DE69030186T2

DE69030186T2 - Chelatbildner

Info

Publication number: DE69030186T2
Application number: DE69030186T
Authority: DE
Inventors: Steven C Quay; Scott M Rocklage; Paul F Sieving; Alan D Watson
Original assignee: Nycomed Salutar Inc
Current assignee: Amersham Health Salutar Inc
Priority date: 1989-04-07
Filing date: 1990-04-05
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2010-04-06
Also published as: HUT60277A; ATE139790T1; ES2098299T3; JPH04504436A; WO1990012050A1; JP3145398B2; DE69027603D1; NO178866B; HU903650D0; NO178866C; EP0474642A1; AU656304B2; HK1003578A1; DE69027603T2; HK1003577A1; EP0474642B1; IE901248L; DE69030186D1; NO913920L; IE74852B1

Description

Diese Anmeldung ist eine Teilanmeldung zur Europäischen Patentanmeldung Nr. 90 906 169.9.
Die Erfindung betrifft Chelatbildner, speziell Polychelatbildner, besonders bifunktionelle Polychelatbildner und insbesondere ortsspezifische makromolekulare Konjugate makrocyclischer Chelatbildner und die Chelate und Salze davon und makrocylische Intermediate dafür und deren Anwendungen in der Medizin, einschließlich des Bereichs der diagnostischen Bildgebung. Die Polychelate sind insbesondere zur in vivo Bildverstärkung ausgewählter Säugetierorgane, Gewebe, Zellen und ähnlichem unter Anwendung von Kernspinresonanztomographie, Röntgen, Gammascintigraphie, und Computertomographie, aufgrund ihrer verbesserten Abbildungseigenschaften und Ortsspezifität geeignet. Die Polychelatbildner sind auch gut geeignet für die Metallentgiftung, therapeutische Verabreichung von Radioisotopen und Anwendungen bei der diagnostischen Nuklearmedizin.
Medizinische Bildgebungsverfahren, wie MRI, Röntgen, Garnmascintigraphie und Computertomographie sind extrem wichtige Hilfsmittel bei der Diagnose und Behandlung von Krankheiten geworden. Manche Bildgebung innerer Körperteile beruht auf den inhärenten Attributen dieser Teile, wie den Knochen, die durch eine besondere Art der Bildgebung, wie Röntgen, vom umgebenden Gewebe unterschieden werden. Andere Organe und anatomische Bestandteile sind nur sichtbar, wenn sie durch besondere Bildgebungstechniken spezifisch hervorgehoben werden.
Eine solche Technik mit der Möglichkeit, Bilder einer Vielzahl anatomischer Komponenten zu schaffen, schließt biologisches Targeting bildverstärkender Metalle ein. Solch ein Verfahren bietet die Möglichkeit, Bilder spezifischer Organe und/oder Tumore oder anderer solcher lokalisierter Orte innerhalb des Körpers, zu erzeugen oder zu verstärken, während der Hintergrund und potentielle Überlagerungen, hervorgerufen durch simultane Hervorhebung nicht erwünschter Orte, abgeschwächt werden.
Den Forschern ist seit vielen Jahren bekannt, daß die Chelatisierung verschiedener Metalle die physiologisch tolerierbare Dosis solcher Metalle erhöht und so deren Verwendung in vivo zur Bildverstärkung von Körperteilen erlaubt (siehe z.B. C.D. Russell und A.G. Speiser, J. Nucl. Med., 21, 1086 (1988) und U.S. Patent Nr. 4,647,447 (Gries et al.)). Indessen schaffen solch einfache Metallchelat-Bildverstärker, ohne weitere Modifikation, nicht gemeinhin eine besonders signifikante Ortsspezifität
Die Anlagerung von Metallchelaten an Gewebe- oder Organ- Targeting-Makromoleküle, z.B. Biomoleküle wie Proteine, um ortsspezifische Therapeutika oder Diagnostika zu erzeugen, ist häufig vorgeschlagen worden. So beschreibt z.B. die US-A- 4,678,667 eine bifunktionelle Kupferchelat-Verbindung, die bei Konjugation an ein geeignetes Targeting-Biomolekül verwendet werden kann, Kupfer gezielt an eine Stelle des Körpers zu bringen.
Viele solcher bifunktionellen, chelatbildenden Agenzien, z.B. Agenzien, welche aufgrund der chelatbildenden Komponente befähigt sind, therapeutisch oder diagnostisch nützliche Metallionen stark zu binden, und aufgrund der ortsspezifischen makromolekularen Komponente in der Lage sind, das chelatgebundene Metallion selektiv an die interessierende Körperstelle zu bringen, sind bekannt oder in der Literatur beschrieben. So schlugen z.B. schon recht frühe Veröffentlichungen auf dem Gebiet der MRI-Kontrastmittel, wie GB-A-2169598 (Schering) und EP-A-136812 (Technicare) die Verwendung paramagnetischer Metallionenchelate von bifunktionellen Chelatbildnern als Kontrastmittel vor.
Die Anlagerung chelatbildender Komponenten an ortsspezifische Makromoleküle ist auf verschiedene Weise erreicht worden, z.B. das Verfahren der gemischten Anhydride von Krejcarek et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications 77: 581 (1977)), das Verfahren der cyclischen Anhydride von Hnatowich et al. (siehe Science 220: 613 (1983) und andere), das Grundgerüst-Derivatisierungsverfahren von Meares et al. (siehe Anal. Biochem. 142: 68 (1984) und andere - dies ist eine von Schering in der EP-A-331616 verwendete Technik, um ortsspezifische Polychelate für die Verwendung als MRI- oder Röntgenkontrastmittel zu erzeugen) und das Linker-Molekül-Verfahren, welches z.B. von Amersham (siehe WO-A-85/05554) und Nycomed (siehe EP-A-186947 und anderswo) verwendet wird, um paramagnetische Metallionenchelate von bifunktionellen Chelatbildnern zur Verwendung als MRI-Kontrastmittel zu erzeugen.
So offenbarten Krejcarek et al (s.o.), wie Polyaminopolycarbonsäure-(PAPCA)-Chelatbildner, insbesondere DTPA (Diethylentriaminpentaessigsäure), an ein Protein, wie Humanserumalbumin (HSA), durch Reaktion des Triethylammoniumsalzes des PAPCA mit Isobutylchlorformiat (IBCF) und durch Umsetzung des IBCF-PAPCA-Adduktes mit dem Protein konjugiert werden konnte. Ihr Ziel war es, ein radioaktives Metall pro Molekül Humanserumalbumin anzulagern, um biologische Funktionen zu messen.
Ortsspezifische Anwendungen von verschiedenen Bildgebungstechniken erfordern alle (oder würden verstärkt durch) die Verwendung einer großen Menge des geeigneten Metallions, konjugiert an ein ortsspezifisches Makromolekül. Zum Beispiel wird angenommen, daß eine 50%ige Reduktion der T&sub1;-Relaxationszeit von Wasserprotonen in einem Target-Gewebe die Mindestanforderung an ein effektives MRI-Kontrastmittel ist. Unter Berücksichtigung der Affinität von Antikörpern zu ihren Antigenen und der Konzentration dieser Antigene in den Target-Geweben ist berechnet worden, daß jedes Antikörpermolekül viele paramagnetische Zentren tragen muß, um eine T&sub1;-Reduktion dieser Größenordnung zu verursachen. (siehe Eckelman, et al., NATO ASI Series, Series A, 152: 571 (1988)).
Unger et al. analysierten in Investigative Radiology 20: 693 (1985) die Tumorverstärkung bei der Kernspinresonanztomographie unter Verwendung eines monoklonalen anti-CEA Antikörpers, konjugiert mit Gd-DTPA. Sie fanden keine Tumorverstärkung, wenn 4 Gd-Atome pro Antikörpermolekül gebunden wurden und sagten voraus, daß eine weitaus größere Anzahl bildgebender Metallatome pro Makromolekül erforderlich wäre, um wirksam zu sein.
Ebenso folgerten Schreve und Aisen in Mag. Res. in Medicine 3, 336 (1986), daß die Konzentrationen an paramagnetischem Eisen, welche unter Verwendung der beschriebenen Technik auf einen Tumor übertragen werden könnten, bei Menschen hohe Dosierungen erfordern würden, was diese Bildgebungsmethode in ihrer Verwendung sehr limitiert.
Insofern ist es für die ortsspezifische Bildverstärkung wichtig, daß die Ortsspezifität der Gewebe- oder organ-Targeting-Komponente solcher Chelate bifunktioneller Chelatbildner nicht durch Konjugation mit der chelatbildenden Einheit zerstört werden darf. Wo der bifunktionelle Chelatbildner nur eine chelatbildende Einheit umfaßt, ist dies nicht grundsätzlich ein schwerwiegendes Problem; aber als man Versuche unternommen hatte, bifunktionelle Polychelatbildner durch Konjugation mehrerer chelatbildender Komponenten an ein einzelnes ortsspezifisches Makromolekül herzustellen, hat man nicht nur gefunden, daß das maximal erreichbare Verhältnis Chelatbildner zu ortsspezifischem Makromolekül relativ begrenzt ist, sondern auch, daß in dem Maße, wie das erreichte Verhältnis ansteigt, die Ortsspezifität des resultierenden bifunktionellen Polychelatbildners abnimmt.
Nichtsdestoweniger sind zahlreiche Versuche unternommen worden, bifunktionelle Polychelatbildner mit erhöhter Anzahl chelatbildender Einheiten pro ortsspezifischem Makromolekül herzustellen.
So verwendeten Hnatowich et al. (s.o.) das cyclische Anhydrid des Chelatbildners DTPA für die Anlagerung an ein Protein.
Dies ist eine relativ einfache Einstufen-Synthese, welche daher von vielen anderen Forschern verwendet worden ist. Aber infolge der Präsenz zweier cyclischer Anhydridgruppen im Ausgangsmaterial, kann eine weitreichende Vernetzung der Makromoleküle zur Bildung von Konjugaten führen, die nicht einfach charakterisiert werden können (siehe Hnatowich et al., J. Immunol. Methods 65: 147 (1983)). Zusätzlich weist dieses Verfahren denselben Nachteil auf wie Krejcarek's Methode der gemischten Anhydride, insofern als die Addition von mehr als einigen wenigen chelatbildenden Einheiten die Ortsspezifität der Makromoleküle, an die sie gebunden werden, zerstört. (Siehe auch Paik et al. J. Nucl. Med. 25: 1158 (1983)).
Um die Probleme bei der Anlagerung einer größeren Anzahl chelatbildender Einheiten an ortsspezifische Makromoleküle, ohne Zerstörung ihrer Ortsspezifität, d.h. ohne ihre Bindungsstelle(n) zu stören, zu überwinden, wurden viele Vorschläge zur Verwendung eines Grundgerüstmoleküls geliefert, an das eine Vielzahl chelatbildender Einheiten angelagert werden können, um einen Polychelatbildner herzustellen, wovon einer oder mehrere dann an das ortsspezifische Makromolekül konjugiert werden können, um den bifunktionellen Polychelatbildner herzustellen.
Die bisher übliche Technik zur Konjugation cyclischer Anhydride von Hnatowich et al. (s.o.) ist somit verwendet worden, um bifunktionelle Polychelatbildner herzustellen, bei denen die chelatbildenden Einheiten Reste offenkettiger PAPCAs, wie EDTA und DTPA, sind und in denen das Grundgerüstmolekül ein Polyamin, wie Polylysin oder Polyethylenimin, ist. So beschrieben z.B. Manabe et al. in Biochemica et Biophysica Acta 883: 460- 467 (1986) die Anlagerung von bis zu 105 DTPA-Resten an ein Poly-L-lysin-Grundgerüst unter Verwendung der cyclischen Anhydrid-Methode und auch die Anlagerung von Polylysin-polyDTPA- Polychelatbildnern an monoklonale Antikörper (anti-HLA IgG&sub1;), unter Verwendung eines 2-Pyridyldisulfid-Linkers, wobei eine Substitution von bis zu ungefähr 42,5 Chelatbildnern (DTPA-Reste) pro ortsspezifischem Makromolekül erreicht wird. Torchlin et al. beschrieben in Hybridoma 6: 229-240 (1987) auch die Anlagerung von DTPA und EDTA an Polyethylenimin- und Polylysin- Grundgerüste, welche dann an einen Myosin-spezifischen monoklonalen Antikörper oder sein Fab-Fragment angelagert wurden, um bifunktionelle Polychelatbildner zur Verwendung bei der MRI oder der Scintigraphie herzustellen.
