DE68915476T2 - Diäthylentriaminpentaessigsäure-Derivate. - Google Patents

Diäthylentriaminpentaessigsäure-Derivate.

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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich sowohl auf neue Diethylentriamin-pentaessigsäurederivate (nachstehend DTPA bezeichnet) und einen radioaktiven Metallkomplex derselben als auch auf die Anwendung des Letzeren auf diagnostischem und therapeutischem Gebiet.
    • Hintergrundinformation
  • Mit ¹³¹I markierte Verbindungen sind verbreitet in der Nuklearmedizin zum Nachweis spezieller Erkrankungen, zur pharmakokinetischen Forschung und Therapie spezieller Erkrankungen mittels Radioisotopen verwendet worden. Diese Substanzen besitzen jedoch viele Unzulänglichkeiten, wie etwa (a) eine verhältnismäßig lange Halbwertszeit der Radioaktivität, (b) die Emission nutzloser Betastrahlung neben der Gammastrahlung, (c) das Aussetzen anderen Gewebes als des Zielgewebes der Strahlung, aufgrund einer in vivo-Deiodierung von ¹³¹-I und dergleichen.
  • Im Hinblick auf die Unzulänglichkeiten ist die Verwendung anderer radioaktiver, Metallelemente wie etwa ¹¹¹In und 99mTc als Ersatz für ¹³¹I untersucht worden. Diese Metallelemente werden üblicherweise in mit einem Trägermaterial verbundener Form verwendet, welches eine Ligandenverbindung umfaßt, die an eine physiologisch aktive Substanz gebunden ist. Um physiologisch aktive, hochmolekulare Verbindungen, wie etwa Fibrinogen, TPA (Gewebeplasminogenaktivator), monoklonale Antikörper und deren Fragmente mit Radioisotopen (RI) als Metallelemente zu markieren, sind bifunktionelle Chelatisierungsmittel (BFC) weitläufig verwendet worden. Gebräuchlicherweise verwendete BFC schließen ein Anhydrid (1) von DTPA, einen aktivierten Ester (2) derselben und Ethylendiamintetraessigsäurebenzylisothiocyanat (3) ein.
  • In allen Fällen sind diese BFC durch eine Amidbindung (-NHCO-) an die physiologisch aktiven Substanzen gebunden. Dies bedeutet, daß die verfügbare und somit auswählbare Bindungsstelle auf Aminogruppen beschränkt ist. Dies bedeutet auch, daß wenn die aktive Stelle der betreffenden physiologisch aktiven Substanz einen Lysinrest enthält, eine schwerwiegende Folge wie etwa der Verlust der physiologischen Aktivität auftreten kann. Außerdem können ernste Probleme, eine hohe Aufnahme und lange Verweildauer von RI in normalen Leberzellen, auftreten, wenn eine Amidbindung zum Markieren eines monoklonalen Antikörpers mit RI angewandt wird. Die Ursache des Problems wird vollständig der Tatsache zugeschrieben, daß die Bindung zwischen BFC und physiologisch aktiven Substanzen auf eine Amidbindung beschränkt ist. Insbesondere sind monoklonale Antikörper dazu bestimmt, in normalen Leberzellen metabolisiert zu werden. Bei diesem Vorgang können RI aus BFC-Antikörpern vor ihrer enzymatischen Spaltung von BFC-RI aus Antikörpern aufgrund der größeren Festigkeit der Amidbindung dissoziieren und als Hydrolysate in Leberzellen zurückgehalten werden. Da BFC-RI jedoch wasserlösliche Komplexe sind, werden sie, selbst wenn sie aus biologisch aktiven Substanzen abgespalten werden, in den Blutstrom sekretiert und anschließend über die Niere ausgeschieden, wodurch auf diese Weise keine Probleme auftreten. Es ist daher für notwendig befunden worden, BFC zu entwickeln, die verschiedene, nicht auf eine Amidbindung beschränkte Bindungsweisen bereitstellen können.
  • Auf der anderen Seite haben die Bindungsweisen zwischen der biologisch aktiven Substanz und dem BFC-RI auch eine Bedeutung beim Erhalten einer besseren Diagnosequalität oder einer therapeutischen Wirkung. Zum Beispiel besitzt TPA eine sehr kurze Halbwertsaktivität von nur einigen Minuten im Blutstrom. Wenn RI-markierte TPA zum Diagnostizieren eines Blutgerinnsels gewählt wird, sollte deshalb ein RI mit einer entsprechend kürzeren Halbwertszeit, wie etwa 99mTc (T1/2: 6 Stunden), gewählt werden, aber 99mTc besitzt eine ziemlich lange Halbwertszeit. Da die Zielzelle für TPA-BFC-RI das Blutgerinnsel im Gefäß ist, an welches das verabreichte TPA-BFC-RI bindet, wenn es damit in Berührung gelangt, bleibt das inaktivierte TPA-BFC-RI im Blutstrom, wenn die Inaktivierung von TPA in dem TPA-BFC-RI dem Zerfall des RI vorangeht. Dies beeinflußt die Diagnosequalität nachteilig. Daher ist eine Bindungsweise erwünscht, welche die rasche Abspaltung von BFC-RI aus inaktivierter TPA und damit die rasche usscheidung gestattet. Während in dem vorstehenden Beispiel eine instabile Bindung gegenüber einer stabilen Bindung bevorzugt ist, kann es andere Beispiele geben, bei welchen die vorstehende Beziehung umgekehrt ist. Zum Beispiel ist es bei dem diagnostischen Mittel zum Abbilden von Tumoren, die eine geringere Vaskularisation enthalten, wesentlich oder zumindest erwünscht, daß eine gewisse, zur Diagnose notwendige Menge RI mit der Tumorläsion in Berührung gelangt und daran bindet und sich anreichert.
  • In diesen Fällen werden verhältnismäßig stabile Bindungsweisen bevorzugt. Wenn der zu diagnostizierende oder zu behandelnde Tumor eine große Vaskularisation besitzt, sind stabile Bindungsweisen selbstverständlich nicht bevorzugt. Dementsprechend besteht ein starkes und andauerndes Bedürfnis zur Entwicklung eines BFC, das die breite Auswahl der Bindungsweise gestattet.
  • Es ist ein alternativer, von der Verwendung der vorgenannten BFC (1), (2) und (3) unterschiedlicher Weg vorgeschlagen worden, bei welchem ein Träger durch Bilden einer Schiff-Base von DTPA-mono- (2-aminoethyl)amid mit oxidiertem Inulin (aldehydisches Inulin), gefolgt von der Reduktion (J. Med. Chem. 31, 898-901, 1988) hergestellt wird. Bei diesem Weg ist jedoch die Bindungsweise von Inulin begrenzt und der Weg ist daher nicht befriedigend.
  • Der DTPA-¹¹¹In-Komplex ist als radioaktives diagnostisches Mittel verwendet worden. Ein aromatisches Amidderivat, d.h. das 2- Aminoethylanilid von DTPA, wurde in J. Labelled Comp. Radiopharm., 23, 1291 (1981), beschrieben.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Im ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel I bereit:
  • worin
  • n eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist und
  • A eine durch Reagieren von einer der beiden reaktiven Gruppen eines Vernetzungsreagenzes gebildete monovalente Gruppe ist
  • und physiologisch annehmbare Salze derselben. Eine derartige Verbindung ist als BFC zum Herstellen eines nicht-radioaktiven Trägers für radioaktive Metallelemente brauchbar.
  • Im zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel II bereit:
  • worin
  • n eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist,
  • A' eine durch Reagieren beider reaktiver Gruppen eines Verknüpfungsreagenzes gebildete bivalente Verknüpfungsgruppe ist und
  • B ein Rest einer Polypeptidverbindung ist
  • und physiologisch annehmbare Salze derselben. Eine derartige Verbindung ist als Träger für radioaktive Metallelemente brauchbar.
  • Im dritten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Träger für Radioisotope bereit, der mindestens eine Verbindung der Formel II umfaßt.
