die rasierte Haut auf der lateralen Seite des Hinterteils der Hasen eingespritzt. Den 6 Hasen, welche 200 \xq Konjugatdosen erhalten,
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wird vor der Immunisierung Blut aus den Ohradern genommen.
Drei Wochen nach den ursprünglichen Injektionen und anschliessend in einem Zeitintervall von ein oder zwei Wochen wird allen Hasen Blut aus den Ohradern entnommen. Die Hasen, welche 50 μg und 100 \iq Konjugatdosen erhalten, werden durch die intramuskuläre Injektion von respektive 50 ng und 100 pg Konjugat Tage nach der ursprünglichen Injektion stimuliert. Das gesammelte Hasenblut wird koagulieren gelassen und das Serum wird innerhalb drei Stunden nach Sammeln getrennt und in aliquoten
Mengen bei -200C aufbewahrt.
Beispiel 4
Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol 15
Materialien
H-Cholecalciferol
Cholecalciferol
Antiserum in Phosphat-Puffer
NaH3PO4, Na3HPO4
Natriumbarbiton
Natriumacetat
Chlorwasserstoffsäure
Methanol
Dextran T 40
Aktivkohle Norit OL
Triton XlOO Scintillation Grade
Biofluor Scintillation System
Puffer:
0,05-M Phosphatpuffer; pH 7,5
(a) 0,05-M NaH2PO4 2H2O 7,8 g/l
(b) 0,05-M Na2HPO4 7,098 g/l
(a) und (b) in einem Verhältnis von 160 ml: 640 ml gemischt.
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Barbiton Acetat/Chlorwasserstoffsäure Puffer; pH 7,9
Natriumbarbiton 2,943 g
Natriumacetat 1,943 g
Natriumchlorid 15,3 g
Destilliertes Wasser 1900 ml
0,1-N HCl 57 ml
Dextran beschichtete Aktivkohle:
5% Aktivkohle und 0,25% Dextran T 40 in Barbitonacetat Puffer. Die Mischung wird 30 Minuten vor Verwendung hergestellt und bei 4 C ständig gerührt.
In den Teströhrchen
0,5 ml Phosphat-Puffer enthaltend Antiserum (Verdünnung 1/2000);
20 μΐ Methanol;
2500 Impulse/Minute "^-Cholecalciferol - 8000 d.p.m. (Desintegrationen pro Minute - 15Ö pg (Picograms) ; Standard Lösungen von Cholecalciferol (0, 250 pg, 500 pg, 1 ng, 2 ng, 4 ng und 8 ng pro Röhrchen) in Methanol;
10 μΐ Triton XlOO 1:36 in Phosphat-Puffer;
250 μΐ Dextran beschichtete Aktivkohle.
Verfahren:
1. Eine aliquote Menge an Serum erhalten gemäss Beispiel von ihrer Lagerung:
Phosphat-Puffer verdünnt.
wird von ihrer Lagerungstemperatur (-20 C) aufgetaut und in
2. Standardlösungen von nicht-markiertem Cholecalciferol (ο, 250 pg, 500 pg, 1 ng, 2 ng, 4 ng und 8 ng pro Röhrchen) in Methanol werden den verschiedenen Teströhrchen zugegeben.
3. H-Cholecalciferol wird in die Teströhrchen gegeben. In jedem Teströhrchen ist das radioaktiv markierte Cholecalciferol in 100 μΐ Methanol gelöst.
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4. Der Inhalt der Teströhrchen wird unter sauerstofffreiem Stickstoff getrocknet.
5. Der Rückstand in jedem Teströhrchen wird in 20 μΐ Methanol wieder aufgelöst.
6. 0,5 ml Antiserum in Puffer wird jedem Teströhrchen zugesetzt. Der Puffer ist 0,05-M Phosphat-Puffer vom pH 7,5.
7. Der Teströhrcheninhalt wird in einem Vortexmischer gemischt.
8. Die Teströhrchen werden während 1 Stunde bei 25°C inkubiert.
9. Die Teströhrchen werden während 10 Minuten in Eiswasser gelegt.
10. Jedem Teströhrchen werden 10 μΐ Triton XlOO verdünnt (1:36) in Phosphat-Puffer zugegeben. Der Teströhrcheninhalt wird in einem Vortexmischer gemischt und die Teströhrchen werden 10 Minuten stehengelassen.
11. Jedem Teströhrchen werden 250 μΐ Dextran beschichtete Aktivkohle zugegeben. Der Inhalt der Teströhrchen wird in einem Vortexmischer gemischt und während 12,5 Minuten zentrifugiert (1800 Umdrehungen/Minute).
12. Aliquote Probemengen (0,5 ml) von der überstehenden Lösung werden in Zählfläschchen gegeben. 5 ml Biofluor Scintillationsflüssigkeit wird jedem Zählfläschchen zugesetzt. Nach Mischung wird die Radioaktivität gemessen.
13. Die bei verschiedenen Konzentrationen an nicht-markiertem Cholecalciferol gemessenen Impulse per Minute werden zur Herstellung einer Standardkurve benützt.
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Ί Das obige Verfahren wird mit Serumproben menschlicher
Herkunft an Stelle der Standardlösung von nicht-markiertem Cholecalciferol wiederholt. Vor Durchführung des Verfahrens werden diese Proben mit Chloroform/Methanol (2:1) extrahiert, getrocknet, in 7,5-prozentigem Aether in Hexan wiederaufgelöst und an Kieselsäure chromatographiert. Die Menge an Cholecalciferol in der unbekannten Probe wird durch Vergleich mit der Standardkurve bestimmt.
Beispiel 5
Radioimmunverf ahr en zur Bestimmung von lct,25-Dihydroxycholecalciferol
Das Verfahren von Beispiel 4 wird mit H-la,25-Dihydroxycholecalciferol anstatt H-Cholecalciferol und lcc,25-Dihydroxycholecalciferol anstatt Cholecalciferol wiederholt.
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Claims (11)