Obwohl Manabe und Torchlin die Herstellung bifunktioneller Polychelatbildner beschrieben haben, führte der von Manabe übernommene cyclische Anhydrid-Weg zur Vernetzung und folglich zu Charakterisierungsproblemen. Torchlin et al bezweifelten in ihrer Schlußfolgerung, daß ihre Technik eine ausreichende Erhöhung der Konzentration des paramagnetischen Metalls ermöglichen würde, um MRI von Tumoren zu erlauben.
So besteht weiterhin ein Bedarf an verbesserten bifunktionellen Polychelatbildnern und die vorliegende Erfindung betrifft die Bereitstellung neuartiger und verbesserter bifunktioneller Polychelatbildner, insbesondere solcher Polychelatbildner, die aus relativ unkomplexen Chelatbildner-Ausgangsmaterialien hergestellt werden können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Bereitstellung bifunktioneller Polychelatbildner und ihrer Chelate, die makrocyclische chelatbildende Einheiten enthalten, d.h. Chelatbildner, welche mindestens ein makrocyclisches Strukturelement enthalten, das wenigstens zum Teil dazu dient, den Sitz für ein chelatisiertes Ion zu definieren. Makrocyclische Chelatbildner (z.B. 1,4,7,10-Tetraazacyclododecantetraessigsäure) sind allgemein als Chelatbildner bekannt, die befähigt sind, sehr stabile Chelatkomplexe zu bilden und insbesondere Komplexe, die anders als solche nicht-makrocyclischer Chelatbildner kinetisch und thermodynamisch besonders stabil sind. Sie können jedoch nicht effektiv an Gerüstmoleküle, wie Polylysin, nach der dem Stand der Technik entsprechenden cyclischen Anhydrid- (Hnatowich) oder der gemischten Anhydrid- (Krejcarek) Methoden, gebunden werden.
Die Erfindung erlaubt erstmalig effizient und erfolgreich bifunktionelle poly(makrocyclische Chelatbildner) (BPMCs), wie auch BPMCs und ihrer Chelate selbst herzustellen. Zahlreiche vorher vorhandene Hindernisse bei der Herstellung eines biologisch-funktionellen bildgebenden Moleküls mit einer Vielzahl chelatbildender Stellen sind überwunden worden. Insbesondere ist die Quervernetzung der Polychelatbildner vermieden worden, was zu einer besseren Löslichkeit und besseren Ortsspezifität infolge der nutzbaren Größe der bifunktionellen Polychelatbild ner führt.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen, die sowohl in der Bildverstärkung als auch der Nuklearmedizin nützlich sind. Ein Typ dieser neuen Verbindungen setzt sich zusammen aus einem Grundgerüstmolekül, an welches eine Vielzahl makrocyclischer chelatbildender Einheiten, ausgewählt aus den Resten von derivatisierten Kronenethern, derivatisierten Hexaazamakrocyclen (HAMs) und derivatisierten Kryptaten, Sepulchraten und Sarkophagenen angelagert werden. Diese polychelatbildenden Verbindungen und die Chelate und Salze davon werden hier Verstärker genannt. Die chelatbildenden Einheiten in den Verstärkern besitzen die Fähigkeit, Metallionen mit einem hohen Maß an Stabilität zu chelatisieren und werden mit dem zur Bildverstärkung und/oder zur Abgabe cytotoxischer Dosen an Radioaktivität geeigneten Metall metalliert.
Diese Verstärker können durch bekannte Methoden an ein ortsspezifisches Makromolekül, z.B. ein Protein, angelagert werden, um BPMCs zu bilden, die bildverstärkend sind und/oder cytotoxische Dosen Radioaktivität an die anvisierten Zellen, Gewebe, Organe und/oder Körpergänge abgeben können.
Im Herstellungsverfahren der Verstärker werden als Intermediat Alkylhaloformiataddukte der makrocyclischen Chelatbildner gebildet und diese stellen einen weiteren Gegenstand der Erfindung dar.
Die Verstärker sind an und für sich nützliche Mittel bei der medizinischen Diagnostik und Therapie, zum Teil infolge ihrer speziellen Lokalisierung im Körper. Die gegenwärtig zur MRI Kontrastverstärkung verwendeten monomeren Chelate (Z.B. Gd(DTPA)²&supmin;, Gd(DOTA)¹&supmin;) finden in vivo-Anwendungen in bezug auf ihre spezifische, rasche biologische Verteilung, die zu einer Lokalisierung dieser Chelate in den extravaskulären/extrazellulären Räumen des Körpers führt. Die Größe des Verstärkers, üblicherweise größer als 10kD verändert die biologische Verteilung der Chelate radikal. Die Verstärker verbleiben primär im intravaskulären System, mit einer diagnostisch sinnvollen Verweilzeit, und ermöglichen eine Reihe von Anwendungen von der Blutpool-Abbildung und Volumenbestimmung bis zur Thrombus-Detektion und Angiographie. Diese Diagnosen sind mit einem Agens, welches sich schnell im extrazellulären/extravaskulären Raum verteilt, nicht leicht zugängig.
Die Anlagerung des Verstärkers an ein ortsspezifisches Makromolekül führt zu einer noch größeren in vivo-Target-Spezifität. Das Makromolekül ist vorzugsweise ein Antikörper, ein anderes Protein oder ein anderes Molekül, welches in vivo an den Ort zur Abgabe der chelatgebundenen Metalle wandert. Erfindungsgemäß wird die Fähigkeit dieses ortsspezifischen Makromoleküls, zu seinem Target zu wandern und/oder an es zu binden, nicht eingeschränkt durch die Addition der chelatgebundenen Metalle. Die Anzahl Chelate pro Molekül ist ausreichend, um das Bild des speziellen Targets zu verstärken. Die BPMCs sind getrennte Einheiten und erwünschterweise weitgehend nicht vernetzt.
In einer konkreten Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Verstärker durch Formel I dargestellt werden,
B(L)n (I)
worin
B der Rest eines Polyamin-Grundgerüstmoleküls, typischerweise ein Molekül, das mindestens 20 Amingruppen enthält, ist, die Reste L unabhängig voneinander jeweils für den Rest eines makrocyclischen Chelatbildners wie oben definiert(oder ein Chelat oder Salz davon) stehen und
n eine ganze Zahl mit einem Wert von mindestes 20, z.B. 20 bis 400, vorzugsweise 60 bis 300, speziell 80 bis 200, insbesondere mindestens 100 ist.
Unter Verwendung dieser Formel für die Verstärker können die zugehörigen erfindungsgemäßen BPMCs durch Formel II dargestellt werden
T (B'(L)n)m (II),
worin
T der Rest eines ortsspezifischen Makromoleküls ist, die Reste B'(L)n unabhängig voneinander jeweils für den Rest eines Verstärkers nach Formel I stehen, der gegebenenfalls einen Rest X' eines Linker-Moleküls, welches dazu dient, den Verstärker an das Makromolekül zu binden, aufnimmt
und m eine positive ganze Zahl, z.B. 1 bis 10, vorzugsweise 1,2,3 oder 4 ist.
Das Grundgerüstmolekül, an welches die makrocyclischen Chelatbildner gebunden sind, trägt eine Vielzahl von Aminen. Dabei kann jedes Grundgerüst mit einer Mehrzahl von Aminen, vorzugsweise primären Aminen, verwendet werden. Dieses Grundgerüst ist vorzugsweise ein Homopolymer, wie Polylysin oder Polyallylamin und besitzt die Fähigkeit, eine große Anzahl primärer Amine bereitzustellen. Eine hohe Konjugationsausbeute folgt aus der Methode der Anlagerung der chelatbildenden Liganden an das Grundgerüst.
Die Bindung zwischen dem Grundgerüst B und der makrocyclischen chelatbildenden Einheit erfolgt vorzugsweise über eine Amidbindung, wobei der Amidstickstoff aus dem Grundgerüstmolekül stammt und die Amidcarbonylgruppe aus einer Carboxyloder Carboxyl-derivatisierten Funktionalität des makrocyclischen Chelatbildners stammt. Der makrocyclische Chelatbildner ist insbesondere bevorzugt ein PAPCA und die Carboxyl- oder Carboxyl-derivatisierte Funktionalität wird besonders bevorzugt an die oder eine Ringstruktur des makrocyclischen Chelatbildners, an einem Donor-Ringheteroatom, insbesondere Stickstoff, angelagert.
Verstärker und BPMCs können in ihrem unmetallierten oder unvollständig metallierten Zustand zur Absorption von verfügbaren Metallionen in vivo, so bei der Metallentgiftung, verwendet werden. Alternativ dazu können Verstärker und BPMCs in ihrer metallierten Form zur Übertragung chelatgebundener Metallionen für diagnostische oder therapeutische Anwendungen verwendet werden.
Metallionen werden aufgrund ihrer Fähigkeit, zur Ausübung ihrer diagnostischen oder therapeutischen Funktion, für die Chelatbildung mit Verstärkern ausgewählt. Diese Funktionen beinhalten die Bildverstärkung bei der MRI, Gammaszintigraphie oder Computertomographie oder beim Röntgen, oder die Übertragung cytotoxischer Mittel, um unerwünschte Zellen, z.B. in Tumoren, abzutöten, ohne darauf beschränkt zu sein.
Für die Verwendung mit Radionukliden, wie z.B. in der Nuklearmedizin, bietet diese Erfindung den Vorteil, daß die Radionuklide durch die makrocyclischen Chelatbildner fest gebunden werden. Dies ermöglicht ein spezifischeres Bild, infolge geringerer Untergrundpegel der Metalle.
Vorzugsweise wird die Metalleinlagerung vor der Anlagerung (des)der Verstärker(s) an ein ortsspezifisches Makromolekül durchgeführt. Das Metall wird ausgehend von substöchiometrischen Mengen bis zur vollen Einlagerung titriert, um so die Notwendigkeit zur Dialyse und extensiven chromatographischen Reinigung zu vermeiden. Auf diese Weise werden signifikante Verluste sowie auch verdünnung vermieden. Nicht-spezifische Bindung der Metallionen an die Makromoleküle wird auch verhindert. Indessen kann die Anwendung der Erfindung bei Radionukliden mit geringen Halbwertszeiten die Metallierung der BPMC als letzten Schritt, gefolgt von einfacher rascher Reinigung (z.B. Gelfiltration), um überschüssiges, ungebundenes Radionuklid zu entfernen, erfordern.
Bei den BPMC werden vorzugsweise ein oder zwei Grundgerüstmoleküle an das ortsspezifische Makromolekül gebunden. Durch Beschränkung der Anzahl von Verstärkern, die an das Makromolekül gebunden sind, würde man vom pharmakologischen Verhalten des BPMC hohe Target-Spezifität und wenig unspezifische Bindungsbildung erwarten.
Die BPMCs können eine große Anzahl makrocyclischer chelatbildender Einheiten enthalten. Dies erlaubt eine Verstärkung der ortsspezifischen Bildgebung über das bisher erreichbare Niveau hinaus.