  • Im vierten und fünften Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein radioaktives diagnostisches Mittel, das die mit einem radioaktiven Metallelement markierte Verbindung der Formel II umfaßt, beziehungsweise ein radioaktives therapeutisches Mittel bereit, das die mit einem radioaktiven Metallelement markierte Verbindung der Formel II umfaßt.
    • GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • In den vorstehenden Formeln kann n irgendeine ganze Zahl von 2 bis 10 (beides einschließlich), vorzugsweise 2 bis 8 und bevorzugter 2 bis 6, sein. Die Gruppe CnH2n schließt geradkettige (d.h. Polymethylen-) Gruppen und verzweigtkettige (d.h. mit einer oder mehr Methylseitengruppen) Gruppen ein.
  • In der vorstehenden Formel I kann die durch A dargestellte Gruppe jede einwertige Gruppe sein, die durch Reagieren einer der beiden reaktiven Gruppen eines Verknüpfungsmittels gebildet wird. Eine bevorzugte Gruppe A besitzt ein Molekulargewicht von etwa 100 bis etwa 1000 und/oder besitzt wenigstens eine physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe. In der bevorzugteren Gruppe A ist die physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aus der Gruppe ausgewählt, die aus -O-, -COO-, -S-, -SS-, -SO- und -SO&sub2;- besteht.
  • Geeignete Beispiele der Gruppe A schließen
  • ein.
  • In der vorstehenden Formel II kann die durch A' dargestellte Gruppe jede zweiwertige Gruppe sein, die durch Reagieren beider reaktiver Gruppen eines Verknüpfungsmittels gebildet wird. Eine bevorzugte Gruppe A' besitzt ein Molekulargewicht von etwa 60 bis etwa 900 und/oder besitzt wenigstens eine physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe. In der bevorzugteren Gruppe A' ist die physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aus der Gruppe ausgewählt, die aus -O-, -COO-, -S-, -SS-, -SO- und -SO&sub2;- besteht. Geeignete Beispiele der Gruppe A' schließen
  • ein.
  • Das bei den Gruppen A und A' erwähnte Verknüpfungsmittel soll irgendeine Verbindung mit zwei oder mehr reaktiven Gruppen bedeuten, welche mit einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe, einer Mercaptogruppe, einer Dithiogruppe usw. unter Bilden einer Bindung zu deren N-, O- oder S-Atom reagieren können, wobei mindestens eine der reaktiven Gruppen zum Reagieren mit einer Aminogruppe fähig ist. Derartige reaktive Gruppen schließen aktive Ester, wie etwa ein Succinimidylester, Sulfosuccinimidylester usw., Imidoester, Nitroarylhalogenide (wobei diese zum Reagieren mit einer Aminogruppe fähig sind) und Disulfide, Maleimide, Thiophthalimide, aktive Halogene (wobei diese zum Reagieren mit einer Mercaptogruppe fähig sind) und so weiter ein. Das bevorzugte Verknüpfungsreagenz enthält in der anderen Struktureinheit als den reaktiven Gruppen mindestens eine in vivo leicht spaltbare Gruppe oder besitzt mindestens eine durch die reaktionsfähigen Gruppen gebildete Bindung, die in vivo leicht spaltbar ist. Beispiele einer derartigen Bindung sind -O-, -COO-, -S-, -SS-, -SO-, -SO&sub2;- usw.
  • Eine bevorzugte Gruppe von Verknüpfungsreagenzien wird durch die Formel
  • X-Q-Y
  • dargestellt, worin X und Y die gleichen oder verschiedene reaktive Gruppen sind und Q ein Kohlenstoffgerüst ist, mit der Maßgabe, daß Q mindestens ein O- oder S-Atom in dem Grundgerüst enthält oder wo es kein besagtes Atom im Grundgerüst enthält, mindestens eines von X und Y eine reaktive Gruppe ist, die eine in vivo leicht spaltbare Gruppe bildet. Das Kohlenstoffgerüst enthält 2 bis 20, vorzugsweise 3 bis 16, bevorzugter 4 bis 12 Kohlenstoffatome und kann ein Heteroatom(e) als Mitglied eines heteroaromatischen Kerns oder in Form einer funktionellen Gruppe, wie etwa ein Carbonyl, enthalten.
  • Geeignete Beispiele des bifunktionellen Verbrückungsreagenzes sind wie folgt:
  • - Bis[2-(succinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (BSOCOES),
  • - Disuccinimidyltartrat (DST),
  • - 3,3'-Dithiobis(succinimidylpropionat) (DSP),
  • - 3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP),
  • - Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat) (EGS),
  • - Ethylenglykolbis(sulfosuccinimidylsuccinat) (SulfoEGS),
  • - Bis[2-(sulfosuccinimidoxycarbonyloxy)ethyl]sulfon (SulfoBSOCOES),
  • - Dimethyl-3,3'-dithiobispropionimidat 2HCl (DTBP),
  • - Dimethyladipimidat 2HCl (DMA),
  • - Dimethylpimelimidat 2HCl (DMP),
  • - Dimethylsuberimidat 2HCl (DMS),
  • - m-Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (SulfoMBS),
  • - N-Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)propionat (SPDP),
  • - 2-Iminothiolan HCl,
  • - Bis(maleimido)methylether (BMME),
  • - Sulfosuccinimidyl-2-(m-azido-o-nitrobenzamido)ethyl-1,3'- dithiopropionat (SAND),
  • - Sulfosuccinimidyl-2-(p-azidosalicylamido)ethyl-1,3'-dithiobispropionat (SASD).
  • Besonders geeignete Beispiele des Verknüpfungsreagenzes schließen die folgenden Verbindungen ein.
  • Der durch B dargestellte Ausdruck "Polypeptidverbindung" bezieht sich auf Verbindungen mit einer Mehrzahl von Peptidbindungen, die durch natürliche oder unnatürliche Aminosäuren gebildet werden, und gegebenenfalls eine oder mehr Nicht-Peptid-Struktureinheiten, wie etwa ein Zucker, Lipid oder Phosphorsäureester, und schließt sowohl Verbindungen, die dafür bekannt sind, irgendeine besondere physiologische Aktivität (z.B. therapeutische Aktivität) zu besitzen, als auch solche, die nicht dafür bekannt sind, ein. Derartige Verbindungen sind Polypeptide, einfache Proteine und konjugierte Proteine (Lipoproteine und Glykoproteine usw.). Die bevorzugten Polypeptidverbindungen schließen Serumproteine (z.B. Albumin, Fibrinogen usw.), Enzyme (z.B. Urokinase, Streptokinase, TPA usw.), Peptidhormone (z.B. adrenokortikotropes Hormon, thyroidstimulierendes Hormon, Insulin usw.), Antikörper (z.B. IgG, IgE, IgM, IgA, IgD und die Fragmente Fab, Fab', F(ab')&sub2; usw.), Peptidantibiotika (z.B. Bleomycin, Mitomycin usw.) ein. Diejenigen, welche eine spezielle Verteilung, Anreicherung oder in vivo-Verhalten zeigen, sind bevorzugt.
  • Das Radioisotop kann entweder ein Metall oder Nichtmetall sein, ein Metall ist aber bevorzugt. Spezielle Beispiele des radioaktiven Metallatoms schließen ein diagnostisches, Gammastrahlen aussendendes Nuklid (z.B. ¹¹¹In, 99mTc, &sup6;&sup7;Ga usw.), ein diagnostisches, Positronen aussendendes Nuklid (z.B. &sup6;&sup8;Ga, &sup6;²Cu, &sup6;²Zn usw.), ein therapeutisches, Betastrahlen aussendendes Nuklid (z.B. &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup5;³Sm, ²¹²Pb usw.) und ein therapeutisches, Alphastrahlen aussendendes Nuklid (z.B. ²¹¹Bi usw.) ein.
  • Beispiele physiologisch annehmbarer Salze der Verbindungen (I) und (II) schließen Alkalimetallsalze wie etwa Natriumsalze, Kaliumsalze usw. und Ammoniumsalze ein.