Patentansprüche
1.) Reagenz zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol enthaltend ein Antikörper erhalten indem man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel
o-
COOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon, welche über eine Carboxylgruppe kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, einem Wirtstier injiziert.
2. Reagenz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Verbindung der Formel I η 2 oder 3 ist.
3. Reagenz nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der Formel I Cholecalciferolhemisuccinat ist.
4. Reagenz nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das immunogene Trägermaterial ein Protein ist.
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ORiQlNAL. INSPECTED
■*"■
5. Reagenz nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein Rinderserumalbumin ist.
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6- Reagenziengarnitur zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol enthaltend ein Reagenz gemäss einem der Ansprüche 1 bis
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7. Radioimmunverfahren zur Bestimmung von Cholecalciferol oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit diesem Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel
Ο-*
H3
CO(CH2}nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten Cholecalciferols oder optischen Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen Cholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des Cholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten Cholecalci-
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ferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des Cholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
8. Radioiiranunverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte Cholecalciferol H-Cholecalciferol ist.
9. Radioimmunverfahren zur Bestimmung von la,25-Dihydroxycholecalciferol oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man die Probe mit einer bekannten Menge eines radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon und einem Antikörper, der mit diesem la,25-Dihydroxycholecalcif erol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und mit dem radioaktiv markierten Cholecalciferol oder mit einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon unter Komplexbildung reagiert, vermischt, wobei der Antikörper durch Injizieren eines Antigens bestehend aus einer Verbindung der Formel
H3
o··
CO(CH2) nCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet
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oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon, welche !covalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, in Wirtstiere erzeugt wurde; den Bindungsgrad des markierten la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomeren oder Racemats misst und die Menge des in der Probe vorhandenen
la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt, indem man den Bindungsgrad mit einer Standardkurve vergleicht, die durch Hinzufügen bekannter Mengen des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder eines optischen Enantiomeren oder Racemats davon zu einem definierten Gemisch aus dem radioaktiv markierten la,25-Dihydroxycholecalciferol oder einem optischen Enantiomeren oder Racemat davon und dem Antikörper erhalten worden ist, und den Bindungsgrad für jede bekannte Menge des la,25-Dihydroxycholecalciferols oder optischen Enantiomers oder Racemats davon bestimmt.
10. Radioimmunverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktiv markierte la,25-Dihydroxychole~
3
calciferol H-Ia,25-Dihydroxycholecalciferol ist.
11. Verwendung eines Antikörpers erhalten indem man ein Antigen bestehend aus einer Verbindung der allgemeinen Formel
CO(CH2) pCOOH
worin η eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet, oder ein optisches Enantiomeres oder Racemat davon, welche 20 über eine Carboxylgruppe kovalent an ein immunogenes Trägermaterial gebunden sind, einem Wirtstier injiziert, zur Bestimmung von Cholecalciferol oder la,25-Dihydroxycholecalciferol.
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DE19782800783 1977-01-07 1978-01-09 Bestimmung von cholecalciferol Withdrawn DE2800783A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

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GB539/77A GB1589921A (en) 1977-01-07 1977-01-07 Radioimmunoassay for the determination of cholecalciferol

Publications (1)

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DE2800783A1 true DE2800783A1 (de) 1978-07-20

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Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19782800783 Withdrawn DE2800783A1 (de) 1977-01-07 1978-01-09 Bestimmung von cholecalciferol

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JP (1) JPS5388316A (de)
DE (1) DE2800783A1 (de)
DK (1) DK7778A (de)
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GB (1) GB1589921A (de)
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