Diese Verstärker und BPMCs sind nicht nur äußerst nützlich für die Kernspintomographie, sie sind auch nützlich bei anderen Bildgebungsformen, wie auch in der Nuklearmedizin. Die Osmolalität der gegenwärtig verfügbaren bildverstärkenden Mittel trägt zu einigen unerwünschten Nebenwirkungen dieser Mittel, einschließlich Schmerzen für den Patienten, bei. Durch Ermöglichung einer deutlichen größeren Zahl bildverstärkender chelatgebundener Metallzentren pro gelöstem Molekül, gestattet diese Erfindung eine signifikante Abnahme der Osmolalität, während der Grad der Bildverstärkung beibehalten oder erhöht wird.
Wie gezeigt werden konnte, besitzen die bifunktionellen poly(makrocyclischen Chelate) der vorliegenden Erfindung überlegene biologische Verteilungseigenschaften im Vergleich zu konventionellen bifunktionellen Polychelaten, die lineare, chelatbildende Einheiten auf Basis von DTPA enthalten.
Die erfindungsgemäßen Verstärker werden durch Konjugation einer Vielzahl von makrocyclischen Chelatbildnern an ein Grundgerüst-Molekül, im allgemeinen einem wasserlöslichen Polymer mit reaktiven primären Amingruppen, hergestellt. Das Grundgerüstpolymer trägt vorteilhafterweise mindestens 20, vorzugsweise mindestens 60, insbesondere mindestens 100 reaktive Amingruppen. Das Grundgerüstmolekül ist vorteilhafterweise ein verzweigtkettiges oder lineares, vorzugsweise lineares Polymer.
Geeignete Grundgerüstpolymere umfassen Polypeptide, Polyallylamin, Poly[N(2-aminoethyl)}methacrylamid, Starburst-Dendrimere und Polyaminokohlenhydrate. Bevorzugt sind Homopolymere. Am meisten bevorzugt ist Polylysin, insbesondere Poly-L-lysin.
Polyallylamin [-CH&sub2;CH(CH&sub2;NH&sub2; HCl)-]n ist von einer Vielzahl Lieferanten, einschließlich Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI) und Polysciences, Inc. (Warrington, PA) kommerziell erhältlich. (Die Synthese von Poly[N2-aminoethyl)]methacrylamid ist weiter unten in Beispiel 16 genau beschrieben.) Die Starburst-Dendrimere umfassen Polyaminoamidodendrimere (PANAM) und verwandte Starburst-Dendrimere, einschließlich Dendrimeren der sechsten Generation. Die Herstellung von PANAM und verwandten Dendrimeren wird von Tomalia et al in Polymer Journal 17: 117 (1985) und im U.S. Patent Nr. 4,587,329 beschrieben.
Bevorzugte Polyaminokohlenhydrate umfassen Poly(aminodextran) und Chitosan. Das U.S.-Patent 4,699,784 (Shih et al) beschreibt die Herstellung von Polyaminodextran. Chitosan ist kommerziell von Sigma Chemical Co. erhältlich. Die Herstellung von N-Acylderivaten des Chitosans wird von Moore et al. in Int.J.Macromol. 3:292 (1981) beschrieben.
Wenn das Grundgerüstpolymer ein Polypeptid ist, sind vorteilhafterweise mindestens 50 %, bevorzugt mindestens 80 %, insbesondere mindestens 90 % der im Polypeptid vorhandenen Aminosäurereste Aminosäurereste mit primären Amingruppen (wie Reste von Ornithin und Lysin). Irgendwelche zusätzlichen Aminosäurereste werden allgemein nicht die Wasserlöslichkeit des Polypeptids beeinträchtigen. Zusätzliche Aminosäurereste werden vorzugsweise polar sein. Polare Aminosäuren umfassen Arginin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glutamin und Asparagin zusätzlich zu Lysin und Ornithin. Die Polypeptide sind vorzugsweise frei von Bindungen, die eine fixierte Tertiärstruktur schaffen, wie z.B. Disulfidbindungen. Die Homopolypeptide Homopolylysin und Homopolyornithin sind bevorzugt.
Zahlreiche Methoden zur Herstellung von Polypeptiden sind aus dem Stand der Technik bekannt; siehe z.B. Merrifield in J.Amer.Chem.Soc. 85:214-219 (1963). Überdies sind Homopolypeptide von einer Anzahl Hersteller, einschließlich Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) und Aldrich Chemical Company, erhältlich.
Die makrocyclischen chelatbildenden Einheiten in den erfindungsgemäßen Polychelatbildnern leiten sich vorzugsweise von makrocyclischen Chelatbildnern mit einer reaktiven Carboxyloder Aminogruppe ab, welche nicht für die koordinative Metallbindung erforderlich ist. Die reaktive Gruppe kann eine der Gruppen sein, die in dem freien Chelatbildner als eine metallkoordinierende Gruppe fungieren kann, solange die an das Grundgerüst koordinierte chelatbildende Einheit die Fähigkeit beibehält, Metallionen zu komplexieren. Alternativ kann die reaktive Gruppe ein Substituent einer Seitenkette des Chelatbildners sein.
Die Hexaazamakrocyclen umfassen die Serie von makrocyclischen N&sub6;-Chelaten, wie sie von Decola et al. in Inorg. Chem., 25 : 1729 (1986) beschrieben werden. Dieser Artikel beschreibt auch die Herstellung von HAMs, worauf hierin in vollem Umfang Bezug genommen wird.
Kryptate sind polycyclische Liganden, welche Sepulchrate, Sarkophagine und makrocyclische Polyether (Kronenether) und makrobiocyclische Liganden umfassen. Bevorzugte makrocyclische Polyether-Kryptate umfassen Kryptate, die in der Seitenkette mit primärem Amin und Carboxylat derivatisiert sind.
Die Sepulchrate umfassen Derivate des octaazamakrobicyclischen Systems, wie z.B. 1, 3, 6, 8, 10, 13, 16, 19-Octaazabicyclo[6.6.6]eicosan. Primäre Amin- un Carboxylat-Derivate dieser Chelate sind insbesondere bevorzugt. Die Synthese der Chelate, wie der Kobaltkomplexe, wird in J. Am. Chem. Soc. 104: 6016 (1982) beschrieben. Die Sarkophagine umfassen Derivate des hexaazamakrobicyclischen Systems, wie z.B. 3, 6, 10, 13, 16, 19-Hexaazabicyclo [6.6.6] eicosan. Die Synthesen von Sepulchraten und Sarkophaginen werden von Creaser et al. in J. Am Chem. Soc., 104 : 6016 (1982) und entsprechend von Geue et al. in J. Am Chem. Soc., 106 : 5478 (1984) beschrieben. Die Synthese von Kryptaten wird von Izatt und Christensen, Hrsg., in Synthetic Multidentate Compounds, Academic Press (1978) und von Lehn et al. in Acc. Chem. Res., 11 : 49 (1978) beschrieben. Cotton & Wilkinson beschreiben in "Advanced Inorganic Chemistry" ein allgemeines Verfahren zur Kronenether-Template-Synthese zur Herstellung einschlußbildender, stickstoffhaltiger Makrocyclen. Auf diese Quellenangaben wird hiermit in vollem Umfang Bezug genommen.
Die bei der Reaktion von Makrocyclen, die mindestens eine Carboxylatgruppe enthalten, die zur Aktivierung durch Haloformiate geeignet ist, gebildeten Produkte, sind selbst nützliche Intermediate zur Herstellung neuer Verbindungen. Zum Beispiel können dimere Makrocyclen durch Reaktion der Intermediate mit einem zweiten Makrocyclus, der eine primäre Amingruppe enthält, hergestellt werden, woraus ein Dimer resultiert, das über eine Amidfunktion gebunden ist.
Metalle, die durch Chelatbildung eingelagert werden können, umfassen Lanthanide und andere Metallionen, einschließlich deren Isotope und Radioisotope, wie z.B. Mg, Ca, Sc, Ti, B, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Sr, Y, Zr, Tc, Ru, In, Hf, W, Re, Os, Pb und Bi. Von den obengenannten sind insbesonders bevorzugte Radioisotope: ¹&sup5;³Sm, &sup6;&sup4;Cu, &sup6;&sup7;Cu, &sup6;&sup7;Ga, &sup6;&sup8;Ga, &sup8;&sup9;Sr, &sup8;&sup8;Y, &sup9;&sup0;Y, &sup9;&sup9;mTc, &sup9;&sup7;Ru, ¹&sup0;³Ru, ¹¹¹In, ¹&sup8;&sup6;Re, ¹&sup8;&sup8;Re, ²&sup0;³Pb, ²¹¹Bi, ²¹²Bi, ²¹³Bi und ²¹&sup4;Bi. Die Wahl des Metallions zur Chelatbildung mit den erfindungsgemäßen Polychelatbildnern wird von der gewünschten therapeutischen oder diagnostischen Anwendung bestimmt.
Die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendeten ortsspezifischen Makromoleküle können alle Makromoleküle sein, die auf natürliche Weise in einem ausgewählten Target-Organ, -Gewebe, einer Target-Zelle oder -Zellgruppe oder einer anderen Stelle in einem Säugetierkörper, in vivo konzentriert vorliegen. Diese können Proteine, Peptide, Lipoproteine, Glycoproteine und Hormone umfassen. Beispiele für ortsspezifische Proteine umfassen polymerisierte Fibrinfragmente (z.B. E&sub1;), Serumamyloidprecursor (SAP)-Proteine, Precursoren von low-density Lipoproteinen (LDL), Serumalbumin, Oberflächenproteine intakter roter Blutkörperchen, Rezeptor-bindende Moleküle, wie Östrogene, Leber-spezifische Proteine/Polymere, wie Galactosylneoglycoalbumin (NGA) (siehe Vera et al in Radiology 151: 191 (1984)), N-(2-Hydroxypropyl)methacrylamid (HMPA)-Copolymere mit wechselnder Anzahl gebundener Galactosamine (siehe Duncan et al, Biochim. Biophys. Acta, 880:62 (1986)) und Allyl- und 6- Aminohexyl-glycoside (siehe Wong et al, Carbo. Res., 170:27 (1987)) und Fibrinogen.
Das ortsspezifische Protein kann auch ein Antikörper sein. Die Wahl des Antikörpers, insbesondere der Antigenspezifität des Antikörpers, wird von der erwünschten Verwendung des Konjugates abhängen. Monoklonale Antikörper werden polyklonalen Antikörpern bevorzugt.
Humanserumalbumin (HSA) ist ein bevorzugtes Protein zum Studium des vaskulären Systems. HSA ist kommerziell von einer Anzahl Händler, einschließlich Sigma Chemical Co. erhältlich. Die Herstellung von Antikörpern, die mit einem gewünschten Antigen reagieren, ist bekannt. Antikörperpräparate sind kommerziell von einer Vielzahl von Herstellern erhältlich. Das Fibrinfragment E&sub1; kann, wie von Olexa et al. in J.Biol.Chem., 254:4925 (1979) beschrieben, hergestellt werden. Die Herstellung von LDL-Precursoren und SAP-Proteinen wird von Beer et al. in J. Immunol. Methods, 50:17 (1982) beschrieben. Auf die oben erwähnten Artikel wird in ihrer Gesamtheit Bezug genommen.
Allgemein werden Verstärker durch Konjugation der Chelatbildner mit einem Gerüstmolekül vor Konjugation des Grundgerüstmoleküls mit dem ortsspezifischen Makromolekül, um einen bifunktionellen Polychelatbildner zu erzeugen, synthetisiert. In den meisten Fällen würden die zur Verbindung des Chelatbildners mit dem Grundgerüstmolekül verwendeten Reaktionsbedingungen Proteine denaturieren. Um seine Tertiärstruktur und biologische Funktion zu erhalten, wird daher ein Antikörper oder ein anderes ortsspezifisches Protein allgemein nicht an ein Grundgerüstmolekül konjugiert, bevor das Grundgerüstmolekül mit den chelatbildenden Gruppen beladen wurde, es sei denn, dies ist ohne Denaturierung des Proteins möglich. Die Metallionen können vor oder nach Konjugation des Verstärkers mit dem ortsspezifischen Makromolekül zugegeben werden, um den Metallkomplex des Polychelatbildners zu bilden. Vorzugsweise wird das Metall vor Konjugation des Polychelatbildner-Verstärkers mit den meisten Proteinen, insbesondere Antikörpern, zugegeben, insbesondere um zusätzliches Binden des Metalls an das Protein zu vermeiden. Bei einigen Metallionen, wie z.B. Radionukliden mit geringen Halbwertszeiten, wird jedoch die Metallierung vorzugsweise nach der Konjugation, unmittelbar vor Verwendung, durchgeführt.