  • Die Verbindungen der Formel (I) können durch Umsetzen eines DTPA-Amidderivats mit der folgenden Formel
  • worin n eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist, oder einem Salz desselben mit einem Verknüpfungsmittel hergestellt werden, welches eine Gruppe A dazu liefert. Jedes der vorgenannten Verknüpfungsreagenzien kann bei dieser Reaktion verwendet werden. Diese Reaktion wird durch Vereinigen einer Verbindung (III) und des Verknüpfungsmittels in einem geeigneten Lösungsmittel wie etwa einem Phosphatpuffer und anschließend Rühren bei mäßiger Temperatur, wie etwa zwischen Kühlen und leichtem Erhitzen, zum Beispiel mehrere zehn Minuten bis einige Stunden, zum Beispiel 30-60 Minuten, bei Raumtemperatur durchgeführt. Üblicherweise werden die sich daraus ergebenden Verbindungen (I) ohne Isolierung zum Herstellungsschritt der Verbindungen (II) verwendet, falls es aber besonders erforderlich ist, können sie isoliert werden. Die Isolierung wird durch Anwenden irgendeiner Kombination von Reinigungsverfahren, wie etwa Chromatographie, und Trennverfahren, wie etwa Fällung durch Zusatz eines nicht-wäßrigen Lösungsmittels, durchgeführt. Bevorzugte Beispiele der Verbindungen (I) sind wie folgt:
  • (DTPAM- bedeutet eine DTPA-Monoalkylamidgruppe der Formel:
  • Unter den Verbindungen der Formel III sind diejenigen neu, welche durch die Formel IIIa dargestellt werden:
  • worin n eine ganze Zahl von 3 bis 10 ist.
  • Die Verbindungen (III) können durch Umsetzen von DTPA oder einem reaktionsfähigen Derivat an einer oder mehr Carboxylgruppen desselben (die restlichen Carboxylgruppen können durch irgendeine, herkömmlicherweise bei der Peptidsynthese verwendete Carboxylschutzgruppe geschützt sein) mit einem Diamin H&sub2;NCnH2nNH&sub2; oder einem reaktionsfähigen Derivat an einer oder mehr Aminogruppen desselben (die restliche Aminogruppe kann durch irgendeine Aminoschutzgruppe geschützt sein) und Unterziehen des sich daraus ergebenden Produkts einer Reaktion zur Entfernung der Schutzgruppe hergestellt werden. DTPA ist im Handel erhältlich. Beispiele der reaktionsfähigen Derivate an der Carboxylgruppe von DTPA schließen Säurehalogenide, Säureanhydride (einschließlich gemischter Säureanhydride), aktive Ester, aktive Amide usw., welche herkömmlicherweise zur Peptidsynthese verwendet werden, ein. Unter den Säurehalogeniden wird am häufigsten ein Säurechlorid verwendet. Beispiele der Säureanhydride schließen cyclische Anhydride und gemischte Anhydride, wie etwa ein gemischtes Dialkylphosphorsäureanhydrid, gemischtes Dialkylphosphorsäureanhydrid, gemischtes Alkylkohlensäureanhydrid, gemischtes Anhydrid einer aliphatischen Carbonsäure (z.B. Pivalinsäure, Trichloressigsäure) usw. ein, wobei cyclische Anhydride bevorzugt sind. Beispiele der aktivierten Ester schließen Methylester, Ethylester, Cyanmethylester, p-Nitrophenylester, einen Ester mit N-Hydroxysuccinimid usw. ein. Beispiele der aktivierten Amide schließen ein Amid mit Imidazol, Dimethylimidazol oder Triazol ein. Beispiele der reaktionsfähigen Derivate an der Aminogruppe des Diamins sind Schiffsche Basen mit einem Aldehyd (z.B. Acetaldehyd, Isopentanal, Benzaldehyd), ein Reaktionsprodukt mit einer Silylverbindung (z.B. Trimethylsilylchlorid, Trimethylsilylacetamid), ein Reaktionsprodukt mit einer Phosphorverbindung (z.B. Phosphortrichlorid, Phosphoroxychlorid) usw., welche herkömmlicherweise für die Peptidsynthese ausgewählt werden.
  • Beispiele der Schutzgruppen für die restliche Carboxylgruppe der DTPA schließen diejenigen ein, welche herkömmlicherweise bei der Peptidsynthese ausgewählt werden, wie etwa einen Phthalimidoester, Succinimidomethylester, Pivaloyloxymethylester, Benzylester oder Trimethylsilylester. Beispiele der Schutzgruppen für die restliche Aminogruppe der Verbindung (II) schließen diejenigen ein, welche herkömmlicherweise bei der Peptidsynthese ausgewählt werden, wie etwa Benzyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl, Benzyl, Trityl, Phthaloyl, Trifluoracetyl, Trimethylsilyl usw.
  • Ferner kann die Reaktion durch Verwenden von DTPA als solcher, d.h. in Form der Carbonsäure in Anwesenheit eines herkömmlicherweise zur Peptidsynthese verwendeten Kondensationsmittels, wie etwa SOCl&sub2;, SO&sub2;Cl&sub2;, PCl&sub3;, PCl&sub5;, POCl&sub3;, PBr&sub3; oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), N-Cyclohexyl-N'-morpholinoethylcarbodiimid, N,N'-Diisopropylcarbodiimid, ClCO&sub2;CH&sub3;, ClCO&sub2;C&sub2;H&sub5;, BrCO&sub2;CH&sub3;, (CH&sub3;CO)&sub2;O, N-Ethylbenzisoxazoliumsalze, 2-Chlor-1-methylpyridiniumsalz, N,N'-Carbonyldiimidazol (CDI) usw. bewirkt werden.
  • Die Reaktion kann üblicherweise in einem inerten Lösungsmittel durchgeführt werden. Beispiele des Lösungsmittels schließen Dioxan, Methylenchlorid, Chloroform, Ether, Tetrahydrofuran (THF), Aceton, Dimethylformamid (DMF), Dimethylsulfoxid (DMSO), Pyridin, Acetonitril, Benzol, Toluol, Xylol usw. ein. Um die Nebenproduktbildung zu vermeiden, ist es erwünscht, die Molarität einer der bei der Reaktion verwendeten Verbindungen zu begrenzen oder die Reaktionsbedingungen einzuschränken. Die Schutzgruppen werden durch irgendein herkömmliches Entfernungsverfahren, zum Beispiele Hydrolyse, Reduktion, Reaktion mit Hydrazin oder dergleichen, entfernt. Das Reaktionsprodukt kann durch irgendein herkömmliches Verfahren, wie etwa Konzentrieren, Kristallisation, Chromatographie usw., getrennt und isoliert werden. Die Verbindung (III), in welcher CnH2n CH&sub2;CH&sub2; ist, ist bekannt und kann gemäß dem bekannten Verfahren [J. Med. Chem., 31, S. 898-901 (1988)] hergestellt werden.
  • Die Verbindungen der Formel (II) können durch Umsetzen einer Verbindung der Formel (I) oder ihres Salzes mit einer Polypeptidverbindung, die eine Gruppe B dazu liefert, erhalten werden. Als Polypeptidverbindung werden die vorstehend veranschaulichten verwendet. Diese Reaktion wird durch Vereinigen einer Verbindung (I) und einer Polypeptidverbindung in einem geeigneten Lösungsmittel wie etwa einem Phosphatpuffer und anschließend mehrere zehn Minuten bis einige Stunden, zum Beispiel 30-60 Minuten, Rühren bei mäßiger Temperatur, wie etwa zwischen Kühlen und leichtem Erhitzen, zum Beispiel bei Raumtemperatur durchgeführt. Üblicherweise werden die Verbindungen (I) in situ verwendet, d.h. in der Form, in der sie in der zur Herstellung derselben verwendeten Reaktionslösung enthalten sind. Nachdem die Reaktion beendet ist, wird eine etwaige unumgesetzte reaktive Gruppe in dem Verknüpfungsmittel durch ein geeignetes Anhalte- (oder Abbruchs-) mittel wie etwa Ammoniumacetat zersetzt und anschließend wird die gewünschte Verbindung (II) durch ein geeignetes Trennverfahren wie etwa Chromatographie abgetrennt und isoliert.
  • Die mit einem radioaktiven Metallelement markierten Verbindungen (II) werden durch Zufügen einer wäßrigen Lösung einer wasserlöslichen Verbindung des radioaktiven Metalls zu einer Lösung einer Verbindung (II) erhalten. Als wasserlösliche Verbindung des radioaktiven Metalls wird zum Beispiel ein Halogenid verwendet. Das Markieren wird auf herkömmliche Weise bewirkt.
  • Die Verbindungen (II) sind als Träger für ein radioaktives Element brauchbar. Die Verbindung (II), die vier Carboxylgruppen in dem von DTPA stammenden Teil besitzt und dadurch das Einfangen von Metallatomen erlaubt, ist zum Markieren durch verschiedene Radioisotope geeignet. Die Verbindungen (II) bieten ferner eine äußerst hohe Markierungsausbeute. Daher sind die Verbindungen (II) als Träger für ein radioaktives Element brauchbar.
  • Beim Verwenden als Träger können die Verbindungen (II) in Form einer wäßrigen Lösung gelagert werden, werden aber vorteilhafterweise in fester Form als Lyophilisat aufbewahrt. Im letzteren Fall werden die Verbindungen (II) vor Gebrauch in sterilisiertem Wasser, physiologischer Kochsalzlösung, einem Puffer usw. gelöst. Außerdem kann erforderlichenfalls ein Hilfslösungsvermittler (z.B. ein organisches Lösungsmittel), ein pH-kontrollierendes Mittel (z.B. eine Säure, eine Base, ein Puffer), ein Stabilisator, ein Konservierungsmittel, ein Isotonisierungsmittel, ein Reduktionsmittel, ein Oxidationsmittel (zum Erhalten der Atomvalenz) usw. zugesetzt werden.
  • Die mit einem radioaktiven Metallelement markierte Verbindung (II) kann als radioaktives diagnostisches Mittel durch äußere Messung und mengenmäßige Bestimmung der daraus ausgesandten Radioaktivität verwendet werden. Weiter können sie bei der Radiotherapie zum Behandeln maligner Neoplasmen wie etwa Krebs als therapeutisches Mittel verwendet werden. Für diese Verwendung ist es vorteilhaft, als Polypeptid-Struktureinheit eine solche Verbindung auszuwählen, die sich in einem besonderen Organ oder Gewebe eines diagnostischen oder therapeutischen Ziels anreichert. Derartige Verbindungen schließen zum Beispiel Peptidhormone, Antikörper und deren Fragmente ein. Zum Beispiel wird ein anti-Myokard-Myosin-Antikörper zum Diagnostizieren eines Myokardinfarkts verwendet. Die Menge des radioaktiven Metalls ist eine solche, die eine zum Diagnostizieren ausreichende Information liefern kann oder eine, welche die gewünschte therapeutische Wirkung bereitstellen kann, ist aber wünschenswerterweise eine solche, die eine Strahlungsaussetzung irgendwelcher anderer Organe oder Gewebe so niedrig wie möglich halten kann. Die Verabreichung wird üblicherweise über einen intravenösen Weg bewirkt, aber in Abhängigkeit vom Zweck kann irgendein anderer Verabreichungsweg eingesetzt werden.
  • Da es die Verbindungen (II) der vorliegenden Erfindung erlaubt haben, daß die durch das Verknüpfungsreagenz bereitgestellte Gruppe A' zwischen die DTPA-Struktureinheit und die Polypeptid- Struktureinheit eintritt, wird die Ausdehnung eines Anwendungsbereichs durch Auswählen einer geeigneten Gruppe zum Verleihen einer für den Zweck geeigneten Eigenschaft an die Verbindungen (II) verwirklicht. Zum Beispiel wird durch Einschließen einer in vivo leicht abspaltbaren Gruppe in das Verbrückungsreagenz oder durch Binden des Verbrückungsreagenzes unter Verwenden einer derartigen Gruppe eine Entfernung des radioaktiven Metalls aus dem Blut gefördert, was zum Verringern unerwünschter Nebenwirkungen führt. Ferner wird durch Verwenden einer Substanz, die in einem wäßrigen Lösungsmittel als Verbrückungsreagenz reagiert, die Reaktion unter milden Bedingungen ermöglicht und das Binden an eine weniger stabile Polypeptidverbindung wird erleichtert.
  • Da die DTPA-Struktureinheit und das endständige Amin in den Verbindungen (III) über eine Fettkette (CnH2n) verknüpft sind, wird weiter eine verbesserte molekulare Flexibilität und eine bessere Stabilität nach dem Binden des radioaktiven Metalls daran verglichen mit denjenigen, welche über einen aromatischen Kern verknüpft sind, bereitgestellt. Außerdem besitzen sie verschiedene Vorteile, wie etwa raschere Ausscheidung, weniger Antigenität, leichtere Reinigung usw.
  • Außerdem kann durch geeignetes Auswählen der Verbindung in der Polypeptid-Struktureinheit eine spezielle Verteilung und eine Anreicherung in einem besonderen Organ ermöglicht werden. Dieser Vorteil ist bei einer bekannten Verbindung mit einem Zucker wie etwa Inulin anstelle einer Peptidverbindung nicht zu erkennen.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung werden in vivo (z.B. in der Leber) zu DTPA metabolisiert und rasch (z.B. 90% innerhalb einer Stunde) in den Urin ausgeschieden. Daher ist die Rückhaltezeit in vivo äußerst kurz und somit ist der Zeitraum für das Ausüben einer Toxizität kurz. Wenn sie zum Beispiel einem Tier (einer Ratte) in einer Dosierung von 300 Mikrogramm/kg verabreicht wurde, starb kein Tier und im Verhalten wurde während dieses Versuchs und bei einer Autopsie keine Abnormitäten beobachtet. Da die vorstehende verabreichte Menge etwa das 20fache der geschätzten Menge in einer klinischen Dosierung ist, zeigen die vorstehenden Ergebnisse an, daß die Verbindungen der vorliegenden Erfindung eine äußerst hohe Sicherheit besitzen.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele in größerer Einzelheit veranschaulicht.
  • In den Beispielen wird, solange nicht anders definiert, % als Gew.-% angegeben. Die folgende Abkürzung wird gebraucht.
  • DTPA = Diethylentriaminpentaessigsäure;
  • hxnDTPA = N-[2-Bis(carboxymethyl)aminoethyl]-N-[2-carboxymethyl- 2-(6-aminohexyl)carbamoylmethyl)glycin [oder Diethylentriaminpentaessigsäuremono(6-aminohexyl)amid];
  • etnDTPA = N-[2-Bis(carboxymethyl)aminoethyl]-N-[2-carboxymethyl- 2-(2-aminoethyl)carbamoylmethyl]glycin [oder Diethylentriaminpentaessigsäuremono(2-aminoethyl)amid];
  • prnDTPA = N-[2-Bis(carboxymethyl)aminoethyl]-N-[2-carboxymethyl- 2-(3-aminopropyl)carbamoylmethyl]glycin [oder Diethylentriaminpentaessigsäuremono(3-aminopropyl)amid;
  • DTSSP = 3,3'-Dithiobis(sulfosuccinimidylpropanat);
  • EGS = Ethylenglykolbis(succinimidylsuccinat);
  • AMFab = anti-Myokard-Myosin-Antikörperfragment.