Während allgemein bekannte Methoden zur Verbindung der makrocyclischen Chelatbildner mit Grundgerüstmolekülen verwendet werden können, ist ein besonders wichtiger Aspekt der vorliegender Erfindung, daß sie einen einfachen und direkten Weg zur Anlagerung makrocyclischer Chelatbildner an Polyamingrundgerüstmoleküle schafft. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß man das gemischte Anhydrid-Verfahren modifizieren kann, indem man einen polycarboxylischen makrocyclischen Chelatbildner in wasserfreiem Medium mit einer Aminbase ausreichender Stärke, um alle Carboxylprotonen zu abstrahieren, umsetzt, wobei man ein Aminsalz erhält, das mit einem Alkylhaloformiat reagieren kann, wobei ein aktiviertes Anhydrid, befähigt zur Konjugation mit dem Polyamingrundgerüst ohne unerwünschte Vernetzung, wie dies bei den bifunktionellen Polychelatbildnern gemäß Stand der Technik der Fall ist, erzeugt wird. Für die meisten makrocyclischen Chelatbildner wird Tetramethylguanidin oder eine Aminbase vergleichbarer Stärke die bevorzugte Base sein.
Komplexere Konjugationstechniken, die z.B. die Verwendung makrocyclischer Chelatbildner, die in einer zu Meares et al. (siehe oben) analogen Weise am Grundgerüst derivatisiert sind, einschließen, können selbstverständlich verwendet werden, aber die erhöhten Kosten und die Komplexität der Gesamtproduktion machen dies zu einem weniger erstrebenswerten Weg. Ähnlich können die Chelatbildner an das Polymergrundgerüst, je nach den zur Verfügung stehenden reaktiven Gruppen am chelatbildenen Agens, durch ein Haloacetylhalogenid-, Phosgen- oder Thiophosgenverfahren angelagert werden.
Bei Makrocyclen mit einem gebundenen Carboxylat kann eines der koordinierenden Carboxylate eine Funktionalität bilden, die mit einer primären Aminogruppe des Polymergrundgerüsts reagieren kann. Methoden zur Bildung einer reaktiven Funktionalität aus einer Carboxylatgruppe umfassen die modifizierte gemischte Anhydrid-Reaktion, z.B. die Verwendung von Isobutylchlorformiat (IBCF) oder die Bildung eines "aktivierten Esters" unter Verwendung eines Carbodiimids (DCC oder EDAC, vgl. Pierce Catalog (1988), S. 252 und 253). Durch beide Reaktionssequenzen wird ein Polymergrundgerüst erhalten, das mehrfach mit den makrocyclischen chelatbildenden Einheiten über stabile Amidbindungen substituiert ist. Insofern ist die modifizierte gemischte Anhydrid-Methode die bevorzugt verwendete Methode bei der Verknüpfung carboxylathaltiger, makrocyclischer Chelatbildner mit dem Polymergrundgerüst.
Die modifizierte gemischte Anhydrid-Reaktion wird in einem wasserfreien Lösungsmittel mit einem Schmelzpunkt vorzugsweise unter 5ºC durchgeführt, welches auf eine Temperatur gekühlt wird, die nicht niedriger als 5ºC ist oder nicht um etwa 55ºC über dessen Gefrierpunkt liegt. Die Solubilisierung des Chelatbildners im geeigneten Lösungsmittel erfolgt vorteilhafterweise durch Herstellung des Aminsalzes des Chelatbildners unter Verwendung der Aminbase in situ.
Die Wahl der Base wird bestimmt durch den pKa der relevanten Carboxylate. Für die meisten Makrocyclen wird insbesondere Tetramethylguanidin (TMG) bevorzugt. Allgemein werden die Basen vorteilhafterweise aus solchen Basen ausgewählt, deren pKa-Wert den höchsten pKa der makrocyclischen Chelatbildner um mindesten 0,5, vorzugsweise 0,8, besonders bevorzugt mindestens 1,0 übersteigt. Aminbasen mit pKa-Werten von mindestens 11, speziell mindestens 11,3, insbesondere mindestens 12, werden insbesondere bevorzugt. Neben TMG sollten Piperidin, Chinuclidin und N-Ethylpiperidin und insbesondere DBU (1,8-Diazabicyclo-[5.4.0)undec-7-en) und DBN (1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en) besonders erwähnt werden. Weitere Basen werden von Martell und Smith in "Critical Stability Constants" Vol 5, erster Ergänzungsband, Plenum Press, NY 1982 aufgezählt.
Eine geeignete Menge von reinem (gekühltem) Alkylhaloformiat wird nun unter Rühren zugegeben und die ursprüngliche Temperatur des Lösungsmittels wird durch Kühlen, z.B. durch Zusatz eines Kühlmittels, falls nötig, gehalten. Isobutylchlorformiat ist insbesondere bevorzugt. Das resultierende aktivierte Anhydrid des makrocyclischen Chelatbildners kann mit Makrocyclen, die eine oder mehrere Amingruppen enthalten, umgesetzt werden, wobei man Dimere, Trimere und/oder Oligomere erhält, oder es kann mit der freien basischen Form eines Amin-haltigen Polymers umgesetzt werden, wobei ein Verstärker-Polychelatbildner gebildet wird. Der Verstärker-Polychelatbildner wird für die meisten Anwendungen an dieser Stelle metalliert und durch Chromatographie oder Kristallisation gereinigt, um überschüssige Metallionen und Metallkomplexe mit geringerem Molekulargewicht zu entfernen. Zur Verwendung als targetspezifische Makromoleküle wird der Verstärker-Polychelatbildner oder dessen mindestens teilweise metallierte Form, die mindestens noch ein freies Amin enthält, an das Makromolekül, z.B. durch Reaktion mit einem der vielen bekannten heterobifunktionellen Kupplungsagenzien, konjugiert, um eine Verbindung mit dem Makromolekül zu erzielen. In Situationen, wo vorherige Metallierung nicht geeignet ist, z.B. bei Radionuklidmetallionen mit kurzen Halbwertszeiten, kann der bifunktionelle Polychelatbildner unter Verwendung eines metallfreien Verstärkers und Kupplung gemäß obiger Beschreibung, gefolgt von Metallierung (siehe unten) und abschließender schneller, einfacher Reinigung durch Chromatographie oder Filtration dargestellt werden.
Die makrocyclischen Chelatbildner können auch an das Polymergrundgerüst über eine nicht-koordinierende primäre Amingruppe gebunden werden. Makrocyclische Chelatbildner mit einer nicht-koordinierenden, primären Amingruppe schließen die mit primären Ammen Seitenkette-derivatisierten Hexaaza- und Octaaza-Makrocyclen und Makrobicyclen (HAMs, Sepulchrate und Sarkophagine), wie auch die große Klasse der derivatisierten Kronenether-Kryptate ein.
Die nicht-koordinierenden primären Aminogruppen an diesen Chelatbildnern können mit Haloacetylhalogeniden unter den bekannten Bedingungen umgesetzt werden, um Haloacetamide zu bilden. Das Haloacetamid kann mit einem primären Amin des Polymergrundgerüsts unter Bildung einer stabilen Amidbindung zwischen Chelatbildner und Polymer reagieren. Die in De Riemer et al, J. Labelled Compd. Radiopharm., 18:1517 (1981) beschriebene Haloacetylhalogenid-Methode kann zur Verknüpfung von Amin-haltigen Chelatbildnern mit dem Polymergrundgerüst verwendet werden.
Amingruppen an einem makrocyclischen Chelatbildner können auch mit Phosgen unter Erzeugung einer reaktiven Isocyanatgruppe oder mit Thiophosgen unter Erzeugung einer reaktiven Isothiocyanatgruppe umgesetzt werden. Diese Gruppen können mit einem primären Amin des Grundgerüstpolymers reagieren, um jeweils eine stabile Harnstoff- oder stabilere Thioharnstoffbindung zwischen dem Liganden und dem Polymergrundgerüst zu bilden. Gansow, Inorg.Chimica Acta, 91:213 (1984) und Moi et al, J.Amer.Chem.Soc., 110:6266 (1988) beschreiben Methoden zur Bindung von Chelatbildnern an Proteine, die eine Aminogruppe haben, durch Bildung der Isocyanat- oder Isothiocyanat-Einheiten unter jeweiliger Verwendung der Phosgen- oder Thiophosgen-Methoden. Siehe auch Desreux, Inorg.Chem., 19:1319 (1980); Bryden et al, Anal.Chem., 53:1418 (1981); Delgardo et al, Talanta, 29:815 (1982); Cacheris et al, Inorg. Chem., 26:958 (1987); Moi et al, Inorg.Chem., 26:3458 (1987) und Meares et al, Acc.Chem.Res., 26:3458 (1987).
Wie bereits erwähnt, beruht die Wahl der Metallionen zur Chelatisierung durch die erfindungsgemäßen Polychelatbildner auf der diagnostischen oder therapeutischen Technik, für die das resultierende Polychelat verwendet wird. Für MRI sollten die Metallionen paramagnetisch und vorzugsweise nicht-radioaktiv sein. Für Röntgen- und Ultraschallbildgebung sollten vorzugsweise Schwermetallionen, z.B. mit Ordnungszahlen von mindestens 37, vorzugsweise mindestens 50, verwendet werden, wieder bevorzugt nicht-radioaktive Spezies. Für die Szintigraphie oder Radiotherapie sollen die Metallionen natürlich Ionen von radioaktiven Isotopen sein.
Methoden zur Komplexierung von Metallionen mit Chelatbildnern und Polychelatbildnern gehören zum Stand der Technik. Jedes der verwendeten Metalle kann auf eine der drei allgemeinen Methoden in eine makrocyclische chelatbildende Einheit eingelagert werden: direkte Einlagerung, Templatsynthese und/oder Transmetallierung. Die direkte Einlagerung ist bevorzugt.
Die Metallionen Fe(III), Cr(III), Mn(II), Hg(II), Pb(II), Bi(III) und die Lanthanide können direkt in Polyaminopolycarboxylate durch folgende allgemeine Vorgehensweise eingelagert werden. Eine wasserlösliche Form des Metalls, im allgemeinen ein anorganisches Salz, wird in einem geeigneten Volumen destillierten, deionisierten Wassers gelöst. Der pH der Lösung soll niedriger als 7 sein. Eine wässrige Lösung, die eine äquimolare Menge des Polychelatbildners enthält, wird bei Raumtemperatur unter Rühren zu der Metallösung gegeben. Der pH der Mischung wird langsam durch Zugabe von Base, typischerweise 0,1 M NaOH, erhöht, bis die Donorgruppen des Polychelatbildners deprotoniert sind. Dies ist allgemein im pH-Bereich von 7 bis 9, abhängig von den chelatbildenden Einheiten der Fall. Besondere Vorsicht muß bei den Lanthanidionen angewendet werden, um den pH unter 8 zu halten, um eine Ausfällung des Metallhydroxids zu vermeiden. Die Metalleinlagerung in von DOTA abgeleiteten und damit verwandten makrocyclischen, chelatbildenden Einheiten, ist üblicherweise ein langsamer Prozeß, wie in den unten zitierten Quellenangaben beschrieben. Spezifische Beispiele zur Vorgehensweise sind in den Beispielen hierzu und in den folgenden Quellenangaben enthalten.
Choppin et al, J. Inorg. Nucl. Chem., 33:127 (1971), Margerum, Rec. Chem. Prog., 24:237 (1973) und D'Olieslager et al, J. Inorg. Nucl. Chem., 35:4255 (1973) beschreiben die direkte Einlagerung von Lanthaniden in Polyaminopolycarboxylate. Margerstadt, Mag. Res. Med., 3:808 (1986) und WO-A-87/06229 beschreiben die Einlagerung von Gd(III) in DOTA. Eine Methode zur Herstellung von Bi- und Pb-Komplexen von DOTA wird von Kumar et al, J. Chem. Soc. Chem. Commun., 3:145 (1989) beschrieben. Auf die obigen Quellenangaben wird hiermit in ihrer Gesamtheit Bezug genommen.