    • Beispiel 1: Herstellung eines Derivats von Diethylentriaminpentaessigsäure n = 6: hxnDTPA)
  • DTPA-Anhydrid (5,3 g, 14,8 mMol) wurde in Dimethylformamid (150 ml) suspendiert (nachstehend als Lösung A bezeichnet). Einer Lösung in Dimethylformamid (50 ml) gelösten 6-[N-(t-Butoxycarbonyl)amino]hexylamin-hydrochlorid ¼-Hydrats (1,5 g, 5,83 mMol) wurde wäßriges 5N NaOH (1,17 ml) zugesetzt (nachstehend als Lösung B bezeichnet). Lösung B wurde Lösung A tropfenweise bei Raumtemperatur unter Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt und man ließ anschließend weitere 30 Minuten reagieren. Die Reaktionslösung wurde klar und Dimethylformamid wurde unter Ergeben eines sirupösen Rückstands abdestilliert. Der sirupöse Rückstand wurde der Reihe nach mit 8 ml Wasser und anschließend 6 ml konzentrierter Salzsäure zum hydrolysieren unumgesetzten Anhydrids und Entfernen der Schutzgruppe behandelt. Danach wurde die hxnDTPA durch Säulenchromatographie unter Verwenden eines Kationenaustauschharzes (S-Sepharose FF, H&spplus;-Form) fraktioniert. Die sich daraus ergebende Fraktion wurde eingeengt und das Aceton wurde eingeengt und Aceton wurde unter Ergeben einer stark hygroskopischen, weißen Fällung zugesetzt (Ausbeute: 1,3 g). Dieses Produkt wurde durch die folgende Analyse als hxnDTPA identifiziert. DSC: stationäre Phase: Kieselgel, Entwicklungslösungsmittel: 10%ige wäßrige Lösung von Ammoniumacetat/Methanol = 1/3, ein einzelner Fleck erschien bei Rf = 0,33 durch I&sub2;-Anfärben und Ninhydrin-Anfärben. Analyse: C&sub2;&sub0;H&sub3;&sub7;O&sub9;N&sub5; 3HCl 2H&sub2;O 2[CH&sub3;COCH&sub3;]
  • FD-Massenspektrum: der Molpeak (hxnDTPA H&spplus;) wurde bei m/e = 492 festgestellt.
  • ¹³C-NMR: gemessen in D&sub2;O mittels eines Verfahrens mit einem externen Standard, wo sich das Dioxansignal bei 67,4 ppm befand. Die eingesetzten Meßweisen waren vollständige Entkopplung und Off-Resonanz. Chemische Verschiebungen nachgewiesene Peaks /ppm Zuordnung (unterstrichenes C-Atom)
  • Die Aufpaltungsweise eines Peaks bei der Messung im Off-Resonanz-Modus wird in Klammern dargestellt. s: Singulett, t: Triplett
    • Beispiel 2: Herstellung eines Derivats von Diethylentriaminpentaessigsäure (n = 3: prnDTPA)
  • DTPA-Anhydrid (2,5 g, 7,0 mMol) wurde in Dimethylformamid (70 ml) suspendiert (nachstehend als Lösung A bezeichnet). Einer Lösung in Dimethylformamid (24 ml) gelösten 2-[N-(t-Butoxycarbonyl)amino]propylamin-hydrochlorid ¼-Hydrats (0,59 g, 2,74 mMol) wurde wäßriges 5N NaOH (0,55 ml) zugesetzt (nachstehend als Lösung B bezeichnet). Lösung B wurde Lösung A tropfenweise bei Raumtemperatur unter Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt und man ließ anschließend weitere 30 Minuten reagieren. Die Reaktionslösung wurde klar und Dimethylformamid wurde unter Ergeben eines sirupösen Rückstands abdestilliert. Der sirupöse Rückstand wurde der Reihe nach mit 3,8 ml Wasser und anschließend 2,8 ml konzentrierter Salzsäure zum hydrolysieren unumgesetzten Anhydrids und Entfernen der Schutzgruppe behandelt. Danach wurde die prnDTPA durch Säulenchromatographie unter Verwenden eines Kationenaustauschharzes (S-Sepharose FF, H&spplus;-Form) fraktioniert. Die erhaltene Fraktion wurde eingeengt und Aceton wurde unter Ergeben einer stark hygroskopischen, weißen Fällung zugesetzt (Ausbeute: 0,85 g). Dieses Produkt wurde durch die folgende Analyse als prnDTPA identifiziert. FD-Massenspektrum: Der Molpeak (prnDTP H&spplus;) wurde bei m/e = 450 festgestellt.
  • ¹³C-NMR: gemessen in D&sub2;O mittels Tetramethylsilylpropionsäure als externem Standard. Chemische Verschiebungen nachgewiesener Peaks /ppm Zuordnung (unterstrichenes C-Atom)
    • Beispiel 3: Herstellung eines Derivats von Diethylentriaminpentaessigsäure (n = 2: etn DTPA).
  • DTPA-Anhydrid (2,5 g, 7,0 mMol) wurde in Dimethylformamid (70 ml) suspendiert (nachstehend als Lösung A bezeichnet). Einer Lösung in Dimethylformamid (24 ml) gelösten 2-[N-(t-Butoxycarbonyl)amino]ethylamin-hydrochlorid ¼-Hydrats (0,55 g, 2,74 mMol) wurde wäßriges 5N NaOH (0,55 ml) zugesetzt (nachstehend als Lösung B bezeichnet). Lösung B wurde Lösung A tropfenweise bei Raumtemperatur unter Rühren über einen Zeitraum von 30 Minuten zugesetzt und man ließ anschließend weitere 30 Minuten reagieren. Die Reaktionslösung wurde klar und Dimethylformamid wurde unter Ergeben eines sirupösen Rückstands abdestilliert. Der sirupöse Rückstand wurde der Reihe nach mit 3,8 ml Wasser und anschließend 2,8 ml konzentrierter Salzsäure zum hydrolysieren unumgesetzten Anhydrids und Entfernen der Schutzgruppe behandelt. Danach wurde die etnDTPA durch Säulenchromatographie unter Verwenden eines Kationenaustauschharzes (S-Sepharose FF, H&spplus;-Form) fraktioniert. Die sich daraus ergebende Fraktion wurde eingeengt und Aceton wurde unter Ergeben einer stark hygroskopischen, weißen Fällung zugesetzt (Ausbeute: 0,85 g). Dieses Produkt wurde durch die folgende Analyse als etnDTPA identifiziert.
  • DSC: stationäre Phase: Kieselgel, Entwicklungslösungsmittel: 10%ige wäßrige Lösung von Ammoniumacetat/Methanol = 1/1, ein einzelner Fleck erschien bei Rf = 0,48 durch I&sub2;-Anfärben und Ninhydrin-Anfärben.
  • FD-Massenspektrum: Der Molpeak (etnDTPA H&spplus;) wurde bei m/e = 436 bestätigt.
  • ¹³C-NMR: mittels desselben Verfahrens und auf dieselbe Weise wie diejenige von Beispiel 1 gemessen. Chemische Verschiebungen nachgewiesene Peaks /ppm Zuordnung (unterstrichenes C-Atom)
  • Die Aufspaltungsweise eines Peaks bei der Messung im Off-Resonanz-Modus wird in Klammern dargestellt. s: Singlett, t: Triplett
    • Beispiel 4: Herstellung von EGS-hxnDTPA
  • Einer Lösung von hxnDTPA-hydrochlorid in DMF (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 2 ml) wurden 40 ul 5N NaOH, anschließend eine Lösung von EGS in DMF (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 2 ml) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde EGS-hxnDTPA durch Säulenchromatographie mittels TSK G-1000H (Elutionsmittel: DMF) fraktioniert. Das Lösungsmittel wurde aus der erhaltenen Fraktion abdestilliert und Aceton wurde dazugesetzt, um eine stark hygroskopische, weiße Fällung zu ergeben.
    • Beispiel 5: Herstellung von Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA
  • Einer neutralen wäßrigen Lösung von hxnDTPA (2 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 50 ul) wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 200 ul), anschließend eine Lösung von DTSSP in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 5,75 x 10&supmin;&sup5; Mol/ml, 175 ul, 1,01 x 10&supmin;&sup5; Mol) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Sekunden bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung (110 ul) wurde einer Lösung von Rinder-IgG in 0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5, 15 mg/ml, 1,6 ml) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 30 ul 1M wäßriges Ammoniumacetat dazugesetzt und das Gemisch wurde zum Zersetzen unumgesetzten DTSSP 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine monomere Fraktion wurde durch Gelchromatographie mittels Sephacryl S-300SF [2,2 cm (Säuleninnendurchmesser) x 75 cm (Länge), Elutionspuffer: 0,2 M Zitronensäure (pH 5,8), Elutionsgeschwindigkeit: etwa 15,5 ml/h] unter Ergeben der gewünschten Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA abgetrennt.
    • Beispiel 6: Herstellung von Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA
  • Einer neutralen wäßrigen Lösung von hxnDTPA (2 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 50 ul) wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 200 ul), anschließend eine Lösung von EGS in Dimethylsulfoxid (1,01 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 120 ul, 1,3 x 10&supmin;&sup5; Mol) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde etwa eine Minute bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung (50 ul) wurde einer Lösung von Rinder-IgG in 0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,5, 15 mg/ml, 1,6 ml) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurden 30 ul 1M wäßriges Ammoniumacetat dazugesetzt und das Gemisch wurde zum Zersetzen unumgesetzten EGS 10 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Eine monomere Fraktion wurde durch Gelchromatographie mittels Sephacryl S-300SF [2,2 cm (Säuleninnendurchmesser) x 75 cm (Länge), Elutionspuffer: 0,2 M Zitronensäure (pH 5,8), Elutionsgeschwindigkeit: etwa 16 ml/h] unter Ergeben der gewünschten Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA abgetrennt.
    • Beispiel 7: Herstellung von AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA
  • Einer neutralen wäßrigen Lösung von hxnDTPA (2 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 60 ul) wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 0,42 ml), anschließend eine Lösung von DTSSP in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 30,43 mg/ml, 0,12 ml) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC gerührt. Diese Lösung (0,45 ml) wurde einem Gemisch einer Lösung von AMFab in 0,05M Phosphatpuffer (pH 7,8, 15 mg/1,5 ml) und 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 0,45 ml) zugesetzt und das Gemisch wurde drei Stünden bei 4ºC gerührt. Anschließend wurden 0,1 ml 1M wäßriges Ammoniumacetat dazugesetzt und das Gemisch wurde zum Zersetzen unumgesetzten DTSSP eine Stunde bei 4ºC gerührt. Eine monomere Fraktion wurde durch Gelchromatographie mittels Sephacryl S-200SF [2,2 cm (Säuleninnendurchmesser) x 50 cm (Länge), Elutionspuffer: 0,1 M Zitronensäure (pH 6), Elutionsgeschwindigkeit: etwa 15,5 ml/h] unter Ergeben der gewünschten AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA abgetrennt.
    • Beispiel 8: Herstellung von AMFab-(DTSSP)-etnDTPA
  • Einer neutralen wäßrigen Lösung von etnDTPA (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 87,5 ul) wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 263 ul), anschließend eine Lösung von DTSSP in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 5 x 10&supmin;&sup5; mol/ml, 100 ul) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC gerührt. Die sich daraus ergebende Lösung (180 ul) wurde einem Gemisch einer Lösung von AMFab in 0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,8, 10,8 mg/ml, 0,58 ml) und 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 180 ul) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde drei Stunden bei 4ºC gerührt. Anschließend wurden 100 ul 1M wäßriges Ammoniumacetat dazugesetzt und das Gemisch wurde zum Zersetzen unumgesetzten DTSSP eine Stunde bei 4ºC gerührt. Eine monomere Fraktion wurde durch Gelchromatographie mittels TSKG-2000SM [0,75 cm (Säuleninnendurchmesser) x 30 cm (Länge) + 0,75 cm (Schutzsäuleninnendurchmesser), Elutionspuffer: 0,1 M Zitronensäure (pH 6), Elutionsgeschwindigkeit: etwa 0,75 ml/min] unter Ergeben der gewünschten AMFab-(DTSSP)-etnDTPA abgetrennt.
    • Beispiel 9: Herstellung von Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA¹¹¹In und Bioverteilung in Ratten
  • Einer Lösung von Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA (2,5 ml, entsprechend 1,56 mg IgG), die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 5 erhalten wurde, wurde eine ¹¹¹InCl&sub3;-Lösung (0,2 ml, 2 mCi/ml) unter Ergeben des Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In zugesetzt. Um die Markierungsausbeute zu untersuchen, wurde es der DSC mittels Kieselgel als stationärer Phase und 10% wäßrigem CH&sub3;COONH&sub4;/CH&sub3;OH = 1/3 als Entwicklungslösungsmittel unterzogen und das Scannen wurde mittels eines Radiochromatoscanners durchgeführt. 99,5% der Radioaktivität wurden am Start nachgewiesen, während die restlichen 0,5% nahe Rf = 0,35, entsprechend ¹¹¹In-hxnDTPA usw., beobachtet wurden.
  • Aus den vorstehenden Ergebnissen kann angenommen werden, daß das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte Rinder-IgG- (DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In eine Markierungsausbeute von 99,5% besitzt.
  • Das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte Rinder-IgG- (DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In wurde mehreren weiblichen SD-Ratten intravenös injiziert (Dosis: 0,1 ml je Tier, entsprechend etwa 58 ug IgG und etwa 15 uCi ¹¹¹In) und der zeitliche Verlauf der Bioverteilung wurde untersucht.
  • Als Kontrolle wurde dieselbe Untersuchung wie vorstehend unter Verwenden von ¹¹¹-In-markierter Rinder-IgG-DTPA durchgeführt, die nach dem herkömmlichen DTPA-Anhydridverfahren erhalten wurde (die Markierungsausbeute einer Probe zur Verabreichung betrug 97,3%).
  • Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle dargestellt. Aus den in der Tabelle dargestellten Werten versteht sich, daß diejenigen, welche DTSSP als Abstandsgruppe einsetzen, eine hohe renale Anreicherung, aber eine rasche Entfernung aus dem Blut zeigen, die zu einer raschen Ausscheidung über den Urin führt, und eine niedrige, nicht-spezifische Verteilung im übrigen Gesamtkörper (Knochen, Muskel, Haut usw.) besitzen. Weiter zeigt ihre niedrige Anreicherung in der Leber eindeutig eine Wirkung, die aus dem Einbau von -S-S- zwischen dem Protein und dem Chelat folgt. Tabelle 1: Rinder-IgG-(DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet. Tabelle 2: Rinder-IgG-DTPA-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet.
    • Beispiel 10: Herstellung von Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA-¹¹¹In und Bioverteilung in Ratten
  • Einer Lösung von Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA (2,5 ml, entsprechend 2,1 mg IgG), die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 6 erhalten wurde, wurde einer ¹¹¹InCl&sub3;-Lösung (0,2 ml, 2 mCi/ml) unter Ergeben des Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA-¹¹¹In zugesetzt.
  • Um die Markierungsausbeute zu untersuchen, wurde es der DSC gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 unterzogen. Als Ergebnis lagen 99,7% der Radioaktivität am Start vor, während die restlichen 0,3% nahe Rf = 0,35, entsprechend ¹¹¹In-hxnDTPA usw., beobachtet wurden. Daher kann angenommen werden, daß die Markierungsausbeute 99,7% betrug.
  • Das durch das vorstehende Verfahren hergestellte Rinder-IgG- (EGS)-hxnDTPA-¹¹¹In wurde gemäß dem Verfahren von Beispiel 9 zum Untersuchen des zeitlichen Verlaufs der Bioverteilung in Ratten verwendet.
  • Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle dargestellt. Aus den in der Tabelle dargestellten Werten versteht sich, daß die Wahl von EGS als Abstandsgruppe (d.h. das Einbauen einer Esterbindung zwischen das Protein und das Chelat) zu einer beschleunigung der Entfernung aus dem Blut und damit einer Förderung der Ausscheidung über den Urin führt. Es kann angenommen werden, daß zur selben Zeit eine die Anreicherung in der Leber und dem übrigen Gesamtkörper verringernde Wirkung erhalten wurde. Tabelle 3: Rinder-IgG-(EGS)-hxnDTPA-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Tabelle 4: Rinder-IgG-DTPA-¹¹¹In Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet. Tabelle 4: Rinder-IgG-DTPA-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet.
    • Beispiel 11: Herstellung von AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In
  • Einer Lösung von AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA (1 ml, entsprechend 0,5 mg Fab), die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 7 erhalten wurde, wurde einer ¹¹¹InCl&sub3;-Lösung (1 ml, 2 mCi/ml) unter Herstellen des AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In zugesetzt.