Die direkte Einlagerung von Hf, Zr, W, Hg und Ta kann nach bekannten Methoden durchgeführt werden. Siehe z.B. U.S. - Patent 4,176,173 (Winchell).
Transmetallierung ist nützlich, wenn das Metallion auf eine geeignetere Oxidationsstufe reduziert werden muß&sub1; um die Donoratome der chelatbildenen Einheit zu binden. Um z.B. &sup9;&sup9;mTc oder 186/188Re einzulagern, muß das Metallion zu Tc(V) oder Re(V) unter Verwendung von Reduktionsmitteln, wie SnCl&sub2; oder Cystein, auf bekannte Weise reduziert werden. Diese Methode erfordert die Bildung eines Intermediatkomplexes. Ein typisches Beispiel ist die Reduktion von 99mTc mit Sn in Anwesenheit eines schwachkoordinierenden Liganden, wie Glucoheptonat, vor Komplexierung mit Chelatbildnern, wie DOTA. Diese Methoden sind Stand der Technik in der Radiopharmazie. Bei &sup6;&sup7;Cu nutzt man Tetraaminchelate, wie tet A oder tet B (siehe Bhardaredj et al, JACs, 108:1351 (1986)), um Cu(II) für die Reaktion mit stärker-bindenden Chelatbildnern zu stabilisieren.
Die Template-Synthese kann nach der von Smith et al in Inorg. Chem., 24:3469 (1985) und 27:4154 (1988) beschriebenen Methode durchgeführt werden. Im Fall der HAM-Systeme wird das Metallion in den makrocyclischen Chelatbildner eingelagert, indem der Chelatbildner um das Metallion via Template-Synthese aufgebaut wird. Allgemein bekannte Template-Syntheseverfahren werden von Smith et al. (supra) für Lanthanid-Template- Synthesen beschrieben. Die makrocyclischen Sepulchrat- und Sarkophagin-Chelatbildner können gleichermaßen durch Template-Synthese um Co hergestellt werden. Das Co wird durch Reduktion zu Co(II) und Extraktion mit 15M HBr entfernt. Der metallfreie Chelatbildner kann dann durch Reaktion mit einem einfachen Metallsalz am Rückfluß in Methanol oder durch Transmetallierung aus einem Donorkomplex, wie Glucoheptonat-, Ascorbat-, Acetat- oder Citratsalzen, metalliert werden. Die Verwendung von Triflat- und/oder Perchlorat-Salzen ist bevorzugt.
Die große Klasse der Kronenether und Kryptate, insbesondere solcher, die N, O oder S enthalten, kann in gleicher Weise unter Verwendung einer oder mehrerer der zuvor beschriebenen Verfahren metalliert werden.
Methoden zur Anlagerung von Polymergrundgerüsten an Antikörper und andere Proteine gehören zum Stand der Technik. Solche Methoden werden in Pierce 1989 Handbook and General Catalog und den darin zitierten Quellenangaben, Blatter et al, Biochem., 24:1517 (1985) und Jue et al, Biochem., 17:5399 (1978), beschrieben. Auf die oben zitierten Quellenangaben wird hiermit in ihrer Gesamtheit Bezug genommen.
Die erfindungsgemäßen Metallchelate der Polychelatbildner, speziell der bifunktionellen Polychelatbildner, aber gegebenenfalls auch der Verstärker-Polychelatbildner, können an Patienten zur Bildgebung in geeigneten Mengen verabreicht werden, um den mit dem jeweiligen Bildgebungsverfahren erwünschten Kontrast zu erzielen. Allgemein sind Dosen von 0,001 bis 5,0 mmol an chelatisiertem bildgebenden Metallion pro Kilogramm Körpergewicht des Patienten wirksam, um eine adäquate Kontrastverstärkung zu erzielen. Für die meisten MRI-Anwendungen werden bevorzugte Dosen an bildgebenden Metallionen in einem Bereich von 0,02 bis 1,2 mmol/kg Körpergewicht liegen, während für
Röntgenanwendungen Dosen von 0,5 bis 1,5 mmol/kg allgemein wirksam sind, um Röntgenstrahlabschwächung zu erzielen. Bevorzugte Dosen für die meisten Röntgenanwendungen liegen bei 0,8 bis 1,2 mmol des Lanthanids oder Schwermetalls/kg Körperge wicht.
Um bei Röntgenanwendungen den Energiebereich der Photonen zu erweitern, über den die erfindungsgemäßen Polychelate optimal wirksam sind, können die verwendeten Polychelate zwei oder mehr verschiedene Metalle enthalten, entweder als Mischung von Homopolychelaten oder als Heteropolychelate.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können mit konventionellen pharmazeutischen oder tiermedizinischen Hilfsstoffen formuliert werden, wie z.B. Stabilisatoren, Antioxidantien, die Osmolalität einstellende Agenzien, Puffer, den pH einstellende Agenzien, usw., und können in einer für parenterale oder enterale Verabreichung, z.B. Injektion oder Infusion oder Verabreichung direkt in eine Körperhöhle mit einem nach außen führenden Gang, z.B. den Gastrointestinaltrakt, die Blase oder den Uterus, geeigneten Form vorliegen. So können die erfindungsgemäßen Verbindungen in konventionellen pharmazeutischen Darreichungsformen, wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Lösungen, Suspensionen, Dispersionen, Sirupen, Suppositorien, usw., vorliegen; Lösungen, Suspensionen und Dispersionen in physiologisch verträglichen Trägermaterialien, wie z.B. Wasser zur Injektion, sind jedoch im allgemeinen bevorzugt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können daher zur Darreichung, unter Verwendung physiologisch akzeptabler Träger oder Exzipienten, in einer dem Stand der Technik entsprechenden Weise formuliert werden. Zum Beispiel können die Verbindungen, gegebenenfalls unter Zusatz eines pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten, in wäßrigem Medium suspendiert oder gelöst werden, wobei die resultierende Lösung oder Suspension dann sterilisiert wird. Geeignete Additive umfassen z.B. physiologisch biokompatible Puffer (wie z.B. Tromethaminhydrochlorid), Zusätze (z.B. 0,01 bis 10 Mol-%) an Chelatbildnern (wie z.B. DTPA, DTPA-Bisamid oder nicht-komplexierte Verstärker-Polychelatbildner) oder Calciumchelatkomplexe (wie z.B. Calcium-DTPA, CaNaDT- PA-Bisamid, Calcium-Verstärker-Polychelatbildner oder CaNa-Salze von Verstärker-Polychelatbildnern) oder, gegebenenfalls, Zusätze (z.B. 1 bis 50 Mol-%) von Calcium- oder Natriumsalzen (z.B. Calciumchlorid, Calciumascorbat, Calciumgluconat oder Calciumlactat, kombiniert mit Metallchelatkomplexen von Verstärkerliganden und ähnliches).
Wenn die Verbindungen in Suspensionsform, z.B. in Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung zur oralen Verabreichung, formuliert werden sollen, kann ein kleiner Anteil an löslichem Chelat mit einem oder mehreren inaktiven Ingredienzien, die üblich für orale Lösungen sind, und/oder oberflächenaktiven Mitteln und/oder Aromastoffen zur Geschmackgebung, gemischt werden.
Für MRI und zur Röntgenbildgebung einiger Körperteile ist die am meisten bevorzugte Art zur Verabreichung der Metallchelate als Kontrastmittel die parenterale, z.B. intravenöse, Verabreichung. Parenteral zu verabreichende Formen, z.B. intravenöse Lösungen, sollten steril und frei von physiologisch nicht akzeptablen Substanzen sein und sollten eine geringe Osmolalität besitzen, um Reizungen und andere nachteilige Effekte nach Verabreichung zu verringern. Deshalb sollte das Kontrastmittel vorzugsweise isoton oder leicht hyperton sein. Geeignete Vehikel schließen wäßrige Vehikel ein, wie sie gewöhnlich für die Darreichung parenteraler Lösungen verwendet werden, wie Natriumchloridinjektion, Ringer-Injektion, Dextroseinjektion, Dextrose- und Natriumchloridinjektion, lactierte Ringer-Injektion und andere Lösungen, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. Aufl., Easton: Mack Publishing Co., S. 1405-1412 und 1461-1487 (1975) und The National Formulary XIV, 14. Aufl. Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben werden. Die Lösungen können Konservierungsstoffe, antimikrobielle Mittel, Puffer und Antioxidantien, wie sie gewöhnlich für parenterale Lösungen verwendet werden, Exzipienten und andere Additive, welche mit den Chelaten kompatibel sind und welche nicht die Herstellung, die Lagerung oder den Gebrauch des Produktes beeinträchtigen, enthalten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine bildverstärkende oder therapeutische Zusammensetzung, die ein Metallchelat eines erfindungsgemäßen Polychelatbildners oder ein Salz davon, zusammen mit mindestens einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten, enthält.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Polychelatbildners oder eines Chelates oder Salzes davon zur Herstellung eines bildverstärkenden Kontrastmittels oder einer therapeutischen Zusammensetzung.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Methode zur Erzeugung eines Bildes eines menschlichen oder nichtmenschlichen, tierischen Körpers, insbesondere eines Säugetiers&sub1; wobei die Methode die Verabreichung einer bildverstärkenden Menge eines erfindungsgemäßen Polychelates oder eines Salzes davon und danach die Erzeugung eines Bildes, wie z.B. eines MR-, Röntgen-, Ultraschall- oder Szintigraphiebildes, von mindestens einem Teil des Körpers umfaßt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Methode zur Radiotherapie des menschlichen oder tierischen Körpers, wobei die Methode die Verabreichung einer therapeutisch effektiven Menge eines radioaktiven Metallchelates eines erfindungsgemäßen Polychelatbildners, an den Körper umfaßt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Methode zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Polychelatbildners, oder eines Chelates davon, wobei die Methode die Konjugation einer Vielzahl makrocyclischer Chelatbildner an ein Polyamingrundgerüst, gegebenenfalls die Konjugation des resultierenden Polychelatbildners an ein ortsspezifisches Makromolekül, und gegebenenfalls die Metallierung des Polychelatbildners vor oder nach der Konjugation an das Makromolekül umfaßt.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Entgiftungsmittel, das einen erfindungsgemäßen Polychelatbildner oder einen schwachen Chelatkomplex oder Salz davon, mit physiologisch tolerierbaren Gegenionen, gemeinsam mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten, umfaßt.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Methode zur Metallentgiftung, die die Verabreichung einer entgiftenden Menge eines erfindungsgemäßen Polychelatbildners oder eines schwachen Chelatkomplexes oder Salzes davon, mit physiologisch tolerierbaren Gegenionen, an einen menschlichen oder nicht-menschlichen, tierischen Körper, umfaßt.
Die Erfindung wird nun durch die folgenden spezifischen, aber nicht einschränkenden Beispiele, weiter erläutert. Obwohl die in diesen Beispielen beschriebenen Chelatbildner keine Ausführungsformen der Erfindung darstellen, sind die darin beschriebenen Verfahren auf die erfindungsgemäßen Chelatbildner anwendbar. Falls nicht anders angegeben, sind Temperaturen in Grad Celsius und Konzentrationen als Gewichtsprozente angegeben.