  • Um die Markierungsausbeute zu untersuchen, wurde es der DSC mittels Kieselgel als stationärer Phase und 10% CH&sub3;COONH&sub4;/MeOH = 1/1 als Entwicklungslösungsmittel unterzogen und das Scannen wurde mittels eines Radiochromatoscanners durchgeführt. 98,7% der Radioaktivität lagen am Start vor, während die restlichen 1,3% nahe Rf = 0,5, entsprechend ¹¹¹In-hxnDTPA usw., beobachtet wurden. Daher kann angenommen werden, daß das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte AMFab-(DTSSP)-hxnDTPA-¹¹¹In eine Markierungsausbeute von 98,7% besitzt.
  • Das durch das vorstehende Verfahren hergestellte AMFab-(DTSSP)- hxnDTPA-¹¹¹In wurde durch einen Radioimmuntest mittels Myokard- Primärmyosin als Antigen auf seine Affinitätskonstante untersucht, wobei sich verglichen mit Ka = 1,0 x 10&sup8; M&supmin;¹ für einen durch ein herkömmlich ausgewähltes DTPA-Anhydridverfahren hergestellten Antikörper ein überlegenes Ergebnis von Ka = 1,5 x 10&sup8; M&supmin;¹ ergab.
    • Beispiele 12: Herstellung von AMFab-(DTSSP)-etnDTPA-¹¹¹In
  • Einer Lösung von AMFab-(DTSSP)-etnDTPA (1 ml, entsprechend 0,5 mg Fab), die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 8 erhalten wurde, wurde einer ¹¹¹InCl3-Lösung (1 ml, 2 mCi/ml) unter Ergeben von AMFab-(DTSSP)-etnDTPA-¹¹¹In zugesetzt.
  • Um die Markierungsausbeute zu untersuchen, wurde es der DSC gemäß dem Verfahren von Beispiel 9. Als Ergebnis lagen 98,2% der Radioaktivität am Start vor, während die restlichen 1,8% nahe Rf = 0,5, entsprechend ¹¹¹In-etnDTPA usw., beobachtet wurden. Daher kann angenommen werden, daß das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte AMFab-(DTSSP)-etnDTPA-¹¹¹In eine Markierungsausbeute von 98,2 % besitzt.
  • Auf Beispiel 11 ähnliche Weise wurde eine Affinitätskonstante von AMFab-(DTSSP)-etnDTPA-¹¹¹In gemessen und es wurde auch ein befriedigendes Ergebnis von Ka = 1,8 x 10&sup8; M&supmin;¹ erhalten.
    • Beispiel 13: Ausbeute der Entfernung unumgesetzter bifunktioneller Liganden
  • In Beispiel 7 beziehungsweise 8 hergestellte AMFab-(DTSSP)- hxnDTPA und AMFab-(DTSSP)-etnDTPA wurden auf die Ausbeute der Entfernung unumgesetzter, freier, bifunktioneller Liganden nach der Reaktion hin beurteilt. Als Kontrolle wurde herkömmlicherweise als bifunktioneller Ligand ausgewählte wasserfreie DTPA verwendet. Als Reinigungsverfahren wurde die gegenwärtig als am wirksamsten angesehene Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet (Säule: TSK G-2000SW und TSK G-3000SW, Elutionsgeschwindigkeit 0,75 ml/min). Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle dargestellt. Tabelle 5: Säule: TSK G-2000SW Elutionspuffer Bindungsweise Zitronensäure 0,1M Zitronensäure in Kochsalzlösung Säule: TSK G-2000SW Elutionspuffer Bindungsweise Zitronensäure 0,1M Zitronensäure in Kochsalzlösung 1) Vorstehende % zeigen den durch den freien ¹¹¹-In-Liganden dargestellten Peakwert an, wenn die isolierte monomere Fraktion mit ¹¹¹-In markiert war. 2) Alle vorstehenden Elutionspuffer besitzen pH 6.
  • Aus den in der vorstehenden Tabelle dargestellten Ergebnissen versteht es sich, daß die durch das Verfahren dieser Erfindung erhaltene Reinigungsausbeute viel höher ist, als die durch irgendein anderes Verfahren, und daher nicht zusammen mit irgendeinem anderen Reinigungsverfahren verwendet werden braucht. Es kann angenommen werden, daß dies einen ausgezeichneten ökonomischen Vorteil bietet.
    • Beispiel 14: Herstellung von AMFAB-(DTSSP)-prnDTPA
  • Einer neutralen wäßrigen Lösung von prnDTPA (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 36,6 ul) wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 163,4 um), anschließend eine Lösung von DTSSP in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 9,2, 2,09 x 10&supmin;&sup5; mol/ml, 100 ul) zugesetzt und das sich daraus ergebende Gemisch wurde 30 Minuten bei 4ºC gerührt. Dieser Lösung wurde eine Lösung von AMFab in 0,05M phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,8, 10,8 mg/ml, 500 ul) zugesetzt und das Gemisch wurde drei Stunden bei 4ºC gerührt. Anschließend wurden 50 ul 1M wäßriges Ammoniumacetat dazugesetzt und das Gemisch wurde zum Zersetzen unumgesetzten DTSSP eine Stunde bei 4ºC gerührt. Anschließend bewirkte die Gelsäulenchromatographie mittels TSKG- 2000SW [0,75 cm (Säuleninnendurchmesser) x 30 cm (Länge) + 0,75 cm (Schutzsäuleninnendurchmesser) + 7,5 cm (Länge), Elutionspuffer: 0,1 M Citratpuffer (pH 6), Elutionsgeschwindigkeit: 0,75 ml/min] das Abtrennen einer monomeren Fraktion, welche die AMFa- b-(DTSSP)-prnDTPA ergab.
    • Beispiel 15: Herstellung von AMFab-(DTSSP)-prnDTPA-¹¹¹In und die Bioverteilung und Ausscheidung in Ratten.
  • Einer Lösung von AMFab-(DTSSP)-prnDTPA (1 ml, entsprechend 0,5 mg Fab), die entsprechend dem Verfahren von Beispiel 14 erhalten wurde, wurde einer ¹¹¹InCl&sub3;-Lösung (1 ml, 2 mCi/ml) unter Ergeben von AMFab-(DTSSP)-prnDTPA-¹¹¹In zugesetzt. Um die Markierungsausbeute zu untersuchen, wurde es der DSC mittels Kieselgel als stationärer Phase und 10% wäßrigem CH&sub3;COONH&sub4;/CH&sub3;OH = 1/1 als Entwicklungslösungsmittel unterzogen und das Scannen wurde mittels eines Radiochromatoscanners durchgeführt. 97,6% der Radioaktivität wurden am Start nachgewiesen, während die restlichen 2,4% nahe Rf = 0,45, entsprechend prnDTPA-¹¹¹In usw., beobachtet wurden. Es kann daher angenommen werden, daß das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte AMFab-(DTSSP)-prnDTPA- ¹¹¹In eine Markierungsausbeute von 97,6% besitzt.
  • Das gemäß dem vorstehenden Verfahren hergestellte AMFab-(DTSSP)- prnDTPA-¹¹¹In wurde mehreren weiblichen SD-Ratten intravenös injiziert (Dosis: 0,1 ml je Tier, entsprechend etwa 25 ug Fab und etwa 100 uCi ¹¹¹In) und der zeitliche Verlauf der Bioverteilung wurde untersucht. Ferner wurde 3 Stunden nach der Injektion ein Teil des Urins zum Untersuchen von Metaboliten im Urin durch HPLC analysiert [Säule: TSK G-2000SW, 0,75 cm Säuleninnendurchmesser) x 30 cm (Länge) + 0,75 cm (Schutzsäuleninnendurchmesser) x 7,5 cm (Länge), Elutionspuffer: 0,1% Polyethylenglykol enthaltender 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7), Elutionsgeschwindigkeit: 0,75 ml/min, Detektor: ein Einkanalanalysator (Gammastrahlen von 171 keV, 245 keV nachweisbar).
  • Als Kontrolle wurde dieselbe Untersuchung wie vorstehend unter Verwenden von ¹¹¹-In-markierte AMFab-DTPA durchgeführt, die nach dem herkömmlichen DTPA-Anhydridverfahren erhalten wurde (die Markierungsausbeute einer Probe zur Verabreichung betrug 85,8%).
  • Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle dargestellt. Aus den in der Tabelle dargestellten Werten versteht sich, daß es bei der Bioverteilung aus zwei Gründen wenig offensichtliche Unterschiede gibt, d.h. aus dem einen Grund, daß die Markierungsausbeute des als Kontrolle eingesetzten AMFab-DTPA-¹¹¹-In niedrig ist (bei der Herstellung von AMFab-DTPA ist unumgesetzte, freie DTPA schwierig zu entfernen, so daß freies DTPA-¹¹¹In nur bis zu 14,2% enthalten bliebe. Sobald freies DTPA-¹¹¹-In verabreicht wird, verschwindet es rasch aus dem Blut, um in den Urin ausgeschieden zu werden) und aus dem anderen Grund, daß AMFab, das nur ein geringes Molekulargewicht besitzt (etwa 50000) an sich dazu neigt, der Ausscheidung durch glomeruläre Filtration (wird im Tubulus schwierig resorbiert) in Ratten unterworfen zu werden. Die Ergebnisse der HPLC-Urinanalyse während drei Stunden nach der Verabreichung zeigen jedoch an, daß im Fall, wenn DTSSP als Abstandsgruppe ausgewählt wird, obschon nur einige wenige % freie prnDTPA-¹¹¹In in den Proben zur Verabreichung enthalten sind, die aus Molekülen mit niedrigem Molekulargewicht stammenden Bestandteile zu nicht weniger als 48,3% im Urin nachgewiesen wurden (die übrigen 51,7% waren diejenigen, welche in Form von Fab-(DTSSP)-prnDTPA-¹¹¹In ausgeschieden wurden, bei welchem das Molekulargewicht von Fab, wie vorstehend erwähnt, klein war). Dies trat deshalb auf, weil der Abstandsgruppenteil zum Freisetzen der PrnDTPA-¹¹¹In-Struktureinheit einer Metabolyse ausgesetzt wurde, gefolgt von der Ausscheidung in den Urin. Falls Ratten als Kontrollsubstanz Fab-DTPA-¹¹¹In injiziert wurde, wurden nur die niedermolekularen, radioaktiven Bestandteile, deren Menge derjenigen von in der Probe zur Verabreichung enthaltenem freiem DTPA-¹¹¹In entsprach, im Urin nachgewiesen und es wurde bestätigt, daß bei durch das herkömmliche DTPA-Anhydridverfahren hergestelltem Fab-DTPA die Bindung zwischen Protein und Chelat zu stark war, um in vivo metabolisiert zu werden. Auf diese Weise zeigte die Analyse der Ausscheidung über den Urin eindeutig eine Wirkung des Einbaus von -S-S- zwischen Protein und Chelat. Tabelle 6: AMFab-DTSSP-prnDTPA-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut* * Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet. Tabelle 7: AMFab-¹¹¹In injizierte Dosis / Organ (%) Zeit nach der Verabreichung (Stunden) Organe Leber Milz Nieren Herz Lunge Magen Dünndarm Dickdarm Urin Fäzes Skelett Gesamtblut* * Die Gesamtmenge Blut wird auf der Grundlage des Rattenkörpergewichts als 6,4% berechnet. Tabelle 8: Urinanalyse in Ratten, die AMFab-(DTSSP)-prnDTPA-¹¹¹In und AMFab- DTPA-¹¹¹In erhielten (3 Stunden nach der Verabreichung Retentionszeit (min)/relatives Verhältnis % (Verhältnis gegenüber der injizierten Dosis (% ID) *) Probe
  • * Berechnete Werte beruhen auf der in Tabelle 5 und 6 dargestellten Urinausscheidung 3 h nach der Injektion, d.h. AMFab- (DTSSP)-prnDTPA-¹¹¹In: 54,04% und AMFab-DTPA-¹¹¹In: 49,75%
    • Beispiel 16: Herstellung von EGS-prnDTPA
  • Eine wäßrige Lösung von prnDTPA-Hydrochlorid (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml) wurde durch Zufügen von 40 ul 5 M NaOH neutralisiert und anschließend lyophilisiert. Der erzeugte weiße Feststoff wurde durch Zusetzen von 2 ml DMF in Lösung gebracht und eine Lösung von EGS in DMF (1 x 10&supmin;&sup4; Mol/ml, 2 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde die Gelsäulenchromatographie mittels TSKG-2000HxL [0,75 cm (Säuleninnendurchmesser) x 30 cm (Länge) + 0,6 cm (Schutzsäuleninnendurchmesser) x 4 cm (Länge), DMF-Elutionsgeschwindigkeit: 0,5 ml/min, Probenbeladungsmenge: jedes Mal 500 ul] zum Fraktionieren von EGS-prnDTPA ausgeführt. Die sich daraus ergebende Fraktion wurde durch Abdestillieren des Lösungsmittels eingeengt und Aceton wurde unter Ergeben einer stark hygroskopischen, weißen Fällung zugesetzt.

Claims (22)

1. Verbindung der Formel I:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist und A eine durch Reagieren von einer der beiden reaktiven Gruppen eines Vernetzungsreagenzes gebildete monovalente Gruppe ist und physiologisch annehmbare Salze derselben.
2. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin n eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist.
3. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin A ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 1000 hat.
4. Verbindung gemäß Anspruch 1, worin A zumindest eine physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aufweist.
5. Verbindung gemäß Anspruch 4, worin die physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aus der Gruppe bestehend aus -O-, -COO-, -S-, -SS-, -SO- und -SO&sub2;- ausgewählt ist.
6. Verbindung gemäß Anspruch 5, worin A ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
7. Verbindung der Formel II:
worin n eine ganze Zahl von 2 bis 10 ist, A' eine durch Reagieren beider reaktiver Gruppen eines Verknüpfungsreagenzes gebildete bivalente Verknüpfungsgruppe ist und B ein Rest einer Polypeptidverbindung ist und physiogisch annehmbare Salze derselben.
8. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin n eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist.
9. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin A' ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 1000 hat.
10. Verbindung geinäß Anspruch 7, worin A' zumindest eine physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aufweist.
11. Verbindung gemäß Anspruch 10, worin die physiologisch spaltbare Verknüpfungsgruppe aus der Gruppe bestehend aus -O-, -COO-, -S-, -SS-, -SO- und -SO&sub2;- ausgewählt ist.
12. Verbindung gemäß Anspruch 11, worin A' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
13. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin B aus der Gruppe bestehend aus Polypeptiden, einfachen Proteinen, Lipoproteinen und Glycoproteinen ausgewählt ist.
14. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin B ein Protein mit biologischer Aktivität ist.
15. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin B aus der Gruppe bestehend aus Serumproteinen, Enzymen, Peptidhormonen, Peptidantibiotika, Antikörpern und Fragmenten derselben ausgewählt ist.
16. Verbindung gemäß Anspruch 15, worin die Serumproteine Immunoglobuline sind.
17. Träger für Radioisotope, umfassend zumindest eine Verbindung gemäß Anspruch 7.
18. Radioaktives diagnostisches Mittel, umfassend die mit einem radioaktiven Metallelement markierte Verbindung gemäß Anspruch 7.
19. Mittel gemäß Anspruch 18, worin das radioaktive Metallelement aus der Gruppe bestehend aus ¹¹¹In, 99mTc, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, &sup6;²Cu und &sup6;²Zn ausgewählt ist.
20. Radioaktives therapeutisches Mittel, umfassend die mit einem radioaktiven Metallelement markierte Verbindung gemäß Anspruch 7.
21. Mittel gemäß Anspruch 20, worin das radioaktive Metallelement aus der Gruppe bestehend aus &sup9;&sup0;Y, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ¹&sup5;³Sm, ²¹²Pb und ²¹¹Bi ausgewählt ist.
22. Verbindung der Formel IIIa:
worin n eine ganze Zahl von 3 bis 10 ist.
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