Beispiel 1

Herstellung von DOTA-Carboxykohlensäureanhydrid

DOTA (0,808 g, 2,0 mmol) wurde in 5,0 ml wasserfreiem Acetonitril suspendiert. Tetramethylguanidin (1,0 ml, 8,0 mmol) wurde zugegeben und die Mischung unter Stickstoffatmosphäre 5 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, bis das DOTA gelöst war. Die resultierende Lösung wurde unter Stickstoffatmosphäre auf -25ºC gekühlt und gerührt, während 0,260 ml (2,0 mmol) Isobutylchloroformiat (IBCF) langsam über 5 Minuten zugegeben wurden. Der resultierende Niederschlag wurde 1 Stunde bei -25ºC gerührt.

Bespiel 2

Herstellung von DOTA-N (2-aminoethyl) amid

Zu der kalten Aufschlämmung aus Beispiel 1 wurde eine Lösung von Mono-BOC-ethylendiamin (0,320 g, 2 mmol) in 2 ml Acetonitril gegeben und die Mischung 6 bis 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wurde mit H&sub2;0 auf 20 ml aufgefüllt, mit 6 ml konzentrierter HCl versetzt und dann über Nacht gerührt, um die Entfernung der Schutzgruppe zu erzielen. Die Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Ionenaustauscherchromatograhie an einem DOWEX AGI-X8-Harz gereinigt. Eindampfen der geeigneten Fraktionen ergab 0,35 g eines semikristallinen Glases. Das ¹H-NMR zeigte das erwartete Produkt, wie auch etwas restliches Acetat (aus der Chromatographie).

Beispiel 3

Herstellung von DOTA-N (4-aminophenethyl) amid

Zu der kalten Aufschlämmung aus Beispiel 1 wurde eine Lösung von 4-Nitrophenylethylamin (0,332 g, 2 mmol) in 4,0 ml Acetonitril gegeben. Die Mischung wurde 6 bis 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Eindampfen zur Trockne wurde der Rückstand erneut in Wasser gelöst und der pH mit NaOH auf 10,5 eingestellt, um eine Mischung zu bilden, die mit Ethylacetat extrahiert wurde, um nicht abreagiertes Amin zu entfernen. Das Produkt, DOTA-N-(4'-nitrophenylethyl) amid wurde durch Ionenaustauscherchromatographie an einem DOWEX AGI-X8-Harz isoliert. Nach Eindampfen der geeigneten Fraktionen wurde der Rückstand in Wasser in einem Parr-Reaktor gelöst und mit 0,1 g 5%iges Palladium auf Aktivkohle versetzt, um ein Reaktionsgemisch zu bilden. Das Reaktionsgemisch wurde bei 30 bis 40 psi hydriert, bis der Druck nicht mehr abfiel. Das Produkt wurde durch Abfiltern des Katalysators und Eindampfen des Filtrats zur Trockne isoliert.

Beispiel 4

Aktivierung der Aminogruppe des DOTA-N(2-aminoethyl)amids mit Thiophosgen - Überführung in Isothiocyanatgruppen

Eine wäßrige Lösung des in Beispiel 2 hergestellten Produktes wurde zu einem gleichen Volumen Chloroform, das Thiophosgen und Natriumhydrogencarbonat enthält, jedes in einem vierfachen molaren Überschuß bezogen auf die Target-Aminogruppe, gegeben. Die Lösung wurde 1 bis 2 Stunden kräftig gerührt und dann wurden die Phasen getrennt. Die wäßrige Phase wurde mit Chloroform gewaschen und dann zur Trockne eingedampft. Das resultierende feste Produkt wurde mit Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Das Verfahren wurde unter Ersatz des Produkts aus Beispiel 2 durch das Produkt aus Beispiel 3 wiederholt.

Beispiel 5

Aktivierung von Aminoaruppen von DOTA-N(2-aminoethyl)amid mit Bromacetylchlorid - Überführung in Bromacetamidgruppen

Eine wäßrige Lösung des in Beispiel 2 hergestellten Produkts (20 mg/ml), welche auch Triethylamin (20 mg/ml) enthielt, wurde mit dem gleichen Volumen einer Chloroformlösung von Bromacetylchlorid (30 mg/ml) versetzt und die zweiphasige Mischung wurde 1 bis 2 Stunden kräftig gerührt. Wasser wurde zugesetzt, um das Volumen der wäßrigen Phase zu verdoppeln und die Mischung wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die wäßrige Phase wurde zur Trockne eingedampft und der Rückstand mit Aceton verrieben und im Vakuum getrocknet.
Das Verfahren wurde unter Ersatz des Produktes aus Beispiel 2 durch das Produkt aus Beispiel 3 wiederholt.

Beispiel 6

Kopplung von DOTA-Isothiocyanatderivaten an Poly-L-lysin (Polymerisationsarad ungefähr = 100)

Eine Lösung von Poly-L-lysin (20 mg/ml) in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 9,5, wurde mit einem vierfachen molaren Überschuß, bezogen auf &epsi;-Aminogruppen, des in Beispiel 4 hergestellten aktivierten Chelatbildners, versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde von überschüssigem Liganden durch Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-25 befreit und durch Gefriertrocknung der geeigneten Fraktionen isoliert.

Beispiel 7

Kopplung von DOTA-Bromacetamidderivaten an Poly-L-lysin (Polymerisationsarad = 100)

Eine Lösung von Poly-L-lysin (20 mg/ml) in 0,1 M Natriumhydrogencarbonat, pH 9,5, wurde mit einem vierfachen molaren Überschuß, bezogen auf &epsi;-Aminogruppen, des in Beispiel 5 hergestellten aktivierten Chelatbildners, versetzt. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Produkt wurde von überschüssigem Chelatbildner durch Größenausschlußchromatographie an Sephadex G-25 befreit und durch Gefriertrocknung der geeigneten Fraktionen isoliert.

Beispiel 8

Herstellung der Gadolinium-Komplexe von Thioharnstoff- und Glycinamid-gebundenen Polychelaten

Eine Probe von einem der in den Beispielen 6 oder 7 hergestellten Polychelatbildner wurde in einem Aliquot von 50,1 mM GdCl&sub3; in 0,1 N HCl gelöst, welches 5% weniger als die stöchiometrische Menge an Gadolinium enthielt. Der pH wurde auf 7 eingestellt und die Abwesenheit von freiem Gadolinium durch Testen mit Arsenazo (III) verifiziert. Während der pH der Lösung durch Zugabe von 5 N NaOH zwischen 6 und 7 gehalten wurde, wurden Aliquots von 50,1 mM GdCl&sub3;, welche 0,5 bis 1,0% der stöchiometrischen Menge an Gadolinium enthielten, in einstündigen Intervallen zugegeben, bis der Test auf freies Gadolinium in der Lösung positiv war. Aliquots von 0,1 bis 0,5% der ursprün glichen Menge des Polychelates wurden zugegeben, wenn zum Zeitpunkt des ersten positiven Tests ein großer Überschuß an freiem Gadolinium vorhanden war. Die Lösung wurde über Nacht gerührt. Das Gadolinium-Polychelat wurde von ungebundenem Gadolinium und anderen Salzen durch Gelfiltration (Sephadex G-25) befreit und durch Gefriertrocknung der geeigneten Fraktionen isoliert.

Beispiel 9

Aktivierung von Humanserumalbumin (HSA)

HSA enthält eine native Thiolatgruppe. Diese Gruppe wurde wie im folgenden beschrieben durch Alkylierung blockiert. 50 ml 0,05 M Tris-HCl, pH 7,3 wurde unter Verwendung 1,0 M Tris-Base auf pH 8,0 eingestellt. HSA (1 g, 15 µmol) wurde zur Lösung gegeben. Nach Rühren bis zur Homogenität wurde der die Lösung enthaltende Kolben mit Stickstoff gespült, mit einem Septum verschlossen und zum Lichtausschluß in eine Aluminiumfolie gehüllt.
Eine Lösung von Iodacetamid (15 mg, 80 µmol) in 4,0 ml einer 1 N NaOH wurde tropfenweise unter Verwendung einer durch das Septum eingesetzten spritze zugegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden lang gegen 3,5 Liter 0,05 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,0, dialysiert, mit einem Pufferwechsel nach 6 Stunden. Das Dialysat wurde gefriergetrocknet und bildete eine weiße faserartige Masse.
Die Abwesenheit freier Thiole in dem Präparat wurde nach der Methode von Ellman (siehe Arch. Biochem. Biophys. 74: 443 (1958)) nachgewiesen. Die Reinheit des Präparates wurde durch Messung der spezifischen Absorption einer Lösung (1 mg/ml) des Produktes bei 280 nm (1 cm Dicke) bestimmt. Die Analyse zeigte, daß eine Reinheit von 99% bei einer Ausbeute von 0,903 g erhalten wurde.
100 mg des obigen thiolblockierten HSA wurde in 50 ml 60 mM Triethanolamin, 7 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, gelöst. Die Lösung wurde durch 10 minütiges Rühren unter Vakuum entgast und dann in einem Septumverschlossenen Kolben unter Argonatmosphäre gesetzt. Nach Kühlen des Kolbens in einem Eisbad wurde eine Lösung aus 2-Iminothiolan (8,5 mg) in 100 µl 1 M Triethanolamin, pH 8,0, durch eine Spritze zugegeben. Die Mischung wurde etwa 90 Minuten bei 0 bis 4ºC gerührt. Nach Dialyse gegen 3,5 Liter 0,08 M Kaliumphosphat, 0,5 mg/ml EDTA, pH 8,0 über Nacht mit häufigen Pufferwechseln, zeigte die spektrophotometrische Analyse nach der Methode von Ellman die Anwesenheit von 2,7 Thiolen pro Mol HSA.

Beispiel 10

Aktivierung von Gadoliniumpolychelaten zur Kopplung an HSA

Eine 200 mg-Probe von einem der in Beispiel 8 hergestellten Polychelate wurde in 20 ml 0,008 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8, gelöst. Eine Lösung von 16 mg Succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (SMCC) in 3 ml DMSO wurde tropfenweise zugegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, um eine Lösung zu bilden. Die resultierende Lösung wurde 12 Stunden gegen 4 l H&sub2;O dialysiert, mit einmaligem Wechsel nach 6 Stunden, um überschüssiges SMCC zu entfernen.

Beispiel 11

Kopplung von Gadolinium-Polvchelaten an HSA

Die in den Beispielen 9 und 10 hergestellten Lösungen wurden vereint und 4 Stunden gerührt um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde gefriergetrocknet. Der resultierende Feststoff wurde in 10 ml H&sub2;O gelöst und 6 Stunden gegen H&sub2;O dialysiert. Das Dialysat wurde an Sephacryl S-300 chromatographiert. Die Fraktionen mit signifikanter Absorption bei 280 nm wurden zusammengegeben und gefriergetrocknet. Eine Probe dieses Feststoffs wurde in Wasser (1 mg/ml) gelöst und auf HSA (unter Verwendung eines Spektrophotometers und Messung Absorption bei 280 nm) und Gd (unter Verwendung direkt gekoppelter Plasmaatomabsorption (DCP-AA)) untersucht, um die Anzahl gebundener Metallionen pro Mol HSA zu bestimmen.

Beispiel 12

Herstellung von Polylysin-polyDOTA

Eine Lösung von 100 mg Poly-L-lysin (Polymerisationsgrad = 103) in 6,0 ml 0, 1 N Natriumhydrogencarbonat, pH 9,0 wurde in einem Eis-/Wasserbad auf 0ºC gekühlt und gerührt, während die kalte Aufschlämmung aus Beispiel 1 langsam über 5 Minuten zugegeben wurde. Die resultierende Lösung wurde 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Acetonitril wurde durch 30 Minuten Rotationsverdampfung bei 60ºC weitgehend entfernt. Die resultierende wäßrige Lösung wurde in einem Dialysesack mit einer Ausschließgrenze von nur 12,500 6 Stunden bei Raumtemperatur gegen 3,5 Liter 0,02 M Oxalsäure, pH 2,0, dialysiert. Die Dialyselösung wurde gegen 0,05 M Natriumhydrogencarbonat, pH 8,0 ausgetauscht und über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde entfernt, gefriergetrocknet und ergab 183 mg eines weißen Pulvers. ¹H-NMR-Analyse zeigte 0,68 DOTA-Gruppen pro Lysinrest, anzeigend daß 68% der &epsi;-Amine des Lysins acyliert wurden.

Beispiel 13

Herstellung von Gd (Polylysin-polyDOTA)

Ein 5,0 ml Aliquot von 50,1 mM GdCl&sub3; in 0,1 N HCl wurde zu 300 mg Polylysin-polydota, hergestellt wie in Beispiel 12 beschrieben, gegeben, um eine Mischung zu bilden. Die Mischung wurde gerührt bis sie homogen war und der pH auf 7 eingestellt, um eine Lösung zu bilden, deren Test auf freies Gadolinium negativ war. Während der pH der Lösung durch Zugabe 5 N NaOH auf 6 bis 7 gehalten wurde, wurden zusätzliche 0,5 ml Aliquots 50,1 mM GdCl&sub3; in 1-Stunden-Intervallen zugegeben, bis der Test auffreies Gadolinium in der Lösung positiv war. Aliquots von Polylysin-polyDOTA wurden zugegeben, wenn ein großer Überschuß an freiem Gd vorlag. Die Lösung wurde über Nacht gerührt, gefolgt von Reinigung durch Gelfiltration an Sephadex G-25, um ungebundenes Gadolinium und andere Salze zu entfernen. Gefriertrocknung ergab 360 mg eines reinweißen amorphen Pulvers.

Beispiel 14

Aktivierung von Gd(Polylysinpoly-DOTA zur Kopplung an Antikörper L6

Eine 22 mg Probe des in Beispiel 13 hergestellten Polychelates wurde in 2 ml 0,008 M Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8 gelöst. Eine Lösung von 1,1 mg SMCC in 0,2 ml DMSO wurde dann tropfenweise zugegeben. Die Mischung wurde 30 Minuten unter Lichtausschluß gerührt. Überschüssiges SMCC und Puffersalze wurden dann durch Ultrafiltration, unter Verwendung eines Amicon Centricon 30 Microkonzentrators (zentrifugiert bei 5000 Upm 45 min, dann zweimal unter Zusatz von 2 ml H&sub2;O zu dem konzentrierten Polychelat wiederholt), entfernt. Das Polychelat wurde dann mit deionisiertem H&sub2;O auf 2 ml verdünnt. Die Reaktion eines Aliquots dieses Polychelats mit einer bekannten Menge 2- Mercaptoethanol und Messung der restlichen Sulfhydryle nach der Methode von Ellman ergab etwa 0,5 Maleimidreste pro Molekül Polychelat.

Beispiel 15

Aktivierung des Antikörpers L6

Antikörper L6 (5 mg, 33 nmol) in 2,5 ml 60 mM Triethanola min, 7 mM Kaliumdihydrogenphosphat, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8 wurde durch 10 minütiges Rühren unter Vakuum entgast und dann unter eine N&sub2;-Atmosphäre gebracht. Nach 30 min. Kühlen in einem Eisbad wurden 70 µl 2-Iminothiolan.HCl (2 µmol) im selben Triethanolaminpuffer zugesetzt. Die Mischung wurde 90 min. bei bis 4ºC gerührt. Die resultierende Mischung wurde dann in 150 mM NaCl, 80 mM Natriumphosphat, 0,5 mg/ml EDTA, pH 8 transferiert und durch Ultrafiltration konzentriert. Der konzentrierte Antikörper wurde mit dem gleichen Puffer auf 2,5 ml verdünnt. Spektrophotometrische Analyse nach der Methode von Ellman zeigte die Anwesenheit von 2,2 Thiolen pro Antikörpermolekül.

Beispiel 16

Kopplung von Gd(Polylysin-polyDOTA) an Antikörper L6

Die in den Beispielen 14 und 15 hergestellten Lösungen wurden vereinigt und über Nacht gerührt. Die Mischung wurde durch Ultrafiltration konzentriert und dann an Sephacryl S-300 chromatographiert. Die bei 280 nm signifikant absorbierenden Fraktionen wurden zusammengegeben und auf ein bekanntes Volumen konzentriert. Spektrophotometrische Analyse (A²&sup8;&sup0;) ergab etwa 75% Ausbeute.

Claims

1. Polychelatbildner, umfassend eine Rückgrateinheit in Form eines Restes eines Amingruppen-enthaltenden Moleküls, an dem über Amidgruppen eine Vielzahl makrocyclischer chelatbildender Einheiten, welche zur Komplexierung von Metallionen befähigt sind, gebunden ist, und Metallchelate und Salze davon, wobei die

makrocyclischen chelatbildenden Einheiten ausgewählt sind unter Resten von derivatisierten Kronenethern, derivatisierten Hexaazamakrocyclen (HAMs) und derivatisierten Kryptaten, Sepulchraten und Sarkophaginen.

2. Verbindung nach Anspruch 1 der Formel I B(L)n (1)

worin B die Rückgrateinheit ist, n für eine ganze Zahl mit einem Wert von wenigstens 20 steht und die Reste L unabhängig voneinander für den Rest eines makrocyclischen Chelatbildners stehen, oder ein Chelat oder Salz davon.

3. Verbindung nach Anspruch 2 mit einer im wesentlichen nicht-vernetzten Struktur.

4. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 und 2, worin n wenigstens 60 ist.

5. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die makrocyclischen chelatbildenden Einheiten mit der Rückgrateinheit über gegebenenfalls substituierte Alkylengruppen verbunden sind, welche an die Carbonylgruppen der Amidgruppe und an Donor-Heteroatome des makrocyclischen Skeletts der chelatbildenden Einheiten gebunden sind.

6. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin wenigstens einige der chelatbildenden Gruppen nicht-metalliert sind.

7. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin wenigstens einige der chelatbildenden Einheiten mit Metallionen metalliert sind, die ausgewählt sind unter paramagnetischen Ionen von Fe, Mn, Co, den Ionen von Bi, Hg, Os, Rh, Zr und Lanthaniden und den radioaktiven Ionen von In, Tc, Y, Re, Pb, Cu, Ga, Bi und Sm.

8. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Rückgrateinheit der Rest eines Rückgratpolymers ist, das eine Vielzahl primärer Amingruppen aufweist.

9. Verbindung nach Anspruch 8, worin die Rückgrateinheit der Rest eines Polymers, ausgewählt unter Polypeptiden, Polyallylammen, Polymethacrylamiden, Starburst-Dendrimeren und Polyaminocarbohydraten, ist.

10. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend wenigstens eine makrocyclische Chelatbildner-tragende Rückgrateinheit, konjugiert mit einem Makromolekül, oder ein Chelat oder Salz davon.

11. Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, umfassend ein orts-spezifisches Makromolekül, das dazu befähigt ist, zu Target-Zellen, Geweben, Organen oder anderen Orten im Körper eines Säugers zu wandern oder daran spezifisch zu binden, die, daran konjugiert, 1,2,3 oder 4 makrocyclische Chelatbildnereinheiten-tragende Rückgrateinheiten aufweist, oder ein Chelat oder Salz davon.

12. Verbindung nach einem der Ansprüche 10 und 11, worin das Makromolekül ausgewählt ist unter Antikörpern mit Spezifität für ein gewünschtes Antigen, polymerisierten Fibrinfragmenten, Serumamyloid-Präkursorproteinen, Low Densitiy Lipoprotein-Präkursoren, Serumalbumin, Oberflächenproteinen von intakten roten Blutzellen, Hormonen, Leber-spezifischen Makromolekülen, Rezeptorbindungsproteinen und Fibrinogen.

13. Verbindung nach Anspruch 12, worin das Makromolekül ein monoklonaler Antikörper mit Spezifität für ein gewünschtes Antigen ist.

14. Verbindung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, worin das Makromolekül an die Rückgrat-Einheiten über heterobifunktionelle Verknüpfungsagenzien, verbunden über reaktive Linkergruppen&sub1; ausgewählt unter Amid-, Maleamid-, Disulfid-, Thioharnstoff-, Isothiocyanat- und Estergruppen, gebunden ist.

15. Verfahren zur Herstellung eines Adduktes eines makrocyclischen Chelatbildners, ausgewählt unter Resten von derivatisierten Kronenethern, derivatisierten Hexaazamakrocyclen (HAMs) und derivatisierten Kryptaten, Sepulchraten und Sarkophaginen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Dispergieren eines carboxylischen, makrocyclischen Chelatbildners in einem polaren, wasserfreien Lösungsmittel;

(b) Zugabe einer Base mit einem pka-Wert, der ausreicht, um sämtliche Carboxyl-Protonen zu entfernen, um ein Aminsalz des Chelatbildners zu bilden, das in dem Lösungsmittel löslich ist;

(c) Kühlen des Reaktionsgemisches auf eine Temperatur im Bereich von etwa 5ºC bis 55ºC über dem Gefrierpunkt des Lösungsmittels; und

(d) Zugabe einer im wesentlichen äquimolaren Menge von gekühltem Alkylhaloformiat unter wasserfreien Bedingungen und gleichzeitiger annähernder Beibehaltung der Temperatur von Schritt (c) über einen Zeitraum, der ausreicht, um die Reaktion zur Bildung einer Aufschlämmung zu beenden, welche das gemisch te Carboxycarboanhydrid des Chelatbildners enthält.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin ein aprotisches Lösungsmittel als Lösungsmittel für Schritt (a) verwendet wird.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin trockenes Acetonitril, Dimethylacetamid oder Dimethylformamid als Lösungsmittel für Schritt (a) verwendet wird.

18. Verfahren anch einem der Ansprüche 15 bis 17, worin Tetramethylguanidin, 1,5-Diazabicyclo[4.3.0]non-5-en, oder 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-en als Base in Schritt (b) verwendet wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 18, worin Isobutylchlorformiat als Alkylhaloformiat in Schritt (d) verwendet wird.

20. Addukt eines makrocyclischen Polychelatbildners, hergestellt über ein Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 19.

21. Verfahren zur Herstellung eines Polychelatbildners oder eines Chelates davon, wobei man

(e) eine Aufschlämmung, enthaltend das gemischte Carboxycarboanhydrid eines carboxylischen, makrocyclischen Chelatbildners, hergestellt gemäß den Schritten (a) bis (d) nach einem der Ansprüche 15 bis 19, zu einer Lösung der freien basischen Form eines Polymers gibt&sub1; das eine Vielzahl freier Amine trägt,

(f) gewünschtenfalls den resultierenden Polychelatbildner metalliert;

(g) gewünschtenfalls den resultierenden Polychelatbildner oder das Chelat davon mit einer heterobifunktionellen Linker- Gruppe umsetzt;

(h) gewünschtenfalls die resultierende Verbindung mit einem ortsspezifischen Makromolekül umsetzt; und

(i) gewünschtenfalls den resultierenden bifunktionalen Polychelatbildner oder das resultierende bifunktionale Polychelat metalliert oder transmetalliert.

22. Alkylhaloformiat-Addukt des Aminsalzes eines makrocyclischen Liganden, hergestellt gemäß Schritt (b) eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 15 bis 19.

23. Isobutylchlorformiataddukt nach Anspruch 22.

24. Polychelatbildner oder Chelat oder Salz davon, hergestellt über ein Verfahren nach Anspruch 21.

25. Bildverstärkende oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend ein Metallchelat eines Polychelatbildners nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Salz davon zusammen mit wenigstens einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.

26. Verwendung eines Polychelatbildners nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder eines Chelates oder Salzes davon zur Herstellung eines bildverstärkenden Kontrastmediums oder einer therapeutischen Zusammensetzung.

27. Verfahren zur Erzeugung einer Abbildung eines menschlichen oder nicht-menschlichen, tierischen Körpers, wobei man dem Körper ein Polychelat nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder ein Salz davon verabreicht und anschließend von wenigstens einem Teil des Körpers eine Abbildung erzeugt.

28. Entgiftungs-Zusammensetzung, umfassend einen Polychelatbildner nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder einen schwachen Chelatkomplex oder ein Salz davon mit physiologisch verträglichen Gegenionen, zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten.