ES2316961T3

ES2316961T3 - Conjugados para la formacion de imagenes medicas que comprenden portador, resto orientador y un agente de contraste.

Info

Publication number: ES2316961T3
Application number: ES04711636T
Authority: ES
Inventors: John Rodney Woodrow
Original assignee: Upperton Ltd; Novozymes Biopharma UK Ltd
Current assignee: Upperton Ltd; Albumedix Ltd
Priority date: 2003-02-17
Filing date: 2004-02-17
Publication date: 2009-04-16
Anticipated expiration: 2024-02-17
Also published as: US20110142762A1; KR20050121673A; EP1605979B1; WO2004071536A1; DE602004017290D1; AU2004212263B2; ATE411819T1; AU2004212263A2; CA2516409A1; US20060171892A1; EP1605979A1; JP2006518727A; AU2004212263A1

Abstract

Un conjugado para uso en la formación de imágenes médicas, comprendiendo dicho conjugado un portador en forma de una molécula proteica o una partícula formada a partir de moléculas proteicas, estando unido el portador a un agente de contraste, o un precursor del mismo, y a un resto orientador que tiene afinidad por una localización específica en el cuerpo, en el que la molécula portadora se acopla con el resto orientador mediante un agente reticulante heterobifuncional que tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes del portador.

Description

Conjugados para la formación de imágenes médicas que comprenden portador, resto orientador y un agente de contraste.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la administración de agentes al cuerpo. Son una clase particular de dichos agentes los agentes de contraste útiles en técnicas de formación de imágenes médicas. Los agentes pueden ser metales útiles como agentes de contraste en la formación de imágenes por resonancia magnética (IRM) o en la formación de imágenes de tipo nuclear, incluyendo tomografía de emisión de positrones (PET), o como agentes terapéuticos en radioterapia. Los agentes pueden ser como alternativa agentes de contraste útiles en la formación de imágenes por rayos X. La invención se refiere también a procedimientos mediante los que los agentes para administración al cuerpo pueden acoplarse con portadores y restos orientadores eficaces para dirigir al agente a una localización específica en el
cuerpo.

Antecedentes de la invención

Es conocido potenciar el contraste de imágenes obtenidas mediante técnicas tales como IRM o formación de imágenes por rayos X mediante la administración previa de agentes de contraste adecuados. En el caso de formación de imágenes por rayos X, dichos agentes son típicamente materiales altamente radioopacos, mientras que para IRM son típicamente especies paramagnéticas que afectan a los tiempos de relajación del medio en el que se introducen. En la formación de imágenes de tipo nuclear, se usan especies radiactivas para generar una señal que se usa para visualizar la localización en el cuerpo en la que se localizan las especies radiactivas.

Se han hecho muchos intentos de desarrollar nuevas formulaciones que contengan agentes de contraste que exhiban un rendimiento mejorado. Dichas mejoras pueden implicar aumentos en el tiempo de residencia del agente de contraste en el cuerpo y mejoras en la especificidad con la que se suministra el agente, concretamente, la concentración del agente en una localización particular en el cuerpo.

En la formación de imágenes de tipo nuclear, se han unido directamente iones metálicos radiactivos a un anticuerpo monoclonal (mAb) usando un resto quelante tal como ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA). Sin embargo, se ha encontrado que esta química no es específica y conduce generalmente a una reducción de la actividad de unión a anticuerpo, aumentando la reducción al aumentar las cantidades de agente acoplado con el mAb.

Por ejemplo, se ha marcado un anticuerpo monoclonal con anhídrido de DTPA (DTPAa) y se ha usado el complejo para quelar cloruro de [^{153}Sm] (Boniface y col., 1989, J. Nuc. Med. 30: 683-691). Cuando se cargaba con 20 iones metálicos, el complejo retenía una actividad de unión a anticuerpo de más de un 90%. Sin embargo, cuando el número de iones metálicos aumentaba a 50, la inmunoreactividad caía a menos de un 50%. Claramente, el marcaje de anticuerpos con un metal está limitado en términos de la relación molar que puede unirse antes de afectar adversamente a la actividad de unión a anticuerpo.

Otros investigadores han mostrado que una relación de DTPA:mAb del orden de 2:1 conduce a una clara pérdida de actividad de unión a anticuerpo (Paik y col. 1987, J. Nucl. Med. 24: 1158-1163).

Se ha usado el marcaje directo de anticuerpos para producir una serie de productos comerciales basados en anticuerpos. Por ejemplo, CEA-scan^{TM} y Onco-scint^{TM} son agentes comercialmente disponibles que pueden usarse para la formación de imágenes de cáncer. Estos agentes consisten en anticuerpos marcados directamente con ^{99m}Tc, y tras administración intravenosa se unen a células cancerosas.

Se ha tomado un enfoque similar en el campo de la IRM, en el que estudios anteriores examinaron el marcaje de anticuerpos monoclonales con DTPA-Gd usando DTPAa (Unger y col. 1985, Investigative Radiol. 20(7): 693-700). Sin embargo, los niveles de carga de Gd eran muy bajos (1,5 iones Gd^{3+} por molécula de anticuerpo) y no pudo observarse potenciación por anticuerpo-DTPA-Gd de las imágenes en un modelo in vivo. Se postuló que sería necesario unir al menos 100 átomos de Gd a cada molécula de anticuerpo para producir una señal suficientemente alta para detectar por IRM.

Se han reseñado otros enfoques a lo largo de líneas similares en la bibliografía (por ejemplo: Shahbazi-Gahrouei y col. 2002, Aust. Phys. and Eng. Sci. in Med. 25(1): 31-38, Matsumura y col. (1994), Acta Neurochirurgica 60: 356-358, Curtet y col. (1988), Intl. J. Cancer 2: 126-132).

Un problema común con todos los enfoques que implican la conjugación directa de un agente de contraste con un resto orientador tal como un anticuerpo es que la carga del agente de contraste debe mantenerse a un nivel bajo, puesto que de otro modo se afecta adversamente a la inmunorreactividad del anticuerpo. La carga del agente de contraste puede ser en consecuencia menor de lo que sería deseable de otro modo, conduciendo a un efecto de contraste menor que el deseado. De forma similar, cuando se conjuga un agente terapéutico con un resto orientador, la eficacia de ese agente puede comprometerse por la necesidad de mantener una carga relativamente baja del agente.

Para aumentar el tiempo de residencia del agente de contraste en el conjunto de sangres, se han usado moléculas poliméricas como portadoras para el agente de contraste. En experimentos anteriores, se marcaron portadores tales como albúmina humana y polilisina con DTPA y se usaron para portar metales de contraste de IRM (por ejemplo, DTPA-Gd unido a polilisina, véase Gerhard y col. (1994), MRM 32: 622-628). En otros estudios, se marcaron seroalbúmina bovina e inmunoglobulina bovina con DTPA y Gd (Lauffer y col. (1985), Magnetic Resonance Imaging 3(1): 11-16), y se hizo reaccionar un polipéptido basado en el esqueleto de poli-L-lisina con DTPAa y se usó para quelar ^{111}In con fines de formación de imágenes (Pimm y col. (1992), Eur. J. Nucl. Med. 19: 449-452). En estos estudios, se encontró que el agente de contraste unido a portador tenía un tiempo de residencia aumentado en el conjunto de
sangres.

Se han hecho intentos por combinar los dos enfoques generales expuestos anteriormente, concretamente, utilizar una molécula portadora para aumentar la carga del agente de contraste y usar un resto orientado para mejorar la especificidad.

En un estudio (Gohr-Rosenthal y col. (1993), Invest. Radiol. 28: 789-795), se usó polilisina marcada con DTPA-Gd como agente de contraste de IRM. De media, se consiguió una carga de 65 iones Gd por polímero. Se acopló ésta con un anticuerpo monoclonal y se usó para evaluar tumores humanos en ratones desnudos. Se ligó un mAb a la polilisina-DTPA, después de la activación del anticuerpo con peryodato, mediante amidación reductiva y usando un exceso molar de 200 veces del polímero. Se añadió entonces Gd^{3+} a un exceso molar de 10 veces. Los estudios de unión a anticuerpo mostraron que la actividad de unión a anticuerpo se reducía un 60-70% en comparación con el anticuerpo libre. Se observó también que el conjugado de polilisina-anticuerpo era inmunogénico y se incorporaba a órganos importantes tales como hígado y riñón.

Se ha descrito otro ejemplo de conjugación de una cadena de poli(L-lisina) cargada con DTPA-Gd con un mAb por Manabe y col. (1986), Biochemica et Biophysica Acta 883(3): 460-467.

Se han tomado enfoques similares en relación con la administración de medicamentos al cuerpo. Por ejemplo, se ha ligado el agente anticanceroso metotrexato (MTX) con seroalbúmina humana (Pimm y col. 1988, en "Human tumour xenografts in anticancer drug development", pág. 95-98, publ. Springer Verlag). Se ligaron hasta 30 moléculas de MTX a la albúmina, y se ligó químicamente el conjugado resultante con un anticuerpo. Sin embargo, el conjugado anticuerpo-albúmina-MTX tenía una semivida en el conjunto de sangres muy reducida en comparación con el anticuerpo libre.

Se ha realizado un trabajo similar con MTX por Hartung y col. (1999), Clin. Cancer Res. 5(4): 753-759, en el que se cargaron niveles mucho más bajos de MTX en la molécula de HSA. Con esta carga de medicamento reducida, se estimó que la semivida del medicamento era de hasta 3 semanas.

Los documentos WO 94/12218 y US4794170 describen el uso de albúmina humana lactosaminada para orientar conjugados nucleosídicos antivíricos al hígado para el tratamiento de hepatitis B crónica. El documento WO 90/01900 describe un sistema portador para la administración orientado de agentes de contraste de IRM a tipos celulares específicos. Esto comprende un ligando específico de receptor para el tipo celular unido químicamente al agente complejante para un material paramagnético. Se acopla poli(L-lisina) con un agente orientador de asialoglucoproteína para aumentar el número de grupos quelantes por grupo orientador. Sin embargo, el acoplamiento con poli(L-lisina) se efectúa antes de la unión de los grupos quelantes, y por lo tanto ocurrirá necesariamente la modificación del portador de poli(L-lisina) y el agente orientador de asialoglucoproteína, con un efecto potencialmente nocivo sobre la actividad de unión del complejo.

Enfoques adicionales a la administración orientada de agentes al cuerpo han implicado el uso de agregados moleculares (por ejemplo, liposomas) y partículas, típicamente de dimensiones menores de 10 \mum.

Los ejemplos de trabajos realizados con liposomas incluyen:

El documento US 5929044 describe la administración de un compuesto bioactivo a una célula usando un agente orientador. El agente bioactivo se porta en un liposoma o un virus.

Se describen un gran número de publicaciones sobre el uso de liposomas como portadores/portadores orientados de agentes de formación de imágenes por Caride (1985) "Critical reviews in therapeutic drug carrier systems" 1(2), 121-153 y Tilcock (1999) Adv. Drug Deliv. Reviews 37: 33-51.

Se ha ligado químicamente DTPA-Gd con estearilamina e incorporado a la superficie de membranas liposómicas. Estas partículas tenían una capacidad de relajación aumentada en comparación con DTPA-Gd solo (Kunimasa y col. (1992) Chem. and Pharm. Bulletin (Japan) 40(9): 2565-2567).

Otra área en la que se ha realizado mucho trabajo es el uso de nanopartículas para suministrar agentes de contraste, y la orientación de estas nanopartículas para suministrar agentes al foco patológico.

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Los ejemplos de trabajos realizados con nanopartículas incluyen:

Se describen la formación de imágenes de trombos usando nanopartículas de Gd-DTPA-bisoleato orientadas a fibrina y orientaciones similares con nanopartículas de Gd-DTPA-fosfatidiletanolamina (PE) usando fibrina por Winter y col. (2003) Magnetic Resonance in Medicine 50(2): 411-416.

Varios grupos han descrito el uso de nanopartículas de óxido de hierro orientadas. Por ejemplo, Suwa y col. (1998) Intl. J. Cancer 75 (4): 626-634 describieron nanopartículas de superparamagnetita (agente de contraste T2) recubiertas con mAb dirigido contra factor de crecimiento epidérmico. Se ha realizado un trabajo similar por Suzuki y col. (1996) Brain Tumour Pathology 13 (2): 127-132, usando nanopartículas de hierro recubiertas con polietilenglicol marcadas con mAb.

En otro enfoque, Artemov y col. (2003) Magnetic Resonance in Medicine 49(3): 403-408 describieron en primer lugar la orientación del receptor Her-2/neu de tirosina cinasa con un mAb que se había biotinilado. Se usaron entonces nanopartículas de superparamagnetita marcadas con estreptavidina para orientar a las células cancerosas biotiniladas. Las nanopartículas generaron un fuerte contraste de IRM T2.

Se ha descrito un agente de contraste T1 por Yu y col. (2000) Magnetic Resonance in Medicine 44(6): 867-872, que consiste en una nanopartícula de perfluorocarbono encapsulada en lípido orientada a fibrina con numerosos complejos de Gd-DTPA incorporados sobre la superficie exterior. Se mostró que ésta se unía fuertemente a coágulos.

Se ha descrito otra nanopartícula basada en perfluorocarbono por Anderson y col. (2000) Magnetic Resonance in Medicine 44(3): 433-439, en la que se orientaron nanopartículas de Gd-perfluorocarbono a integrina \alphav\beta3 presente en endotelio angiogénico (usando un mAb específico).

Se ha ligado un mAb contra cáncer de vejiga humano con nanoesferas de albúmina humana cargadas con adriamicina por Samten (1996) Chinese J. Microbiol. and Immunol. 16: 54-57.

Se ha descrito el uso de microesferas como portador/portador orientado en una serie de artículos. Por ejemplo, Klibanov (1999) Adv. Drug Deliv. Reviews 37: 139-157 describió microburbujas llenas de gas que pueden marcarse y usarse como agente de contraste orientado. El documento WO 03/015756 describe un procedimiento para la preparación de microesferas de material proteico y la incorporación a estas microesferas de agentes terapéuticos y agentes de contraste.

Existen muchas publicaciones que describen la administración de medicamentos ligados a micropartículas de albúmina. Por ejemplo, se han cargado medicamentos citotóxicos (doxorubicina y mitomicina c) sobre microesferas de albúmina humana de 40 \mum y administrado a los hígados de pacientes con metástasis hepáticas colorrectales (Kerr y col. (1992) EXS (Switzerland) 61, 339-345).

A pesar del volumen de trabajo que se ha llevado a cabo, sigue existiendo la necesidad de conjugados orientados de agentes para suministro al cuerpo que satisfagan los conflictivos requisitos de suficiente carga del conjugado con el agente referido y retención de la actividad de unión del resto orientador, para una orientación eficaz.

Es por lo tanto un objeto de la invención proporcionar medios para la administración orientada al cuerpo de un agente, en particular un agente de contraste, mediante la conjugación de un portador con el agente y con un resto orientador que dirige al conjugado al sitio de acción pretendido, siendo capaz dicho conjugado de acomodar una alta carga del agente, manteniendo una actividad de unión suficientemente alta del resto orientador.

Es otro objeto de la invención potenciar la asociación de grandes cantidades de agentes de contraste con uno o más restos orientadores sin destruir la actividad de unión de los restos orientadores, como podría causarse por la formación de grandes cantidades de enlaces covalentes con los restos orientadores.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar medios para la administración orientado al cuerpo de iones metálicos en grandes cantidades, manteniendo un alto grado de especificidad en la localización de esos iones metálicos en el cuerpo.

Es un objeto adicional de la invención proporcionar procedimientos para el ensamblaje de conjugados orientados para la administración de agentes al cuerpo, posibilitando dichos procedimientos que los conjugados porten altas cargas de los agentes referidos, manteniendo un alto grado de especificidad en la orientación de los conjuga-
dos.

Resumen de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona un conjugado para uso en la formación de imágenes médicas, comprendiendo dicho conjugado un portador en forma de una molécula proteica o una partícula formada a partir de moléculas proteicas, estando unido el portador a un agente de contraste, o un precursor del mismo, y a un resto orientador que tiene una afinidad por una localización específica en el cuerpo, en el que la molécula portadora se acopla con el resto orientador mediante un agente reticulante heterobifuncional que tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes en el portador.

Por "precursor" de un agente de contraste, se entiende un resto que no es eficaz por sí mismo como agente de contraste, pero que puede volverse eficaz mediante la reacción o mezclado con alguna otra especie antes del uso. Es un ejemplo de dicho precursor un resto quelante de metal, capaz de formar enlaces con iones metálicos para formar un quelato metálico que funciona como agente de contraste.

Por "formación de imágenes médicas", se entiende cualquier técnica usada para visualizar una región interna del cuerpo humano o animal, con fines de diagnóstico, investigación o tratamiento terapéutico. Dichas técnicas incluyen principalmente la formación de imágenes por rayos X, IRM y la formación de imágenes de tipo nuclear, incluyendo PET. Los agentes útiles en la potenciación de dichas técnicas son aquellos materiales que posibilitan la visualización de una localización particular, órgano o foco patológico en el cuerpo y/o que conducen a cierta mejora de la calidad de las imágenes generadas por las técnicas de formación de imágenes, proporcionando una interpretación mejorada o más sencilla de esas imágenes. Dichos agentes se designan en la presente memoria como agentes de contraste, cuyo uso facilita la diferenciación de diferentes partes de la imagen al aumentar el "contraste" entre aquellas regiones diferentes de la imagen. El término "agentes de contraste" comprende por tanto agentes que se usan para potenciar la calidad de una imagen, que puede generarse no obstante en ausencia de dicho agente (como es el caso, por ejemplo, en IMR), así como agentes que son prerrequisitos para la generación de una imagen (como es el caso, por ejemplo, de la formación de imágenes de tipo nuclear).

Se apreciará que, aunque el conjugado comprende "un agente de contraste" y "un resto orientador", en la práctica, estará unido un número sustancial de agentes de contraste (o precursores de los mismos) a cada portador, y pueden estar unidos más de un resto orientador al portador. En general, cuando el portador tiene la forma de una molécula proteica, el número de agentes de contraste unidos a cada portador puede ser de varias decenas, por ejemplo, 10 a 100, más preferiblemente 20 a 60, por ejemplo, de 20 a 50. Puede unirse un número similar de agentes de contraste a cada molécula proteica que constituye un portador en forma de partícula. Sin embargo, puesto que una partícula se formará generalmente a partir de un número muy grande de moléculas de proteína individuales (quizás 10^{3} a 10^{11} moléculas), el número global de agentes de contraste asociados a cada partícula será correspondientemente alto. Cuando el portador tiene la forma de una molécula proteica, el número de restos orientadores por portador será generalmente menor de 5, y puede ser sólo de 1. En el caso de un portador en partícula, el número de restos orientadores puede ser, y generalmente será, considerablemente mayor. Cuando el portador está en forma de una molécula proteica, es también posible que se acople más de un portador con un solo resto orientador, aunque el número de portadores por resto orientador será generalmente menor de 10, y es habitualmente 1, 2 ó 3. En general, se prefiere que sólo estén unidos al resto orientador un pequeño número de portadores, ya que cantidades excesivas de enlaces entre el resto orientador y los portadores pueden tener un efecto adverso sobre la actividad de unión del resto orientador.

El conjugado según la invención se administrará generalmente al cuerpo en forma de una formulación que comprende un medio líquido farmacéuticamente aceptable. Ese medio será generalmente un medio acuoso, lo más habitualmente una disolución acuosa que contiene excipientes apropiados. Dichos excipientes pueden incluir uno o más agentes ajustadores de la tonicidad, conservantes, tensioactivos y otros excipientes farmacéuticos convencionales.

El conjugado según la invención puede ser soluble en medio líquido, en cuyo caso la formulación será generalmente una disolución del conjugado. Como alternativa, cuando el portador es una partícula, la partícula y por tanto el conjugado será generalmente insoluble, y la formulación será una suspensión o dispersión del conjugado en el medio líquido.

Por tanto, según un segundo aspecto de la invención, se proporciona una formulación que comprende un conjugado según un primer aspecto de la invención mezclado con un medio líquido farmacéuticamente aceptable.

El conjugado y la formulación según la presente invención son ventajosos en una serie de aspectos. En primer lugar, pueden prolongar el tiempo de residencia en la corriente sanguínea del agente de contraste, Además, la presencia del resto orientador, que tiene afinidad por un órgano o foco patológico particular, potencia la administración del agente de contraste a esa localización, y puede alterar la biodistribución de esos agentes, por ejemplo, causando que el agente de contraste se acumule en un órgano o foco patológico particular, por ejemplo, el hígado o un tumor, permitiendo así que se oriente al órgano o foco patológico y se visualice. El uso de un "portador" para el agente de contraste puede aumentar la cantidad de agente de contraste suministrada al sitio deseado en del cuerpo. Esto puede potenciar la detección, debido a un aumento de la relación de señal/ruido frente al tejido de fondo (no enfermo). El uso del resto orientador evita la administración de agente a tejido normal/sano. Además, como se explica a continuación, pueden conjugarse grandes cantidades de agente de contraste con el portador sin dañar la capacidad de unión del resto orientador.

Los agentes de contraste de IRM que pueden emplearse en la invención incluyen iones metálicos, especialmente gadolinio. Dichos iones pueden acoplarse con el material portador mediante un resto quelante que está unido covalentemente al material portador.

De forma similar, pueden acoplarse también metales útiles en la formación de imágenes de tipo nuclear, por ejemplo ^{99m}Tc, ^{201}Tl y ^{111}In, con el material portador, directa o indirectamente, por ejemplo mediante un resto quelante.

De manera similar al modo en que los metales eficaces como agentes de contraste pueden suministrarse al cuerpo en forma de un conjugado según el primer aspecto de la invención, pueden suministrarse también otros metales al cuerpo con otros fines. Algunos metales, por ejemplo, pueden tener un efecto terapéutico directo, por ejemplo, metales radiactivos útiles en radioterapia. Es uno de dichos metales radiactivos el ^{67}Cu, que puede unirse al portador de manera análoga a los metales usados en técnicas de formación de imágenes. El conjugado resultante puede usarse para radioterapia orientada.

Por tanto, en otro aspecto de la invención, se proporciona un conjugado para la administración de un metal al cuerpo, comprendiendo dicho conjugado un portador en forma de una molécula proteica o una partícula formada por moléculas proteicas, estando acoplado con dicho metal el portador mediante un agente quelante y conjugado con un resto orientador que tiene afinidad por una localización específica en el cuerpo, en el que la molécula portadora se acopla con el resto orientador mediante un agente reticulante heterobifuncional que tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes en el portador.

Como se describe anteriormente, el metal puede ser un metal que es útil como agente de contraste, por ejemplo, en IRM o formación de imágenes de tipo nuclear, o puede ser un metal útil en terapia, por ejemplo un metal radiactivo útil en radioterapia. También es posible preparar conjugados que contienen más de un tipo de metal, por ejemplo, una mezcla de un agente de contraste (por ejemplo, gadolinio) y un agente radioterapéutico (por ejemplo, ^{67}Cu). Es también posible preparar formulaciones que comprenden más de un conjugado, por ejemplo, un primer conjugado que comprende un agente de contraste y un segundo conjugado que comprende un agente radioterapéutico. Mediante dichos medios, es posible determinar la administración y localización precisas del agente en el cuerpo usando técnicas de formación de imágenes convencionales y, haciendo esto, confirmar la administración exitosa del radioisótopo.

También puede ser posible preparar partículas de mayor tamaño (por ejemplo, más de 10 \mum) que pueden portar radioisótopos y/o agentes de formación de imágenes. Estos pueden suministrarse (por ejemplo, por catéter) a la microcirculación de un tumor y así reducir la administración sanguínea por bloqueo capilar. Además, cuando está presente un radioisótopo en la partícula, se suministrará al tumor (dando como resultado la muerte celular), y la presencia de un agente de contraste, por ejemplo gadolinio, posibilitará que se forme una imagen del tumor durante un periodo de tiempo usando tecnología de formación de imágenes convencional (por ejemplo IRM).

El conjugado según el primer aspecto de la invención puede prepararse haciendo reaccionar el portador con el agente de contraste, o con un precursor del mismo, en ausencia del resto orientador, y acoplando posteriormente el portador con el resto orientador usando un agente de reticulación heterobifuncional. Este enfoque es más generalmente aplicable, siendo útil en la preparación de conjugados orientados de una variedad de portadores con agentes para administración al cuerpo. Por tanto, según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un procedimiento para la preparación de un conjugado orientado de un agente para administración al cuerpo con un portador, comprendiendo dicho procedimiento

(a) hacer reaccionar el agente para administración al cuerpo, o un precursor del mismo, con el portador para formar un conjugado intermedio, y después de ello

(b) (i) hacer reaccionar el conjugado intermedio con un agente reticulante heterobifuncional para activar el conjugado intermedio y hacer reaccionar entonces el conjugado intermedio activado con un resto orientador; o (ii) hacer reaccionar el conjugado intermedio con un resto orientador que se ha activado mediante reacción con un agente de reticulación heterobifuncional, o (iii) hacer que el conjugado intermedio, un agente reticulante heterobifuncional y un resto orientador reaccionen simultáneamente entre sí,

en el que el agente reticulante tiene una funcionalidad que es específica para reacción con grupos presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y una segunda funcionalidad que es específica de reacción con grupos presentes en el resto orientador y ausentes en el portador.

Se prefiere particularmente que la reacción del portador con el agente para administración al cuerpo (o precursor del mismo) y con el agente reticulante heterobifuncional sea mediante dos tipos diferentes de grupo funcional presentes en el portador, y que la reacción del agente reticulante heterobifuncional con el resto orientador tenga lugar mediante un tercer tipo de grupo funcional presente en el resto orientador, siendo los tres tipos de grupos funcionales diferentes entre sí.

El procedimiento según este aspecto de la invención es ventajoso en que la reacción del portador con el agente para administración al cuerpo (o precursor del mismo) y la reacción del portador con el resto orientador se llevan a cabo en etapas separadas. El portador se hace reaccionar así con el agente para administración al cuerpo antes de conjugarse con el resto orientador, y se evita la reacción del agente para administración al cuerpo con el resto orientador. Puede conseguirse así una alta carga de agente en el portador, y por tanto en el conjugado final, con un efecto adverso mínimo o nulo sobre la actividad de unión del resto orientador. Los conjugados preparados según el procedimiento pueden caracterizarse por lo tanto por la ausencia de agente para administración al cuerpo (o precursor del mismo) en el resto orientador. Para decirlo de otro modo: el conjugado es preferiblemente tal que al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95% y lo más preferiblemente al menos un 99% de los agentes para administración al cuerpo (o precursores de los mismos) estén unidos covalentemente al portador, en lugar de al resto orientador. Esto conduce a una pérdida mínima de actividad de unión, y el conjugado preparado según la invención puede caracterizarse por lo tanto porque la actividad de unión del resto orientador en el conjugado, medida en un ensayo de unión competitiva, es al menos de un 50%, más preferiblemente de al menos un 60%, 70%, 80% o al menos un 90% de la del resto orientador.

Cuando el portador tiene la forma de una partícula, el procedimiento según la invención puede incluir la etapa preliminar de formar la partícula a partir de material formador de partícula, constituyendo la partícula el portador, que se hace reaccionar entonces con el agente para administración al cuerpo (o precursor del mismo) y posteriormente con el resto orientador.

En una variación de este procedimiento, la etapa de formación de partícula puede tener lugar después de que el agente de administración al cuerpo, o precursor del mismo, se haya hecho reaccionar con el material formador de partícula.

Cuando el portador se hace reaccionar con un precursor del agente que se va a suministrar al cuerpo, el precursor se convertirá posteriormente en ese agente. Dicha conversión puede tener lugar antes de, después de o simultáneamente a la etapa (b) del procedimiento. Cuando el precursor es un agente quelante y la conversión implica la formación de un quelato entre el agente quelante e iones metálicos, se prefiere que el pH de la mezcla de reacción se mantenga, durante la adición de los iones metálicos, entre 5,0 y 6,5.

El procedimiento es particularmente aplicable a la preparación de conjugados en los que el portador es proteico.

El agente reticulante tiene una funcionalidad que es específica de la reacción con grupos presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, por ejemplo, grupos sulfhidrilo, y una segunda funcionalidad que es específica de reacción con grupos presentes en el resto orientador y ausentes en el portador, por ejemplo, grupos aldehído. Esto reduce o elimina la aparición de reacciones secundarias indeseadas que conducirían al acoplamiento conjunto de portadores y/o restos orientadores. El procedimiento es también particularmente aplicable a la preparación de conjugados en la que el agente para administración al cuerpo tiene, o se ha acoplado con el portador mediante un compuesto o resto intermedio que contiene, grupos carboxilo o derivados de los mismos, en cuyo caso el acoplamiento con el portador puede ser mediante enlaces amida formados entre los grupos carboxilo y los grupos amino presentes en el portador.

Cuando el agente reticulante heterobifuncional reacciona con grupos sulfhidrilo presentes en el portador, se ha encontrado que los grupos sulfhidrilo libres en el conjugado intermedio se bloquean reversiblemente durante la etapa (a) del procedimiento. En dicho caso, el procedimiento incluye preferiblemente una etapa intermedia (entre las etapas (a) y (b)) de desbloqueo de grupos sulfhidrilo libres. Dicho desbloqueo se lleva a cabo preferiblemente mediante incubación del conjugado intermedio, por ejemplo a una temperatura de entre 20 y 50ºC, durante un periodo de entre 1 y 24 horas.

Según un aspecto adicional más de la invención, se proporciona el uso de un conjugado según el primer aspecto de la invención en la fabricación de una formulación para potenciar el contraste de una imagen a obtener mediante una técnica de formación de imágenes médicas.

Descripción detallada de la invención Naturaleza del material portador

Los conjugados según el primer aspecto de la invención comprenden proteína como material portador para el agente de contraste y el resto orientador.

Las proteínas que pueden usarse como materiales portadores incluyen proteínas globulares y proteínas fibrosas o estructurales, y mezclas de las mismas.

Los ejemplos de proteínas globulares incluyen proteínas séricas sintéticas o naturales, derivados naturales o sintéticos de las mismas, sales, derivados modificados enzimática, químicamente o de otro modo, escindidos, acortados o reticulados, oxidados o hidrolizados o subunidades de los mismos. Los ejemplos de proteínas fibrosas o estructurales incluyen colágeno sintético o natural, elastina, queratina, fibroína, fibrina y fibronectina, derivados naturales o sintéticos de los mismos y mezclas de los mismos. Son ejemplos de proteínas séricas albúmina, \alpha-globulinas, \beta-globulinas, \gamma-globulinas, transtiretina, fibrinógeno, trombina y transferrina.

La proteína es lo más preferiblemente una molécula proteica individual, completa o sustancialmente completa. Sin embargo, la molécula proteica puede ser un oligómero de moléculas proteicas conjugadas completas o sustancialmente completas. Dicho oligómero puede ser un dímero, trímero u oligómero superior proteico que comprende hasta, digamos, 20 moléculas proteicas discretas, más preferiblemente hasta 10, o hasta 5 moléculas proteicas discretas.

La molécula proteica puede ser como alternativa un fragmento de una molécula proteica completa, por lo que se entiende una molécula que comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a una secuencia de aminoácidos encontrada en una molécula proteica de origen natural, pero que es de longitud menor. Dicho fragmento, sin embargo, comprende preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una longitud de más de un 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, y lo más preferiblemente de más de un 95%, de la de una molécula proteica de origen natural, y que tiene un grado de homología mayor de un 80%, 90% o lo más preferiblemente mayor de un 95%, con la correspondiente parte de la molécula proteica de origen natural.

La transferrina puede tener beneficios particulares como material portador en que tiene numerosos sitios de acoplamiento potenciales, puede facilitar el transporte de un conjugado según la invención a través de la barrera hematoencefálica, y puede prepararse en forma de producto recombinante (véase, por ejemplo, MacGillivray y col. 2002, en "Molecular and Cellular Iron Transport", Templeton (Ed), Marcel Dekker, Inc. pág. 41 y Mason y col. 1993. Biochemistry 32: 5472).

El material portador particularmente preferido es la albúmina, por las razones detalladas a continuación.

Cuando se pretenden los conjugados para administración al cuerpo humano, el material portador es preferiblemente de origen humano, concretamente, derivado realmente de seres humanos, o es idéntico (o sustancialmente) en estructura a proteína de origen humano. Por tanto un material portador particularmente preferido es la seroalbúmina humana.

La seroalbúmina humana puede derivar de suero, por ejemplo, se puede obtener a partir de sangre donada. Sin embargo, para eliminar o reducir el riesgo de transmisión de contaminantes potenciales, por ejemplo, agentes víricos u otros dañinos, que pueden estar presentes en productos derivados de la sangre, así como las limitaciones potenciales de administración asociadas a material aislado a partir de sangre donada, se prefiere que el material portador, por ejemplo seroalbúmina humana, sea un producto recombinante derivado de microorganismos (incluyendo líneas celulares), plantas o animales transgénicos que se han transformado o transfectado para expresar el material portador.

El material portador actualmente más preferido para uso en la presente invención es por tanto la seroalbúmina humana recombinante (rHA). Pueden obtenerse comercialmente las formas adecuadas de rHA en Delta Biotechnology Ltd, Nottingham, Reino Unido.

Los procedimientos para la preparación de rHA serán en general familiares para los expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 96/37515 y WO 00/44772.

En un procedimiento preferido para la preparación de rHA, se deriva una disolución inicial de rHA de un medio de cultivo fúngico obtenido cultivando un hongo transformado con una secuencia nucleotídica codificante de rHA en un medio de fermentación, con lo que dicho hongo expresa rHA y lo secreta al medio. El hongo puede ser un hongo filamentoso tal como de la especie Aspergillus. Preferiblemente, el hongo es una levadura. Más preferiblemente, el hongo es del género Saccharomyces (por ejemplo, S. cerevisiae), el género Kluyveromyces (por ejemplo, K. lactis) o del género Pichia (por ejemplo, P. pastoris).

La rHA contiene preferiblemente una proporción sustancial de moléculas con un grupo -SH (sulfhidrilo o tiol) libre. Esto proporciona un medio particularmente útil de conjugación de la molécula de rHA con un resto orientador, como se describe a continuación.

Cuando la química de conjugación según la invención se aplica a un portador no proteico, puede emplearse uno cualquiera de una variedad de materiales portadores. El material portador debería ser biocompatible y debería ser tal que los conjugados del material portador con el resto orientador mantuvieran su integridad antes del uso y durante su vida útil in vivo. Se prefiere en gran medida que el material portador tenga dos tipos diferentes de grupos funcionales, que posibiliten usar diferentes procedimientos químicos para el acoplamiento del material portador al agente para administración al cuerpo (o precursor del mismo) y al resto orientador.

Otros materiales no proteicos que pueden usarse como materiales portadores incluyen polisacáridos, así como polímeros sintéticos adecuados.

Sin embargo, el material portador es lo más preferiblemente proteico. Cuando el portador está en forma de partícula, el material portador (o material formador de partícula) puede ser insoluble o la partícula puede formarse a partir de un material soluble y volverse entonces insoluble mediante un tratamiento posterior, por ejemplo, reticulación termoinducida. Por ejemplo, el material portador puede ser colágeno o gelatina.

Cuando el portador no está en forma de partícula, entonces el material portador es preferiblemente soluble.

La albúmina es el material portador más preferido actualmente para conjugados tanto solubles como en partícula, por las siguientes razones:

a) la albúmina es soluble en medios acuosos;

b) las partículas de albúmina pueden volverse fácilmente insolubles;

c) el grupo sulfhidrilo libre presente en la molécula de albúmina proporciona un medio para el acoplamiento selectivo al resto orientador; y

d) la albúmina contiene numerosos residuos aminoacídicos con grupos amino pendientes (específicamente, residuos de lisina) que proporcionan sitios de acoplamiento para agentes para administración al cuerpo.

Formación de partículas

Pueden producirse partículas de material formador de partícula mediante cualquier técnica adecuada, y resultarán familiares para los expertos en la técnica numerosas de dichas técnicas.

Un procedimiento particularmente preferido para preparar las partículas según la invención comprende las etapas de

i) formar una suspensión de material formador de partícula; y

ii) secar por pulverización dicha suspensión.

La etapa i), concretamente la formación de una suspensión de material formador de partícula, se lleva a cabo preferiblemente disolviendo en primer lugar el material formador de partícula en un disolvente, y añadiendo entonces a la disolución así formada un no disolvente del material formador de partícula, de modo que cause la precipitación del material formador de partícula. Por un "no disolvente" se entiende un líquido en el que la solubilidad del material formador de partícula sea sustancialmente menor que la solubilidad del material formador de partícula en el disolvente, pero que sea miscible con el disolvente.

El no disolvente se añade preferiblemente en exceso, concretamente el volumen de no disolvente añadido al disolvente es preferiblemente mayor que el volumen de la disolución de material formador de partícula en el disolvente. En otras palabras, la mezcla de disolvente/no disolvente que se seca por pulverización en la etapa ii) comprende lo más preferiblemente un exceso de 50% v/v de no disolvente, más preferiblemente un exceso de 60% v/v, y posiblemente un exceso de 70% v/v.

Lo más habitualmente, el disolvente es agua. El no disolvente preferido es etanol. Sin embargo, en general puede usarse cualquier combinación adecuada de disolvente y no disolvente, a condición de que la adición de no disolvente tenga el efecto deseado de causar la precipitación del material formador de partícula y que el disolvente y el no disolvente sean miscibles en las proporciones usadas.

Aunque el disolvente es lo más habitualmente agua, puede ser como alternativa, por ejemplo, un disolvente orgánico. En dicho caso, el no disolvente puede ser agua, y el uso del no disolvente puede ser beneficioso para reducir los riesgos asociados al secado por pulverización posterior de la suspensión que contiene el disolvente orgánico posiblemente inflamable.

Cuando, como es habitualmente el caso, el material formador de partícula es un material proteico, la precipitación mediante la adición de un no disolvente se lleva a cabo preferiblemente a un pH que se aleja del punto isoeléctrico, para prevenir o minimizar la aglomeración de las partículas suspendidas y para producir partículas hidrófilas que son fácilmente susceptibles de dispersión después de secado por pulverización. De este modo, puede evitarse el uso de tensioactivos adicionales para conseguir los mismos objetivos.

La etapa ii), concretamente el secado por pulverización de la suspensión formada en la etapa i), puede llevarse a cabo de manera generalmente convencional, usando equipamiento de naturaleza generalmente convencional. En esquema, el procedimiento de secado por pulverización implica la pulverización de la suspensión en una cámara que contiene un gas calentado, lo más habitualmente aire. Esto causa que la mezcla de disolvente/no disolvente se evapore y produzca partículas sólidas. Se extrae el gas de la cámara y se separan del gas las partículas atrapadas en el gas, por ejemplo, mediante un separador ciclónico o alguna forma de dispositivo de filtrado. Se recogen entonces las partículas en un recipiente adecuado.

Las propiedades de las partículas obtenidas mediante el procedimiento de secado por pulverización dependen de una serie de factores. Estos incluyen el caudal de gas a través del aparato de secado por pulverización, la concentración de material formador de partícula en la suspensión, la naturaleza del disolvente y el no disolvente, la velocidad a la que se alimenta la suspensión al aparato de secado por pulverización y la temperatura del gas en la cámara. Habitualmente, pueden conseguirse distribuciones de pequeño tamaño mediante una combinación de una baja velocidad de alimentación de la suspensión, un diseño de tobera apropiado, un alto grado de atomización y un alto caudal de
gas.

Se prefiere particularmente que, entre la etapa i) y la etapa ii), concretamente después de la formación de la suspensión pero antes del secado por pulverización, se someta la suspensión a homogeneización, por ejemplo, mediante agitación mecánica. Esto da como resultado una distribución de tamaño aún más homogénea de las partículas en la suspensión, y una distribución de tamaño correspondientemente menor y más homogénea aún de las partículas formadas en la etapa ii).

La suspensión contiene preferiblemente de 0,1 a 50% p/v de material formador de partícula, más preferiblemente de 1 a 20% p/v, y lo más preferiblemente de 2 a 10% p/b, particularmente cuando el material formador de partícula es albúmina. Pueden usarse mezclas de materiales formadores de partícula, en cuyo caso las cifras anteriores representan el contenido total de material(es) formador(es) de partícula.

Después del secado por pulverización de las partículas, puede ser necesario o deseable que las partículas se vuelvan insolubles. Esto puede conseguirse mediante reticulación del material formador de partícula, que puede hacerse con una variedad de técnicas que son conocidas per se. En un procedimiento preferido, las partículas se vuelven insolubles mediante tratamiento térmico, por ejemplo, a una temperatura de más de 150ºC durante un periodo de más de 30 min, por ejemplo 1 hora o varias horas.

El procedimiento preferido para preparar partículas como se definen anteriormente es ventajoso porque las dos etapas del procedimiento (formación de una suspensión y secado por pulverización) pueden optimizarse separadamente para conseguir la forma y distribución de tamaño deseados de las partículas. Esto da un alto grado de control sobre las propiedades de las partículas. En particular, el procedimiento posibilita la producción de partículas de tamaños particularmente pequeños y distribuciones de tamaño particularmente estrechas. Las partículas producidas mediante este procedimiento pueden tener, por ejemplo, tamaños de partícula predominantemente menores de 4 \mum y tamaños numéricos con picos modales por debajo de 1 \mum y tamaños medios (medidos usando un contador Coulter) menores de 2 \mum. Las partículas con dichos pequeños tamaños son beneficiosas porque pueden entrar en vasos sanguíneos muy pequeños (capilares) y/o pueden penetrar profundamente en los pulmones. Puede ser también posible producir partículas de mayor tamaño, por ejemplo para administración nasal.

Se apreciará que las referencias al "tamaño" de las partículas entenderán normalmente el "diámetro" de las partículas, puesto que las partículas serán lo más habitualmente esféricas. Sin embargo, se apreciará también que las partículas pueden no ser esféricas, en cuyo caso el tamaño puede interpretarse como el diámetro de una partícula esférica teórica que tiene una masa igual a la de la partícula no esférica.

Acoplamiento de agentes al material portador

El acoplamiento del agente para administración al cuerpo con el material portador puede llevarse a cabo mediante cualquiera de una serie de medios, dependiendo entre otros de la naturaleza del agente y de la naturaleza del material portador. En general, sin embargo, el acoplamiento implicará la formación de enlaces covalentes entre el material portador y el agente, o entre el material portador y un resto de acoplamiento capaz de formar un enlace químico o físico con el agente mismo.

Un procedimiento preferido de acoplamiento, particularmente apropiado para el acoplamiento de metales, por ejemplo metales para uso en IRM o formación de imágenes de tipo nuclear, o el acoplamiento de metales radiactivos para uso en radioterapia, implica la conjugación del material portador con un agente quelante que es capaz de unirse al metal.

En una realización particularmente preferida, el agente quelante comprende grupos carboxilo, o derivados de los mismos, que reaccionan con grupos amina presentes en el material portador (por ejemplo, material portador proteico tal como albúmina) formando enlaces amida que ligan el agente quelante con el material portador. Puede añadirse entonces una disolución de una sal adecuada del metal, conduciendo a la quelación del metal por el agente quelante conjugado.

Los agentes quelantes que pueden usarse incluyen derivados de ácido acético de compuestos que contienen múltiples grupos amina. Los ejemplos incluyen ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético y derivados de los mismos, por ejemplo, anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético. Otras clases de agente quelante que pueden ser útiles incluyen agentes quelantes macrocíclicos. Son ejemplos de quelantes macrocíclicos:

ácido 1,4,7-triazaciclononano-N,N',N''-triacético(NOTA)

Ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-N,N',N'',N'''-tetraacético (DOTA)

ácido 1,4,8,11-tetraazaciclotetradecano-N,N',N'',N'''-tetraacético (TETA).

Otros procedimientos para acoplar agentes quelantes con material portador resultarán evidentes para los expertos en la técnica. Las químicas adecuadas implican lo más habitualmente la formación de engarces a través de grupos amina, tiol, carbonilo, carboxilo o hidroxilo presentes en el material portador y/o el agente quelante.

Cuando el agente se acopla con el portador en forma de un quelato metálico, el quelato puede formarse como parte del procedimiento de fabricación, o como alternativa el metal puede añadirse después, por ejemplo justo antes del uso. Particularmente cuando el metal es un metal radiactivo, puede ser deseable para los iones metálicos añadirse a la formulación inmediatamente antes del uso.

Igualmente, pueden acoplarse directamente al material portador agentes orgánicos, tales como los compuestos que contienen yodo designados a continuación que se usan como agentes de contraste de rayos X, mediante la formación de enlaces covalentes entre el agente orgánico y el material portador. Los procedimientos para acoplar agentes orgánicos con material portador serán de nuevo evidentes para los expertos en la técnica, y pueden implicar la formación de engarces a través de grupos amina, tiol, carbonilo, carboxilo o hidroxilo presentes en el material portador y/o el agente orgánico.

En general, se acoplan más de una molécula de agente orgánico o agente quelante con el portador, más preferiblemente más de 10 de dichas moléculas o más de 20 de dichas moléculas. En el caso preferido de un material portador proteico, por ejemplo albúmina, puede ser posible acoplar entre 10 y 100, más preferiblemente entre 20 y 60, moléculas de agente orgánico o agente quelante con cada molécula de proteína, por ejemplo, 20-50 moléculas de dicho agente por molécula de proteína. Esto conduce a una densidad considerablemente aumentada de dichos agentes, comparada con los sistemas de administración convencionales para agentes de contraste de IRM o metales radiactivos para uso en radioterapia. En muchos casos, puede ser deseable para que la carga de agente orgánico o agente quelante en el portador sea lo más alta posible. En otros casos, puede ser beneficioso limitar la carga a un nivel menor.

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Naturaleza del resto orientador

El material portador se conjuga con un resto orientador que tiene afinidad por un órgano o foco patológico particular en el cuerpo. Dichos restos orientadores incluyen antibióticos, otras proteínas y péptidos. Los restos orientadores preferidos son anticuerpos, particularmente anticuerpos monoclonales. Están disponibles comercialmente muchos restos orientadores adecuados (por ejemplo anticuerpos).

Los ejemplos de anticuerpos que pueden ser útiles como restos orientadores en la presente invención incluyen:

Tipo de tumor	Antígeno diana	Anticuerpo
Cáncer colorrectal	CEA	hMN-14
Cáncer de mama	MUC1	HuBrE3
Cáncer de vejiga	MUC1	C595
Cáncer de próstata	PSMA	J591
Carcinoma de células renales	Glucoproteína	chG250

Los ejemplos adicionales de anticuerpos que pueden conjugarse con el material portador incluyen los siguientes:

a) Vitaxin^{TM}- un anticuerpo humanizado que se une a \alphav\beta3 expresado en vasos sanguíneos recién formados en tumores;

b) anticuerpo CD22 humanizado (normalmente marcado con itrio-90 para tratamiento de linfoma no de Hodgkins); y

c) anticuerpo \alphaCD45 de tirosina fosfatasa CD45, que se expresa en todas las células hematopoyéticas y particularmente en linfocitos.

Los ejemplos de otras formas de resto orientador incluyen:

a) fibrina para la formación de imágenes de coágulos;

b) restos de unión que se unen a fibrina;

c) moléculas orgánicas lipófilas y anfífilas;

d) ligandos de receptor;

e) esteroides;

f) lípidos;

g) hormonas;

h) un péptido sintético (comercialmente disponible en Diatide) que se une a receptor de somatostatina en cánceres pulmonares;

i) fragmentos de anticuerpo creados contra antígeno de leucocitos para detectar enfermedades infecciosas; y

j) anexina V, que se une a fosfatidilserina liberada con la muerte celular, un marcador para la formación de imágenes de enfermedad cardiaca y la evaluación de la respuesta a la quimioterapia.

El efecto del resto orientador es concentrar los conjugados, cargados con agente de contraste o agente terapéutico, en una localización deseada en el cuerpo, por ejemplo, un órgano o foco patológico particular tal como un tumor.

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Acoplamiento de portador a resto orientador

Los procedimientos para el acoplamiento de restos orientadores al material portador son conocidos per se y resultarán familiares para los expertos en la técnica. Las químicas adecuadas implican lo más habitualmente la formación de engarces entre grupos amina, tiol, carbonilo, carboxilo o hidroxilo presentes en el material portador y/o el resto orientador.

El portador se acopla con el resto orientador usando un agente reticulante heterobifuncional. El agente reticulante tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes en el portador. Como se describe anteriormente, esto elimina la aparición de reacciones secundarias indeseadas tales como el acoplamiento conjunto de moléculas portadoras o partículas, la reacción de ambas funcionalidades del agente reticulante con el portador o el resto orientador, etc.

El agente reticulante puede hacerse reaccionar en primer lugar con el conjugado intermedio (concretamente, el portador después de reacción con el agente para administración al cuerpo o precursor del mismo), activando así el conjugado intermedio, y añadiendo entonces el resto orientador (por ejemplo, un anticuerpo) que reaccionará con el otro extremo del agente reticulante heterobifuncional. Como alternativa, el agente reticulante puede hacerse reaccionar en primer lugar con el resto orientador, y el resto orientador activado hacerse reaccionar entonces con el conjugado intermedio. También puede ser posible hacer reaccionar conjuntamente conjugado intermedio, resto orientador y agente reticulante en una sola etapa. Los agentes reticulantes heterobifuncionales adecuados están comercialmente disponibles.

Los reticulantes preferidos para reacción mediante un grupo -SH (sulfhidrilo o tiol) en el portador tienen grupos que reaccionan específicamente con grupos sulfhidrilo. Es un ejemplo preferido de dicho grupo un grupo maleimido. Son otros ejemplos 2-piridilditio, haloacetato o haloacetamida, en particular los derivados yodados, aziridina, acriloílo/vinilo, 4-piridiltio y 2-nitrobenzoato-5-ditio.

En el caso de un material portador que no contiene grupos tiol libres, dichos grupos pueden generarse en el portador, por ejemplo mediante reducción con ditiotreitol, o introducirse usando agentes tiolantes tales como iminotiolano o S-acetiltioacetato de N-succinimidilo (SATA).

Es un procedimiento preferido de reacción del reticulante con el resto orientador, especialmente cuando este último es un anticuerpo u otra proteína, mediante un resto carbohidrato en el resto orientador. En condiciones oxidantes suaves, los cis-dioles encontrados en carbohidratos pueden convertirse en grupos aldehído, con los que los grupos hidrazida son específicamente reactivos.

Por tanto, los agentes de reticulación heterobifuncionales particularmente preferidos para uso en la invención incluyen tanto una funcionalidad reactiva con SH, por ejemplo maleimida o 2-piridilditio, como una funcionalidad reactiva con aldehído, por ejemplo hidrazida.

Son por tanto agentes reticulantes heterobifuncionales preferidos para uso en la invención:

hidrazida del ácido maleimidocaproico (designada habitualmente como EMCH)

hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionilo (PDPH)

hidrazida del ácido maleimidopropiónico (MPH)

hidrazida del ácido N-(\kappa-maleimidoundecanoico) (KMUH)

hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico (MPBH).

Los agentes reticulantes que incluyen grupos hidrazida pueden usarse en forma de sus sales de adición de ácido, especialmente el clorhidrato.

Como se describe anteriormente, en el caso preferido en que el material portador es rHA, es un procedimiento particularmente útil de acoplamiento del resto orientador con la molécula de rHA mediante engarce a través del grupo sulfhidrilo libre (tiol) que está presente en rHA. Ya que no hay más de uno de dichos grupos sulfhidrilo libres en cada molécula de rHA, una molécula de rHA se acoplará con sólo un resto orientador.

La rHA tiene preferiblemente un contenido de tiol libre de al menos 0,85, 0,8, 0,75, 0,7, 0,65 ó 0,60 mol de SH/mol de proteína cuando se mide usando reactivo de Ellman, 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoato) (DTNB), que es un medio específico de detección de grupos sulfhidrilo libres tales como cys-SH (Cys-residuo 34 en el caso de rHA). La reacción libera el ión 5-tio-2-nitrobenzoato TNB^{2-}, que tiene un máximo de absorción a 412 nm. A medir el aumento de absorbancia a 412 nm y dividir entre el coeficiente de extinción molar del ión TNB^{2-} a 412 nm, puede calcularse el contenido de sulfhidrilo libre de rHA.

Preferiblemente, se acoplará un resto orientador anticuerpo con el material portador mediante un sitio de acoplamiento en la región constante del anticuerpo, de modo que se conserve la actividad de unión específica de la región variable del anticuerpo.

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Naturaleza de los agentes de contraste

Los conjugados y formulaciones según la invención son útiles para la administración de agentes de contraste. Las técnicas de formación de imágenes en las que se usan agentes de contraste incluyen IRM, técnicas de formación de imágenes por rayos X y formación de imágenes de tipo nuclear, incluyendo PET.

Los agentes de contraste de rayos X que pueden usarse en la invención incluyen una variedad de compuestos que contienen yodo que tienen propiedades adecuadas para dicho uso. Dichos compuestos son generalmente solubles y pueden ser iónicos o no iónicos. Es un ejemplo particular de dicho agente de contraste de rayos X el conocido como iopamidol. Otros agentes de contraste de rayos X conocidos incluyen iomeprol, iopromida, ioversol, iodixanol e iohexol.

Los agentes de contraste de IRM que pueden usarse incluyen una variedad de compuestos que comprenden iones metálicos paramagnéticos. Dichos iones adecuados incluyen manganeso y, particularmente, gadolinio.

Los metales se usan también en la formación de imágenes de tipo nuclear. Los metales adecuados para esta aplicación son generalmente emisores \gamma radiactivos. Los ejemplos incluyen ^{99m}Tc, ^{201}Tl y ^{111}In.

Además de metales, puede ser posible también acoplar con el material portador átomos no metálicos que son útiles en la formación de imágenes (o acoplar compuestos que contienen dichos átomos o en los que pueden introducirse dichos átomos). Los ejemplos de dichos átomos incluyen ^{123}I y ^{121}I.

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Metales útiles en radioterapia

Los conjugados y formulaciones según la invención pueden usarse también para suministrar metales radiactivos útiles en radioterapia. Dichos metales son generalmente emisores de partículas \beta, y los ejemplos incluyen ^{67}Cu, ^{153}Sm, ^{90}Y, ^{191}Pt, ^{193}Pt y ^{195}Pt.

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Administración de las formulaciones

Los conjugados y formulaciones según la invención pueden administrarse mediante una variedad de vías. Las formulaciones pueden administrarse, por ejemplo, por vía intravenosa. Las formulaciones pueden administrarse también mediante inhalación oral o nasal, por ejemplo en forma de una disolución nebulizada. Cuando sea apropiado, las formulaciones pueden suministrarse directamente a un foco patológico mediante un catéter.

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Realizaciones ejemplares de la invención

La invención se describirá ahora con mayor detalle, sólo a modo de ilustración, con referencia a los siguientes ejemplos y los dibujos adjuntos. Los ejemplos 1 a 10 se refieren a conjugados basados en rHA soluble, y los ejemplos 11 a 19 se refieren a conjugados basados en partículas de rHA insoluble.

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Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra las propiedades de IRM in vitro de rHA marcada con gadolinio-ácido dietilentriaminopentaacético (Gd-DTPA);

La Figura 2 muestra la unión de iones de cobre a albúmina marcada con DTPA;

La Figura 3 muestra la capacidad de unión a Gd^{3+} de un conjugado de rHA-DTPA en función de la cantidad de DTPAa usada en la reacción;

La Figura 4 ilustra la factibilidad de la separación de rHA-dTPA del DTPA en exceso mediante diferentes procedimientos cromatográficos;

La Figura 5 ilustra la recuperación del tiol libre en muestras de rHA-DTPA y rHA-DTPA-Gd;

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La Figura 6 muestra la extensión de la reacción de un anticuerpo con PDPH, como se indica mediante la medida de la 2-tiopiridina liberada;

La Figura 7 es una gráfica similar a la Figura 6, para un anticuerpo diferente;

La Figura 8 demuestra la retención de la capacidad de unión para un conjugado según la invención;

La Figura 9 muestra las propiedades in vitro de IRM de partículas de rHA marcadas con Gd-DTPA;

La Figura 10 muestra la distribución del tamaño de partícula de partículas de rHA antes (Figura 10a) y después (Figura 10b) de marcar con Gd-DTPA; y

La Figura 11 es una microfotografía de partículas de rHA marcadas con Gd-DTPA después de resuspensión en agua.

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Abreviaturas

\alphaCD45: CD45 de ratón anti-rata

C595: anticuerpo monoclonal específico del antígeno MUC1

DTNB: reactivo de Ellman (ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzoico))

DTPA: pentaacetato de dietilentriamina

DTPAa: anhídrido del ácido dietilentriaminopentaacético

DTT: ditiotreitol

EMCH: hidrazida del ácido N-(\varepsilon-maleimidocaproico)

GPHPLC: cromatografía de exclusión molecular-líquida de alta resolución

IgG: inmunoglobulina G

mAb: anticuerpo monoclonal

IRM: formación de imágenes por resonancia magnética

PBS: disolución salina tamponada con fosfato (NaCl al 0,9% (p/v), Na_{2}HPO_{4} 15 mM, NaH_{2}PO_{4} 5 mM)

PDPH: hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionilo

rHA: albúmina humana recombinante

XO: naranja de xilenol

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Procedimientos generales para los ejemplos 1 a 10 Ensayo de tiol libre

Se determinó la concentración de tiol libre mediante reacción con DTNB a pH 8 y medida de la absorbancia a 412 nm, usando un coeficiente de extinción de 13.600 M^{-1}.cm^{-1} para el 5-tio-2-nitrobenzoato liberado.

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Ensayo de proteína

Se determinó la concentración de rHA mediante medida de la absorbancia en el pico cercano a 280 nm, usando un coeficiente de extinción a 1 g.l^{-1} de 0,53. Se determinaron de forma similar las concentraciones de IgG, pero usando un coeficiente de extinción a 1 g.l^{-1} de 1,43.

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GP-HPLC

Se realizó la GP-HPLC usando una columna y carcasa TSKgel G3000SWXL de 0,78\times30 cm (Tosoh Biosep), eluída a 1 ml.min^{-1} en PBS.

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Materiales

Se obtuvieron DTPAa y cloruro de gadolinio en Sigma. Se obtuvo Recombumin®-25 (rHA al 25% (p/v)) en Delta Biotechnology Ltd, Nottingham, R.U. Magnevist^{TM} (un quelato 0,5 M de Gd-DTPA) estaba disponible en fuentes comerciales, y se usó como control.

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Ejemplo 1

Preparación de rHA soluble marcada con agente de contraste de IRM (quelato de gadolinio)

Este procedimiento describe el desarrollo de un agente de contraste de IRM basado en rHA soluble marcada con DTPA seguido de gadolinio (Gd).

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1.1 Preparación de rHA marcada con agente de contraste de IRM (rHA-DTPA-Gd)

Se diluyó rHA a rHA 20 g.l^{-1} y se añadió lentamente DTPAa (1 g por 0,3 g de rHA) con agitación constante durante un periodo de aproximadamente 30 min. Durante este tiempo, se añadió NaOH 5 M para mantener el pH lo más cercano posible a 8,0. Se continuó la agitación durante 30 min después de la adición final de DTPAa y se ajustó entonces el pH a 7,0 con HCl 5 M. Se dializó el rHA-DTPA soluble durante una noche frente a aproximadamente 120 vol. de agua para retirar el DTPA en exceso.

Se efectuó el marcaje con Gd mediante valoración con GdCl_{3} 0,1 M. Se tuvo cuidado de evitar añadir un exceso de GdCl_{3}, que daba como resultado la formación de complejo y la precipitación de albúmina. Se consideró que el punto de precipitación era una medida del DTPA disponible. El nivel de DTPA unido resultante, determinado a partir del punto de precipitación inducida por Gd, fue de rHA 46 mol.mol^{-1}.

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1.2 Propiedades de formación de imágenes de rHA marcada con agente de contraste de IRM (Gd-DTPA)

Se preparó rHA-DTPA-Gd soluble esencialmente como se describe anteriormente, pero con las siguientes modificaciones:

a) la concentración de rHA para el marcaje de DTPA fue de 25 g.l^{-1};

b) el tiempo de adición de DTPAa fue de \approx 25 minutos;

c) se efectuó la diálisis frente a aproximadamente 350 vol. de agua durante 18 horas, seguido de aproximadamente 100 vol. durante 2 horas;

d) el nivel de DTPA unido resultante, determinado a partir del punto de precipitación inducida por Gd, fue de rHA 45 mol.mol^{-1}.

Se filtró el material resultante a 0,2 \mum, se concentró aproximadamente a rHA 90 g.l^{-1} (basado en la rHA de partida) mediante ultrafiltración (concentradores centrífugos Vivaspin20 10000MWCO a 3300 rpm en centrífuga Sorvall RT6000B) y se formuló a rHA 50 g.l^{-1} en manitol al 5% (p/v). Se calculó la concentración de Gd resultante suponiendo pérdida nula durante la ultrafiltración. Se congeló el material formulado en alícuotas de 2 ml con agitación suave en un baño a -30ºC y se almacenó congelado (aproximadamente a -20ºC) hasta ser necesario.

Se efectuó una formación de imágenes por resonancia magnética con rHA-DTPA-Gd soluble y Magnevist^{TM}de control diluido apropiadamente a 2 ml con agua, se mezcló entonces con 8 ml de agarosa al 0,5%, dando la concentración de Gd especificada. Se determinaron las velocidades de relajación (R1 y R2) para cada muestra, usando un intervalo de tiempos de repetición (TR) y tiempos de eco (TE), ajustando los datos a

M = M_{\infty} (1 - e^{-R1.TR})\ o\ M = M_{0} (e^{-R2.TE})

en las que

M es la señal medida a tiempo T

M_{0} es la señal a T=0

y M_{\infty} es la señal a T=\infty.

Se compararon las propiedades de IRM in vitro de este rHA-DTPA-Gd solubles con las de Magnevist^{TM}, un agente de contraste de IRM comercial basado en Gd-DTPA (Figura 1). Ambas velocidades de relajación R1 y R2 eran significativamente mayores que las obtenidas con Magnevist^{TM}. Esto indicaba que el rHA-DTPA-Gd soluble debería producir imágenes in vivo equivalentes o mejores a las observadas con Magnevist^{TM}a la misma concentración de Gd, particularmente a la vista de la marcada reducción de la velocidad de eliminación prevista para el material basado en rHA. Como alternativa, se sugería que el rHA-DTPA-Gd soluble podría usarse a una dosis menor de Gd que Magnevist^{TM}.

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Ejemplo 2

Unión de iones de cobre a rHA soluble marcada con DTPA

La albúmina humana recombinante marcada con DTPA (como se prepara en el ejemplo 1) puede usarse como portador para metales radiactivos tales como cobre, indio, tecnecio y otros.

Para confirmar esto, puede mostrarse que la albúmina marcada con DTPA (preparada como en el ejemplo 1 anterior) se une a iones de cobre (para este ejemplo, se usó cobre no radiactivo).

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2.1 Preparación de rHA-DTPA

Se preparó una muestra de rHA-DTPA como se describe anteriormente en el ejemplo 1.3, pero con las siguientes modificaciones:

a) el tiempo de adición de DTPAa fue de \approx 20 min;

b) el tiempo de agitación después de la adición de DTPAa fue de \approx 20 min;

c) se efectuó diálisis frente a aproximadamente 350 vol. de agua durante 4 h, seguido de aproximadamente 350 vol. durante 16 h y aproximadamente 100 vol. durante 3 h;

d) se detuvo la preparación antes de la valoración con GdCl_{3};

e) el nivel de DTPA unido resultante, determinado a partir del punto de precipitación inducida por Gd con una pequeña muestra de rHA-DTPA, fue de rHA 46 mol.mol^{-1}.

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2.2 Valoración espectrofotométrica de Cu^{2+}

Se ajustó una alícuota de 5 ml de rHA-DTPA a pH 6 con NaOH 0,5 M y se registró el volumen total. Se tomó una muestra para la medida de A_{700} y se devolvió después al conjunto. Se añadieron 12 alícuotas de 50 \mul de CuSO_{4} 0,1 M con ajuste de pH y medida de A_{700}, como anteriormente, después de cada adición. Se corrigieron los valores de absorbancia medidos a un volumen de 5 ml y se representaron frente a la cantidad de Cu añadida. Se ajustaron las curvas de regresión a las dos fases de la valoración y se tomó su intersección como el punto final.

Como puede observarse en la Figura 2, la cantidad de unión de cobre (tomada como la intersección) coincidía estrechamente con la cifra obtenida para la unión de gadolinio (determinada mediante punto final de precipitación, como se describe en el ejemplo 1 anterior).

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Ejemplo 3

Optimización de la carga de portador

Para un efecto máximo, es importante en muchos casos que el portador porte la carga máxima de agente, por ejemplo Gd^{3+}, para uso en IMR, o metal radiactivo para uso en formación de imágenes o terapia de tipo nuclear. Este procedimiento describe la optimización de la capacidad de unión a Gd^{3+} para rHA.

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3.1 Síntesis de rHA-DTPA

Se diluyeron 4 alícuotas de 0,6 g cada una de rHA en 24 ml de agua. Se añadieron 2, 1, 0,5 ó 0,2 g de DTPAa a cada una durante 25, 20, 12 y 9 min respectivamente con agitación constante, manteniéndose el pH lo más cercano posible a pH 8 mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitaron las disoluciones durante \approx 30 min después de la adición final y se ajustaron a pH 7 con HCl 3 M. Se dializaron conjuntamente todas las muestras durante un total de 44 h frente a 4 cambios de 11 l de agua.

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3.2 Medida de la capacidad de unión de Gd^{3+}

Se determinó la capacidad de unión de Gd^{3+} mediante valoración complexométrica con indicador XO que, aproximadamente a pH 6, cambia de amarillo a púrpura en presencia de Gd^{3+} libre. Debido a que el color de XO depende también del pH y que se encontró que ocurrían grandes cambios de pH durante la valoración con GdCl_{3} de rHA-DTPA en disolución no tamponada, se requería un buen control del pH durante la valoración para resultados
fiables.

Se mezcló 1 ml de cada muestra de rHA-DTPA con 0,2 ml de hexamina 0,2 M y 5 \mul de XO al 0,1% (p/v) (pH inicial 5,9-6,1) y se valoró con GdCl_{3} 0,1 M hasta el primer cambio permanente de color (pH final 5,4-5,6). Para confirmar la validez de los resultados, se sometió también cada muestra a valoración espectrofotométrica con CuSO_{4}, como en el ejemplo 2. Se estandarizaron ambos valorantes frente a una disolución volumétrica estándar de sal de disodio de EDTA 10 mM (Fisher).

Los resultados (Tabla 1 y Figura 3) mostraron un excelente acuerdo entre los dos procedimientos, confirmando que ambos eran medidas fiables de los grupos DTPA disponibles. Indicaban también que era necesario el nivel más alto de adición de DTPAa (3,33g de DTPAa.g^{-1} de rHA; equivalente a 10 mol de DTPAa.mol^{-1} de rHA-NH_{2}) para dar una capacidad de unión a Gd^{3+} esencialmente máxima.

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TABLA 1

1

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Ejemplo 4

Optimización de la retirada de reactivos en exceso

Después de marcar la molécula portadora, es deseable retirar los reactivos en exceso. Se encontró que el uso de diálisis con este fin requería tiempos extremadamente largos y volúmenes extremadamente grandes para conseguir una retirada eficaz (véase, por ejemplo, el ejemplo 3.1). El uso de exclusión molecular ofrece drásticos ahorros de tiempo y volumen. Este procedimiento describe el desarrollo de exclusión molecular para la retirada de DTPA en exceso de rHA-DTPA.

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4.1 Síntesis de rHA-DTPA

Se diluyeron 0,3 g de rHA en 12 ml de agua y se añadió 1 g de DTPAa durante \approx 30 min con agitación constante, manteniéndose el pH lo más cercano posible a pH 8 mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitó la disolución durante \approx 60 min después de la adición final y se ajustó a pH 7 con HCl 3 M. El ensayo de tiol libre de este material dio un valor de 0,10 mol.mol^{-1} de rHA, comparado con un valor de 0,68 mol.mol^{-1} de rHA para la rHA de partida.

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4.2 Cromatografía en Sephadex G25

Se cargaron 0,5 ml de rHA-DTPA en una columna PD10 (una columna preempaquetada de 8,3 ml de medio Sephadex G25 de Amersham Biosciences), equilibrada con NaCl al 0,9% (p/v) de NaCl. Se eluyó la columna con alícuotas de 0,5 ml de NaCl al 0,9% (p/v), las cuatro primeras para desecho y las restantes se recogieron para ensayo. Para determinar el perfil de elución del rHA-DTPA, se diluyeron 0,1 ml de las fracciones apropiadas con 1 ml de agua y se midió la absorbancia a 280 nm. Para determinar el perfil de elución del DTPA libre en exceso, se diluyeron 20 \mul de las fracciones apropiadas con 1 ml de CuSO_{4} 4 mM en hexamina 20 mM a pH 5, y se midió la absorbancia a 700 nm. Los resultados (Figura 4a) indicaban que no se conseguía la separación de línea base de rHA-DTPA del DTPA libre en exceso a pesar de la carga de columna relativamente baja (6% de volumen de columna).

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4.3 Cromatografía en Sephadex G25 (a pequeña escala)

Se vació una columna PD10 y se volvió a empaquetar hasta el mismo volumen de lecho con medio Sephadex G50 (Amersham Biosciences). Se equilibró la columna con NaCl al 0,9%(p/v) y se cargó con 0,5 ml de rHA-DTPA. Se eluyó la columna y se ensayaron las fracciones como anteriormente. Los resultados (Figura 4b) indicaban una marcada mejora en la separación de los dos picos con la matriz de mayor porosidad, aunque la columna autoempaquetada era menos eficaz que la empaquetada comercialmente, dando como resultado anchuras de pico significativamente mayores.

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4.4 Longitud de onda de detección

Un espectro de absorbancia de DTPA 0,18 M a pH 7 (la concentración y pH aproximados al final de la reacción de rHA/DTPAa) mostraba una absorbancia despreciable por encima de 270 nm, apareciendo una absorbancia significativa por debajo de 260 nm. Por lo tanto, se eligió una longitud de onda de detección de 254 nm para controlar el efluente de columna para permitir la detección tanto de rHA-DTPA como de DTPA libre.

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4.5 Cromatografía en Sephadex G50 (gran escala)

Se empaquetó una columna XK16/40 (Amersham Biosciences) con medio Sephadex G50 en NaCl al 0,9%(p/v) a una altura de lecho de 37 cm y se conectó a un monitor UV-1 con celda de flujo de 2 mm (Amersham Biosciences) fijada a 254 nm y 2 UA de escala completa. Se preparó una muestra reciente de rHA-DTPA como anteriormente, pero con el tiempo de agitación entre la adición final y el ajuste a pH 7 reducido a \approx 30 min. Se cargó este material en la columna y se eluyó con NaCl al 0,9% (p/v) a 2,85 ml.min^{-1}. Los resultados (Figura 4c) indicaban que, incluso con la columna de carga alta (20% de volumen de columna), se conseguía fácilmente la separación de línea base del rHA-DTPA del DTPA libre en exceso,

\hbox{produciéndose el rHA-DTPA
purificado  al cabo de 10 min desde el inicio de la elución de
columna.}

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Ejemplo 5

Desarrollo de las condiciones para la recuperación de tiol libre en derivados de rHA solubles

Los resultados anteriores (véase el ejemplo 4) indicaban que el tiol libre de rHA se bloqueaba en gran medida por la reacción con DTPAa. Si este tiol iba a usarse como sitio de unión de reticulante, era necesaria la recuperación del tiol libre de rHA para una reacción eficaz con el reticulante. Este procedimiento describe el desarrollo de condiciones para conseguir este objetivo, siguiendo la reacción de rHA con DTPAa (rHA-DTPA) o la unión de Gd^{3+} a rHA-DTPA (rHA-DTPA-Gd).

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5.1 Efecto del almacenamiento sobre el tiol libre de rHA-DTPA

Se reensayó el contenido de tiol libre de rHA-DTPA del ejemplo 4 después de 6 semanas de almacenamiento refrigerado y se encontró que había aumentado de 0,10 a 0,29 mol.mol^{-1} de rHA. Esto sugería que la recuperación del tiol libre podría ser posible en condiciones adecuadas.

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5.2 Síntesis de rHA-DTPA

Se efectuó la síntesis de rHA-DTPA como en la cromatografía en Sephadex G50 del ejemplo 4 (a gran escala) con el pico de rHA-DTPA recogido a 2 a 9 min después del inicio de la elución. El nivel de tiol libre en la rHA de partida fue de 0,70 mol.mol^{-1} de rHA.

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5.3 Síntesis de rHA-DTPA-Gd

Se mezclaron 9,8 ml de rHA-DTPA con 30 \mul de XO al 0,1% (p/v) y se valoraron con GdCl_{3} 0,1 M, manteniendo el pH a entre pH 5,5 y pH 6,0 con NaOH 1 M hasta el punto final (\equiv 48 mol Gd^{3+}.mol^{-1} de rHA), indicado por el primer cambio de amarillo a púrpura.

Se añadieron 0,1 ml adicionales de rHA-DTPA para unir el exceso de Gd^{3+}, devolviendo el color a amarillo, y se ajustó la disolución a pH 7 con NaOH 1 M.

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5.4 Recuperación del tiol libre

Se tomaron 6 alícuotas de 1 ml tanto de rHA-DTPA como de rHA-DTPA-Gd. Se ajustaron 3 de cada tipo a pH 5, pH 6 o pH 8 con HCl o NaOH según fuera apropiado, y las tres restantes se dejaron a pH 7. Se rellenaron todas las muestras hasta 1,1 ml con agua. Se incubaron dos muestras de pH 7 de cada tipo a 35ºC o 45ºC, y se incubaron todas las muestras restantes a 25ºC. Se efectuaron ensayos de tiol libre en el rHA-DTPA de partida y rHA-DTPA-Gd y entonces en cada una de las incubaciones a los tiempos indicados. Los resultados (Figura 5) indicaban que el tiol libre en ambas muestras podía recuperarse mediante incubación simple, aunque la velocidad de recuperación era mucho mayor con rHA-DTPA-Gd que con rHA-DTPA. Ambas reacciones mostraron cierta dependencia del pH, aunque aumentar la temperatura fue más eficaz para aumentar la velocidad de reacción. Se consiguió una recuperación máxima (equivalente a aproximadamente un 80% de tiol libre de partida) a 45ºC en aproximadamente 2 h para rHA-DTPA-Gd y 20 h para rHA-DTPA.

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Ejemplo 6

Reacción de reticulante con derivados de rHA solubles

En la metodología según la invención, el resto orientador y la molécula portadora contienen cada uno distintos grupos químicos para reacción de reticulación selectiva para producir un producto bien definido. Para el caso particular de un resto orientador anticuerpo y una molécula portadora rHA, estos grupos son preferiblemente carbohidrato y tiol libre, respectivamente. Este procedimiento describe la reacción de rHA-DTPA y rHA-DTPA-Gd con dos reticulantes, PDPH y EMCH, adecuados para uso con estos grupos.

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6.1 Síntesis de rHA-DTPA

Se diluyeron 0,3 g de rHA (nivel de tiol libre 0,67 mol.mol^{-1} de rHA) a 12 ml con agua y se añadió 1 g de DTPAa durante \approx 30 min con agitación constante, manteniéndose el pH lo más cercano posible a pH 8 mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitó la disolución durante \approx 30 min después de la adición final, se ajustó a pH 7 con HCl 3 M y se aplicó a una columna de medio Sephadex G50 (1,6\times37 cm) equilibrada con NaCl al 0,9% (p/v). Se efectuó la elución a 2,84 ml.min^{-1} con detección a 254 nm. Se recogió el pico de rHA-DTPA de 2 a 9 min después del inicio de la elución y mostró un nivel de tiol libre de 0,07 mol.mol^{-1} de rHA. Se incubó el rHA-DTPA durante 20 h a 45ºC para desbloquear el tiol, proporcionando un nivel de tiol libre de 0,57 mol.mol^{-1} de rHA.

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6.2 Síntesis de rHA-DTPA-Gd

Se convirtieron 0,3 g de rHA (nivel de tiol libre 0,70 mol.mol^{-1} de rHA) en rHA-DTPA como anteriormente, excepto porque a) se añadió DTPAa durante \approx 35 min; b) la columna de Sephadex G50 se eluyó a 2,7 ml.min^{-1}; c) se recogió el pico de rHA-DTPA de 2 a 10 min después del inicio de la elución y mostró un nivel de tiol libre de 0,14 mol.mol^{-1} de rHA. Se retiró 1 ml de rHA-DTPA y se añadieron 60 \mul de XO al 0,1% (p/v) al resto. Se valoraron los grupos DTPA con GdCl_{3} 0,1 M, manteniéndose el pH a entre pH 5,5 y pH 6,0 con NaOH 1 M hasta el punto final (\equiv 48 mol Gd^{3+}.mol^{-1} de rHA). Se añadieron 0,3 ml de rHA-DTPA retenido para unir el exceso de Gd^{3+}, se ajustó la disolución a pH 7 con NaOH 1 M y se incubó entonces durante 2 h a 45ºC para desbloquear el tiol, proporcionando un nivel de tiol libre de 0,51 mol.mol^{-1} de rHA.

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6.3 Reacción con PDPH

Se mezclaron 2 ml de rHA-DTPA con 0,15 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M y 0,05 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M. Se tomó una muestra de 1 ml y se midió su absorbancia a 343 nm inmediatamente antes de la adición de 0,1 ml de PDPH 10 mM (Pierce) y cada 2 min después de ello durante 20 min. Se corrigieron las medidas por la absorbancia de la PDPH misma y se calculó la extensión de la reacción usando un coeficiente de extinción de 8.080 M^{-1}.cm^{-1} para la 2-tiopiridina liberada. Se repitió el experimento con rHA-DTPA-Gd. Los resultados indicaban que la reacción con PDPH era tanto rápida como eficaz en ambos casos, siendo un 96-98% completa en el primer punto temporal de 2 min, siendo la extensión final de la reacción \approx 90% de la medida mediante el ensayo de tiol libre.

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6.4 Reacción con EMCH

Se mezclaron 4 ml de rHA-DTPA-Gd con 0,3 ml de Na_{2}HPO_{4} 0,2 M y se añadieron 0,1 ml de NaH_{2}PO_{4} 0,2 M y 0,44 ml de EMCH 10 mM (Pierce). Se tomaron muestras de 1 ml a 15, 30, 60 y 120 min después de la adición y se aplicaron inmediatamente a una columna PD10 equilibrada con fosfato de sodio 50 mM a pH 7 para retirar la EMCH en exceso. Se recogió la fracción de alto peso molecular de 1,5 a 3,5 ml después del inicio de la elución. Se sometieron los eluatos al ensayo de tiol libre, tanto directamente como adicionados con una cantidad constante de DTT (para evaluar la retirada de EMCH) y al ensayo de proteína (para evaluar la recuperación de rHA). Las recuperaciones medidas estaban en el intervalo de 98-104% para DTT y de 102-104% para rHA, confirmando la completa eliminación de EMCH y recuperación de rHA. Los resultados del ensayo de tiol libre directo indicaban que la reacción con EMCH era tanto rápida como eficaz, reduciéndose el nivel de tiol libre a 0,02 mol.mol^{-1} de rHA en el primer punto temporal a 15 min.

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Ejemplo 7

Reacción de reticulante con anticuerpos

Este ejemplo describe la reacción de los dos anticuerpos \alphaCD45 y C595 con el reticulante PDPH.

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7.1 Reacción de \alphaCD45 con PDPH

Se añadió 1 ml de \alphaCD45 (Serotec MCA43G; concentración de IgG 1,0 mg.ml^{-1}) a 2,3 mg de KIO_{4} y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se aplicó la disolución a una columna PD10 equilibrada con PBS y se recogió la fracción de alto peso molecular de 1,5 a 3,5 ml después del inicio de la elución. Se concentró el eluato a un volumen final de 1 ml usando un concentrador centrífugo Nanosep 10K Omega (Pall) prelavado con PBS, se añadió a 1,0 mg de PDPH y se mezcló durante 21 h a temperatura ambiente. Se purificó el \alphaCD45-PDPH usando una columna PD10 y se reconcentró el eluato a 1 ml como anteriormente, dando una recuperación global de IgG de un 90%. Se determinó la extensión de la reacción a partir de la 2-tiopiridina liberada por la reducción de la PDPH unida, mediante medida de la absorbancia a 343 nm inmediatamente antes de la adición de 10 \mul de DTT 10 mM y cada min después de ello durante 15 min, usando un coeficiente de extinción de 8.080M^{-1}.cm^{-1}. Los resultados (Figura 6) indicaban que el PDPH reaccionaba exitosamente con \alphaCD45, dando una estequiometría de 2,3 mol de PDPH.mol^{-1} de IgG. La GP-HPLC analítica (inyección de 50 \mul con longitud de onda de detección de 280 nm) indicaba que el \alphaCD45-PDPH resultante retenía una alta pureza monomérica, con un tiempo de elución de pico de \approx 8,4 min.

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7.2 Reacción de C595 con PDPH

Se diluyeron 0,35 ml de C595 (obtenido de la Universidad de Nottingham; concentración de IgG 3,2 mg.ml^{-1}) con 0,65 ml de PBS, se añadieron a 2,4 mg de KIO_{4} y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se aplicó la disolución a una columna PDE10 equilibrada con PBS y se recogió la fracción a alto peso molecular de 1,5 a 3,5 ml después del inicio de la elución. Se concentró el eluato a un volumen final de 1 ml, usando un concentrador centrífugo Nanosep 10K Omega prelavado con PBS, se añadió a 1,0 mg de PDPH y se mezcló durante 19 h a temperatura ambiente. Se purificó el C595-PDPH usando una columna PD10 y se reconcentró el eluato a 1 ml como anteriormente, dando una recuperación de IgG global de un 85%. Se determinó la extensión de la reacción a partir de la 2-tiopiridina liberada con la reducción de la PDPH unida, mediante medida de la absorbancia a 343 nm inmediatamente antes de la adición de 10 \mul de DTT 10 mM y cada min después de ello durante 15 min, usando un coeficiente de extinción de 8080 M^{-1}.cm^{-1}. Los resultados (Figura 7) indicaban que PDPH reaccionaba exitosamente con C595, dando una estequiometría de 2,5 mol de PDPH.mol^{-1} de IgG. La GP-HPLC analítica (50 \mul de inyección con longitud de onda de detección de 280 nm) indicaba que el C595-PDPH resultante retenía una alta pureza monomérica, con un tiempo de elución de pico de \approx 8,5 min.

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Ejemplo 8

Purificación de rHA-DTPA/rHA-DTPA-Gd

El conjugado del resto orientador y la molécula portadora será claramente mayor que cualquiera de los componentes individuales y por tanto la purificación del conjugado de cualquiera de los componentes individuales no reaccionados se podrá conseguir mediante cromatografía de exclusión molecular. Para el caso particular de una molécula portadora rHA, la tendencia de la albúmina humana a formar dímeros y oligómeros superiores podría comprometer la purificación exitosa del conjugado orientado de las moléculas portadoras no orientadas. Este procedimiento describe la purificación de rHA-DTPA monomérico y rHA-DTPA-Gd antes de la reacción con el resto orientador, para simplificar la purificación posterior del conjugado.

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8.1 GP-HPLC preparativa

La purificación de derivados de rHA usaba un gran volumen de inyección (200 \mul) para dar una alta productividad, y una longitud de onda de detección subóptima (254 nm) para reducir la absorbancia de pico a alta concentración de rHA.

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8.2 Purificación de rHA-DTPA

Se caracterizó la GP-HPLC preparativa de rHA-DTPA por un pico dimérico a \approx 6,6 min y un pico monomérico a \approx 7,6 min. Para la purificación de rHA-DTPA monomérico, se recogió material que eluía entre 7,2 y 9,0 min. La GP-HPLC analítica (50 \mul de inyección con longitud de onda de detección de 280 nm) del material recogido confirmaba que se había conseguido un alto grado de pureza monomérica mediante este procedimiento.

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8.3 Purificación de rHA-DTPA-Gd

Se caracterizó la GP-HPLC preparativa de rHA-DTPA-Gd por un pico dimérico a \approx 6,9 min y un pico monomérico a \approx 8,1 min. Para la purificación del rHA-DTPA monomérico, se recogió material que eluía entre 7,7 y 9,0 min. La GP-HPLC analítica (100 \mul de inyección con longitud de onda de detección de 254 nm) del material recogido confirmaba que se había conseguido un alto grado de pureza monomérica mediante este procedimiento.

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Ejemplo 9

Preparación de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd

Basándose en los desarrollos anteriores de etapas individuales en la síntesis (ejemplos 1-8), este procedimiento describe la preparación completa de un agente orientado en el que la molécula portadora (rHA) está marcada a altos niveles con DTPA seguido de Gd, volviéndolo adecuado para uso como un agente de contraste de IRM.

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9.1 Síntesis de rHA-DTPA

Se diluyeron 0,3 g de rHA (nivel de tiol libre de 0,70 mol.mol^{-1} de rHA) a 12 ml en agua y se añadió 1 g de DTPAa durante \approx 35 min con agitación constante, manteniendo el pH lo más cercano posible a pH 8 mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitó la disolución durante 30 min después de la adición final, se ajustó a pH 7 con HCl 3 M y se aplicó a una columna de medio Sephadex G50 (1,6\times37 cm) equilibrada con NaCl al 0,9% (p/v). Se efectuó la elución a 2,7 ml.min^{-1} con detección a 254 nm. Se recogió el pico de rHA-DTPA de 2 a 10 min después del inicio de la elución, y mostró un nivel de tiol libre de 0,14 mol.mol^{-1} de rHA.

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9.2 Síntesis de rHA-DTPA-Gd

Se retiró 1 ml de rHA-DTPA y se añadieron 60 \mul de XO al 0,1% (p/v) al resto. Se valoraron los grupos DTPA con GdCl_{3} 0,1 M, manteniendo el pH a entre pH 5,5 y pH 6,0 con NaOH 1 M, hasta el punto final (\equiv 48 mol de Gd^{3+}.mol^{-1} de rHA), indicado por el primer cambio de amarillo a púrpura. Se añadieron 0,3 ml de rHA-DTPA retenido para unir el exceso de Gd^{3+}, devolviendo el color a amarillo, se ajustó la disolución a pH 7 con NaOH 1 M y se incubó entonces durante 2 h a 45ºC para desbloquear el tiol, proporcionando un nivel de tiol libre de 0,51 mol.mol^{-1} de rHA.

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9.3 Síntesis de \alphaCD45-PDPH

Se añadió 1 ml de \alphaCD45 a 2,3 mg de KIO_{4} y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se aplicó la disolución a una columna PD10 equilibrada con PBS y se recogió la fracción de alto peso molecular de 1,5 a 3,5 ml después del inicio de la elución. Se concentró el eluato a un volumen final de 1 ml, usando un concentrador centrífugo Nanosep 10K Omega prelavado con PBS, se añadió a 1,1 mg de PDPH y se mezcló durante 5 h a temperatura ambiente. Se purificó el \alphaCD45-PDPH usando una columna PD10, procesada como anteriormente.

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9.4 Purificación de rHA-DTPA-Gd

Se purificó rHA-DTPA-Gd monomérico mediante GP-HPLC preparativa usando una inyección de 200 \mul con detección a 254 nm. Se efectuaron 8 ciclos de cromatografía, con recogida de producto de 7,7-9,0 min después de la inyección. La concentración de rHA del producto era de 1,1 g.l^{-1}. Se confirmó la alta pureza monomérica del producto mediante GP-HPLC analítica usando una inyección de 50 \mul con detección a 280 nm.

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9.5 Síntesis de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd

Se añadió rHA-DTPA-Gd purificado a \alphaCD45-PDPH a \approx 10 mol de rHA.mol^{-1} de IgG, se concentró la disolución a 1 ml usando un concentrador centrífugo Vivaspin20 10K (Sartorius) prelavado con PBS y se mezcló durante 24 h a temperatura ambiente. Se confirmó la formación de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd mediante la aparición de un nuevo pico de alto peso molecular en GP-HPLC analítica usando una inyección de 20 \mul con detección a 280 nm. Una supuesta estequiometría de rHA:\alphaCD45 de 2,3 (como se mide en el ejemplo 7 para PDPH:\alphaCD45) junto con la estequiometría medida de Gd^{3+}:rHA de 48 da un

\hbox{nivel de Gd predicho para  este
complejo de  \approx  10 mol de Gd ^{3+} .mol ^{-1}  de
IgG.}

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9.6 Purificación de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd

Se purificó \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd mediante GP-HPLC preparativa como anteriormente, pero usando 10 inyecciones de \approx 95 \mul, detección a 280 nm y recogida de producto de 6,0-7,2 min. Se concentró el producto a 1 ml usando dos concentradores centrífugos Nanosep 10K Omega y se confirmó la pureza mediante GP-HPLC analítica usando una inyección de 50 \mul con detección a 280 nm. Finalmente, se congeló el producto a alícuotas de \approx 150 \mul en un baño a -30ºC y se almacenaron a -20ºC.

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9.7 Actividad de unión a anticuerpo

Se midió la actividad de anticuerpo de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd usando esplenocitos de rata, que expresan el antígeno común de leucocitos CD45, en un ensayo de unión competitiva frente a \alphaCD45 marcado con fluoróforo. Se midió la intensidad fluorescente de las células mediante citometría de flujo, usando un anticuerpo fluorescente constante de 0,2 \mug y cantidades crecientes de \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd. Se ensayó de forma similar el \alphaCD45 no marcado como control positivo. Los resultados (Figura 8) indicaban que el \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd era capaz de desplazar al anticuerpo fluorescente de la misma manera que el \alphaCD45 no marcado, demostrando que el conjugado retenía actividad de unión a anticuerpo.

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9.8 Propiedades de resonancia magnética

El \alphaCD45-PDPH-rHA-DTPA-Gd daba tiempos de relajación T1 y T2 a 2 teslas de 92 y 95 ms, respectivamente. Esto era aproximadamente 2 veces mejor que Omniscan^{TM}0,5 mM (un agente de contraste de IRM basado en gadolinio no orientado de Amersham) que, medido simultáneamente, daba valores de 193 y 177 ms, indicando una excelente potenciación de la relajación para el conjugado.

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Ejemplo 10

Preparación de C595-PDPH-rHA-DTPA

Este procedimiento describe la preparación de un agente orientado, en el que la molécula portadora (rHA) está marcada a altos niveles con DTPA pero no con ión metálico, haciéndolo adecuado para carga con un metal radiactivo apropiado para uso como agente de formación de imágenes de tipo nuclear o terapéutico orientado.

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10.1 Síntesis de rHA-DTPA

Se diluyeron 0,3 g de rHA (nivel de tiol libre de 0,67 mol.mol^{-1} de rHA) a 12 ml en agua y se añadió 1 g de DTPAa durante \approx 30 min con agitación constante, manteniéndose el pH lo más cercano posible a pH 8 mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitó la disolución durante 30 min después de la adición final, se ajustó a pH 7 con HCl 3 M y se aplicó a una columna de medio Sephadex G50 (1,6\times37 cm) equilibrada con NaCl al 0,9% (p/v). Se efectuó la elución a 2,84 ml.min^{-1} con detección a 254 nm. Se recogió el pico de rHA-DTPA de 2 a 9 min después del inicio de la elución y mostró un nivel de tiol libre de 0,07 mol.mol^{-1} de rHA. Se incubó el rHA-DTPA durante 20 h a 45ºC para desbloquear el tiol, proporcionando un nivel de tiol libre de 0,57 mol.mol^{-1} de rHA. El nivel de DTPA, determinado en una alícuota de 4 ml de este material mediante valoración complexométrica con GdCl_{3} como anteriormente, era de 44 mol.mol^{-1} de rHA.

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10.2 Síntesis de C595-PDPH

Se diluyó C595 (obtenido de la Universidad de Nottingham; concentración de IgG 3,2 mg.ml^{-1}) a 1,0 mg.ml^{-1} de IgG en PBS, se añadió 1 ml a 2,3 mg de KlO_{4} y se mezcló durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad. Se aplicó la disolución a una columna PD10 equilibrada con PBS y se recogió la fracción de alto peso molecular de 1,5 a 3,5 ml después del inicio de la elución. Se concentró el eluato a un volumen final de 1 ml usando un concentrador centrífugo Nanosep 10K Omega prelavado con PBS, se añadió a 1,1 mg de PDPH y se mezcló durante 5 h a temperatura ambiente. Se purificó el C595-PDPH usando una columna PD10, procesada como anteriormente.

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10.3 Purificación de rHA-DTPA

Se purificó rHA-DTPA monomérico mediante GP-HPLC preparativa usando una inyección de 200 \mul en una columna y carcasa TSKgel G3000SWXL de 0,78x30 cm, eluída a 1 ml.min^{-1} en PBS con detección a 254 nm. Se efectuaron 6 ciclos de cromatografía, con recogida de producto de 7,2-9,0 min después de la inyección. La concentración de rHA del producto era de 1,0 g.l^{-1}. Se confirmó la alta pureza monomérica del producto mediante GP-HPLC analítica, efectuada como la GP-HPLC

\hbox{preparativa anterior pero usando
una inyección de 50  \mu l con detección  a 280 nm.}

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10.4 Síntesis de C595-PDPH-rHA-DTPA

Se añadió rHA-DTPA purificado a C595-PDPH a \approx 10 mol rHA.mol^{-1} de IgG, se concentró la disolución a 1 ml usando un concentrador centrífugo Vivaspin20 10K prelavado con PBS y se mezcló durante 18 h a temperatura ambiente. Se confirmó la formación de C595-PDPH-rHA-DTPA mediante la aparición de un nuevo pico de alto peso molecular en GP-HPLC analítica usando una inyección de 20 \mul con detección a 280 nm. Una supuesta estequiometría de rHA:C595 de 2,5 (como se mide en el ejemplo 7 para PDPH:C595) junto con la estequiometría de Gd^{3+}:rHA medida de 44 da un nivel de Gd predicho para este complejo de \approx 110 mol de Gd^{3+}.mol^{-1} de IgG.

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10.5 Purificación de C595-PDPH-rHA-DTPA

Se purificó C595-PDPH-rHA-DTPA mediante GP-HPLC preparativa como anteriormente pero usando 10 inyecciones de \approx 95 \mul, detección a 280 nm y recogida de producto de 5,7-6,6 min. Se concentró el producto a 1 ml usando dos concentradores centrífugos Nanosep 10K Omega y se confirmó la pureza mediante GP-HPLC analítica usando una inyección de 50 \mul con detección a 280 nm. Finalmente, se congeló el producto en alícuotas de \approx 115 \mul en un baño a -30ºC y se almacenó a -20ºC.

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Ejemplo 11

Preparación de partículas de rHA marcadas con agente de contraste de IRM (quelato de gadolinio) 11.1 Procedimientos 11.1.1 Preparación de partículas de rHA

Se produjo un lote de partículas de rHA mediante secado por pulverización de una suspensión de rHA como sigue:

Se dializaron 200 ml de rHA al 25% (p/v) frente a 5 l de agua purificada exenta de pirógenos a temperatura ambiente para retirar el cloruro de sodio en exceso, dando un volumen final de 320 ml. Se ajustaron 52 ml de proteína dializada a pH 8,0 con NaOH 1 M y se añadió lentamente etanol con mezclado constante con un agitador magnético hasta que se formó una suspensión lechosa (80 ml de etanol). Se secó por pulverización la suspensión agitada continuamente usando un Buchi Mini Spray Dryer (modelo B-191), equipado con tobera de atomización de 2 fluidos Schlick (modelo 970/0), en las siguientes condiciones:

temperatura de entrada 100ºC

temperatura de salida 67ºC

velocidad de alimentación 3 ml.min^{-1}

presión de atomización 600 kPa.

Se recuperaron las micropartículas resultantes (4,0 g) del recipiente de recogida del ciclón, se fijaron térmicamente a 176ºC durante 55 min para volverlas insolubles (proporcionando 3,5 g), se mezclaron con 7,0 g de manitol y se desaglomeraron usando un molino de chorro Attritor 6in con una presión de entrada de 500 kPa y una presión de molienda de 300 kPa.

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11.1.2 Conjugación con DTPAa

Se humedecieron las partículas formuladas con etanol y se lavaron concienzudamente con agua mediante centrifugación (Sorvall RT6000) para retirar el excipiente manitol. Después de lavar, se tomó una alícuota para la determinación del peso seco y se diluyeron las partículas de rHA a 20 g.l^{-1} (basado en esta medida) en agua. Se añadió lentamente DTPAa (1 g por 0,3 g de partículas) con agitación constante durante un periodo \approx 25 min. Durante este tiempo, se añadió NaOH 5 M para mantener el pH tan cercano a 8,0 como fuera posible. Se continuó la agitación durante 30 min después de la adición final de DTPAa y se ajustó entonces el pH a 7,0 con HCl 5 M. Se lavaron dos veces las partículas de rHA-DTPA con NaCl al 0,9% (p/v) y dos veces con agua mediante centrifugación y resuspensión a 8 g.l^{-1} (basado en el peso seco inicial) y se resuspendieron finalmente a 60 g.l^{-1}.

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11.1.3 Marcaje con Gd

Se midió el peso seco de la suspensión de partículas de rHA-DTPA para determinar el aumento de masa debido al marcaje de DTPA, dando un valor de 32,4 mol.mol^{-1} de rHA. Para el marcaje con Gd, se diluyó una alícuota adicional de la suspensión con agua y se añadió GdCl_{3} 0,1 M con agitación constante, dando una dilución global de 2,5 veces y una concentración final de Gd igual al nivel de DTPA determinado mediante medida del peso seco. Se continuó la agitación durante 10 min, se diluyó la suspensión 1,5 veces más con agua, se sedimentaron las partículas de rHA-Gd mediante centrifugación y se resuspendió el sedimento en agua a 60 g.l^{-1} (basado en el peso seco inicial). Se formuló la suspensión resultante a 50 g.l^{-1} en manitol al 5% (p/v) y se liofilizó.

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11.2 Caracterización de partículas 11.2.1 Propiedades de resonancia magnética de las partículas

Se efectuó la formación de imágenes por resonancia magnética en partículas marcadas con Gd-DTPA. Se diluyeron apropiadamente las partículas y el control Magnevist^{TM}a 2 ml con agua, y se mezclaron entonces con 8 ml de agarosa al 0,5%, dando la concentración de Gd específica. Se determinaron las velocidades de relajación (R1 y R2) para cada muestra, como se describe en el ejemplo 1.

Se compararon las propiedades de IRM in vitro de las partículas de rHA-Gd frente a aquellas de Magnevist^{TM}, un agente de contraste de IRM comercial basado en Gd-DTPA. Las velocidades de relajación con rHA-Gd en partículas (Figura 9) eran equivalentes (para R1) o significativamente mayores (para R2) a las obtenidas con Magnevist^{TM}. Esto indicaba que las partículas de rHA-Gd deberían producir imágenes in vivo equivalentes o mejores a las observadas con Magnevist^{TM}a la misma concentración de Gd, particularmente a la vista de la marcada reducción de la velocidad de eliminación prevista para el material en partículas. Como alternativa, se sugiere que las partículas podrían usarse a una dosis de Gd menor que Magnevist^{TM}.

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11.2.2 Análisis de distribución de tamaño

Se emprendieron análisis de tamaño Coulter para determinar si el procedimiento de marcaje había conducido a niveles significativos de aglomeración. Los resultados mostrados en la Figura 10 confirman que la distribución del tamaño (después de marcaje con Gd-DTPA) no había cambiado significativamente.

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11.2.3 Propiedades de resuspensión

La microscopía óptica (Figura 11) confirmaba que las partículas marcadas con Gd-DTPA no estaban aglomeradas y se resuspendían dando una suspensión adecuada.

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Ejemplo 12

Marcaje de rHA soluble con un agente de contraste de IRM y preparación posterior de partículas

Este ejemplo ilustra una variación de la metodología de la invención en la que las partículas se forman a partir de moléculas de rHA solubles que se han marcado anteriormente con un quelato de Gd.

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12.1 Procedimientos

Se diluyó una alícuota de 1,5 g de rHA a 20 g.l^{-1} en agua y se trató con 5 g de DTPAa, añadidos lentamente con agitación constante durante un periodo de aproximadamente 40 min. Durante este tiempo, se añadió NaOH 5 M para mantener el pH tan cercano a 8,0 como fuera posible. Se continuó la agitación durante 30 min después de la adición final de DTPAa y se ajustó entonces el pH a 7,0 con HCl 5 M.

Se dializó la muestra marcada (+DTPA) frente a 10,5 l de agua, se cambió después de 5 h, para un total de 21 h. Para estimar la adición de Gd necesaria, se valoró una alícuota de 5 ml de la muestra de +DTPA con GdCl_{3} 1 M hasta el primer velo permanente. Basándose en esto, el nivel de DTPA obtenido con la rHA soluble fue de 47 mol.mol^{-1}. Se retiró una alícuota adicional de 5 ml de la muestra de +DTPA, se valoró la muestra restante con GdCl_{3} 1 M hasta el primer velo permanente y se volvió a añadir la alícuota no valorada para unir cualquier exceso de Gd.

Se filtró entonces la muestra marcada con Gd por 0,2 \mum para retirar cualquier material insoluble residual. Se secaron por pulverización las muestras usando un secador pulverizador Buchi con tobera de dos fluidos Schlick a una temperatura de entrada de 110ºC, una presión de atomización de 50 kPa y una velocidad de alimentación de 3,5 ml.min^{-1}, dando una temperatura de salida de aproximadamente 79ºC. Se pesó la muestra recogida, para calcular la recuperación, y se fijó entonces térmicamente durante un total de 5,5 horas a 175ºC.

En ausencia de marcaje de DTPA, las partículas de rHA son insolubles después de 55 minutos a 175ºC. Sin embargo, este no era el caso con la muestra marcada con Gd y se requirió una fijación adicional para conseguir la insolubilidad del material.

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Ejemplo 13

Contenido de tiol libre de rHA en partículas

Para uso como agente orientador, es importante que las partículas contengan un grupo reactivo adecuado para acoplamiento químico del resto orientador. En el caso de rHA como material formador de partícula, el tiol libre en cys34 es un grupo altamente adecuado con este fin. Este procedimiento describe la medida del contenido de tiol libre de partículas de rHA, para confirmar que sigue disponible para reacción a pesar de la fijación térmica a alta temperatura usada para volver insolubles las partículas.

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13.1 Preparación de partículas de rHA

Se dializaron 100 ml de rHA al 25% (p/v) durante una noche a temperatura ambiente frente a 20 l de agua, y se determinó la concentración de proteína resultante mediante medida de la absorbancia a 280 nm, usando un coeficiente de extinción a 1 g.l^{-1} de 0,53. Se diluyó la proteína dializada (24,4 g) con agua al 12,5% (p/v) y se ajustó a pH 8,0 con NaOH. Se añadieron 275 ml de etanol y se secó por pulverización la suspensión resultante con una temperatura de entrada de 100ºC, temperatura de salida de 72ºC, caudal de 3 ml.min^{-1} y una presión de atomización de 600 kPa. Se fijaron térmicamente las micropartículas resultantes (13,4 g) a 175ºC durante 1 h (proporcionando 11,1 g), se mezclaron con 22,2 g de manitol y se pasaron dos veces a través de un molino de chorro con una presión de entrada de 500 kPa y una presión de molienda de 300 kPa.

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13.2 Ensayo de tiol libre

Se determinó la concentración de tiol libre mediante reacción con DTNB a pH 7 y medida de absorbancia a 412 nm, usando un coeficiente de extinción de 13.600 M^{-1}.cm^{-1} para el 5-tio-2-nitrobenzoato liberado. Se efectuó la reacción durante 1 h a temperatura ambiente y se sedimentaron las partículas mediante centrifugación antes de la medida de absorbancia en el sobrenadante. Se hizo la corrección tanto para la absorbancia del DTNB como para la turbidez residual de las partículas no sedimentadas. El nivel de tiol libre medido fue de 0,36 mol.mol^{-1} de rHA, confirmando que el tiol libre no se destruía completamente por la etapa de fijación térmica y estaba presente a un nivel adecuado para el acoplamiento de un resto orientador.

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Ejemplo 14

Optimización de la carga de partículas

Para un efecto máximo, es importante en muchos casos que la partícula porte la carga máxima de agente, por ejemplo Gd^{3+} para uso en IRM, o metal radiactivo para uso en la formación de imágenes o terapia de tipo nuclear. Este procedimiento describe la optimización de la capacidad de unión de Gd^{3+} por partículas de rHA.

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14.1 Síntesis de partículas de rHA marcadas con DTPA

Se suspenden alícuotas de partículas de rHA en agua y se añaden cantidades variables de DTPAa (que cubren el intervalo \approx 0,5-5 g.g^{-1} de rHA) a cada una durante \approx 10-40 min con agitación constante, manteniendo el pH lo más cercano posible a pH mediante la adición de NaOH 5 M. Se agitan las suspensiones durante \approx 30 min después de la adición final y se ajustan a pH 7 con HCl 3 M. Se lavan concienzudamente todas las muestras mediante centrifugación y resuspensión para retirar el DTPA no unido.

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14.2 Medida de la capacidad de unión de Gd^{3+}

Se determina la capacidad de unión de Gd^{3+} mediante valoración complexométrica con indicador XO. Se controla el pH en el intervalo de pH 5,0-6,5 durante la valoración mediante el uso de un tampón apropiado (por ejemplo, hexamina) o mediante el ajuste con una base apropiada (por ejemplo, NaOH). Se añade XO a una suspensión que contiene una cantidad conocida de partículas de rHA marcadas con DTPA y se efectúa la valoración con una disolución estandarizada de GdCl_{3} hasta el primer cambio permanente de color.

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Ejemplo 15

Desarrollo de condiciones para la recuperación de tiol libre en derivados de rHA en partículas

Los resultados con rHA soluble (véase el ejemplo 4) indican que el tiol libre de rHA está bloqueado en gran medida por la reacción con DTPAa. Si este tiol va a usarse como sitio de unión de reticulante, es necesaria la recuperación del tiol libre de rHA para una reacción eficaz con el reticulante. Este procedimiento describe el desarrollo de condiciones para conseguir este objetivo, siguiendo la reacción de partículas de rHA con DTPAa (partículas de rHA marcadas con DTPA) o siguiendo la unión de Gd^{3+} (partículas de rHA marcadas con Gd).

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15.1 Síntesis de partículas de rHA marcadas

Se producen partículas de rHA marcadas con DTPA esencialmente como se describe en el ejemplo 11. Las partículas de rHA marcadas con Gd pueden producirse a partir de partículas de rHA marcadas con DTPA esencialmente como se describe en el ejemplo 11. Como alternativa, pueden producirse usando valoración complexométrica con GdCl_{3} en presencia de XO, como se describe en el ejemplo 14, con una pequeña adición adicional de partículas de rHA marcadas con DTPA al final de la valoración para unir el exceso de Gd^{3+}.

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15.2 Recuperación de tiol libre

Se incuban alícuotas tanto de partículas rHA marcadas con DTPA como marcadas con Gd a un intervalo de valores de pH y/o un intervalo de temperaturas y se toman muestras al inicio de la incubación y periódicamente después de ello. Se someten éstas al ensayo de tiol libre para determinar las condiciones óptimas de recuperación del tiol libre con cada tipo de partícula.

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Ejemplo 16

Reacción de reticulante con derivados de rHA en partículas

En la metodología según la invención, el resto orientador y la partícula contienen cada uno un grupo químico único para que la reacción con reticulante produzca un producto bien definido. Para el caso particular de un resto orientador anticuerpo y una partícula de rHA, estos grupos son carbohidrato y tiol libre, respectivamente. Este procedimiento describe la reacción de partículas de rHA marcadas con DTPA y partículas de rHA marcadas con Gd con dos reticulantes, PDPH y EMCH, adecuados para uso con estos grupos.

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16.1 Síntesis de partículas de rHA marcadas

Se sintetizan tanto partículas de rHA marcadas con DTPA como marcadas con Gd esencialmente como se describe en el ejemplo 15, y se desbloquea el tiol libre usando las condiciones óptimas determinadas en ese ejemplo.

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16.2 Reacción con PDPH

Se tamponan aproximadamente a pH 7 alícuotas de ambos tipos de partículas de rHA marcadas mediante la adición de tampón fosfato. Se toman muestras inmediatamente antes de la adición de PDPH a un exceso molar significativo frente a los grupos tiol libre disponibles, y periódicamente después de ello. Se centrifugan inmediatamente las muestras y se mide la absorbancia del sobrenadante a 343 nm. Se corrigen las medidas tanto por la absorbancia de la PDPH misma como por la turbidez residual de partículas no sedimentadas y se calcula la extensión de la reacción usando un coeficiente de extinción de 8.080 M^{-1}.cm^{-1} para la 2-tiopiridina liberada. Se usan estos datos para determinar las condiciones de reacción óptimas para acoplar PDPH con cada tipo de partícula.

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16.3 Reacción con EMCH

Se tamponan aproximadamente a pH 7 alícuotas de ambos tipos de partículas de rHA marcadas mediante la adición de tampón fosfato. Se toman muestras inmediatamente antes de la adición de EMCH a un exceso molar significativo frente a los grupos tiol libre disponibles, y periódicamente después de ello. Se centrifugan inmediatamente las muestras y se lavan concienzudamente los sedimentos para retirar la EMCH en exceso antes del ensayo de tiol libre. Se usan estos datos para determinar las condiciones de reacción óptimas para acoplar EMCH con cada tipo de partícula.

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Ejemplo 17

Preparación de partículas de anticuerpo/rHA marcada con Gd

Basándose en los desarrollos anteriores de etapas individuales de síntesis (ejemplos 11-16), este procedimiento describe la preparación de un agente orientado en la que la partícula (rHA) se marca a altos niveles con DTPA, seguido de Gd, y se acopla entonces con un anticuerpo, haciéndola adecuada para uso como agente de contraste de IRM orientado.

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17.1 Síntesis de partículas de rHA marcadas con Gd con y sin reticulante

Se sintetizan partículas de rHA marcadas con Gd y partículas de rHA marcadas con Gd + reticulante (PDPH o EMCH) esencialmente como se describe en el ejemplo 16. Se lavan entonces concienzudamente las partículas mediante centrifugación y resuspensión para retirar los reactivos en exceso.

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17.2 Síntesis de anticuerpo oxidado con peryodato con y sin reticulante

Se sintetiza anticuerpo oxidado con peryodato mediante la incubación del anticuerpo con KlO_{4}, cromatografía PD10 y concentración centrífuga, esencialmente como se describe en el ejemplo 7. El acoplamiento del reticulante PDPH con el anticuerpo oxidado con reticulante y posterior cromatografía PD10 y concentración centrífuga se efectúan también sustancialmente como se describe en el ejemplo 7. El acoplamiento de reticulante EMCH puede efectuarse de forma similar.

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17.3 Síntesis de partículas de anticuerpo/rHA marcada con Gd

Pueden producirse partículas de anticuerpo/rHA marcada con Gd mediante la incubación de una cualquiera de las siguientes tres combinaciones de reactivos.

1.: (partículas de rHA marcadas con Gd + reticulante) + (anticuerpo oxidado con peryodato)

2.: (partículas de rHA marcadas con Gd) + (anticuerpo oxidado con peryodato + reticulante)

3.: (partículas de rHA marcadas con Gd) + (anticuerpo oxidado con peryodato) + (reticulante).

Cualquiera que sea la ruta sintética que se use, se lavan concienzudamente las partículas resultantes mediante centrifugación y resuspensión para retirar los reactivos en exceso.

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Ejemplo 18

Preparación de partículas de anticuerpo/rHA marcada con DTPA

Este procedimiento describe la preparación de un agente orientado, en el que la partícula (rHA) se marca a altos niveles con DTPA pero no con ión metálico y se acopla entonces con un anticuerpo, haciéndola adecuada para carga con un metal radiactivo apropiado para uso como agente de formación de imágenes de tipo nuclear o terapéutico orientado.

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18.1 Síntesis de partículas de rHA marcadas con DTPA con y sin reticulante

Se sintetizan partículas de rHA marcadas con DTPA y partículas de rHA marcadas con DTPA + reticulante (PDPH o EMCH) esencialmente como se describe en el ejemplo 16. Se lavan entonces concienzudamente las partículas mediante centrifugación y resuspensión para retirar los reactivos en exceso.

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18.2 Síntesis de anticuerpo oxidado con peryodato con y sin reticulante

Se sintetiza anticuerpo oxidado con peryodato mediante incubación del anticuerpo con KlO_{4}, cromatografía PD10 y concentración centrífuga, esencialmente como se describe en el ejemplo 7. El acoplamiento de reticulante PDPH con el anticuerpo oxidado con peryodato y posterior cromatografía PD10 y concentración centrífuga se efectúan esencialmente también como se describe en el ejemplo 7. El acoplamiento de reticulante EMCH puede efectuarse de modo similar.

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18.3 Síntesis de partículas de anticuerpo/rHA marcada con Gd

Las partículas de anticuerpo/rHA marcada con DTPA pueden producirse incubando una cualquiera de las siguientes tres combinaciones de reactivos.

1.: (partículas de rHA marcadas con DTPA + reticulante) + (anticuerpo oxidado con peryodato)

2.: (partículas de rHA marcadas con DTPA) + (anticuerpo oxidado con peryodato + reticulante)

3.: (partículas de rHA marcadas con DTPA) + (anticuerpo oxidado con peryodato) + (reticulante).

Claims

1. Un conjugado para uso en la formación de imágenes médicas, comprendiendo dicho conjugado un portador en forma de una molécula proteica o una partícula formada a partir de moléculas proteicas, estando unido el portador a un agente de contraste, o un precursor del mismo, y a un resto orientador que tiene afinidad por una localización específica en el cuerpo, en el que la molécula portadora se acopla con el resto orientador mediante un agente reticulante heterobifuncional que tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes del portador.

2. Un conjugado según la reivindicación 1, que es para uso en la formación de imágenes por resonancia magnéti-
ca.

3. Un conjugado según la reivindicación 2, en el que el agente de contraste comprende iones metálicos paramagnéticos.

4. Un conjugado según la reivindicación 3, en el que los iones metálicos incluyen iones Gd^{3+}.

5. Un conjugado según la reivindicación 3 ó 4, en el que los iones metálicos se acoplan con el portador mediante un resto quelante que está unido covalentemente al portador.

6. Un conjugado según la reivindicación 1, que es para uso en la formación de imágenes de tipo nuclear.

7. Un conjugado según la reivindicación 6, en el que el agente de contraste comprende iones metálicos radiactivos.

8. Un conjugado según la reivindicación 7, en el que el metal radiactivo se selecciona del grupo constituido por ^{99m}Tc, ^{201}Tl y ^{111}In.

9. Un conjugado según la reivindicación 7 u 8, en el que el metal se acopla con el portador mediante un resto quelante que está unido covalentemente al portador.

10. Un conjugado según la reivindicación 5 ó 9, en el que el resto quelante comprende grupos carboxilo, o derivados de los mismos, que reaccionan con grupos amina en el portador formando enlaces amidas.

11. Un conjugado según la reivindicación 10, en el que el resto quelante es un derivado de ácido acético de un compuesto que comprende múltiples grupos amina.

12. Un conjugado según la reivindicación 11, en el que el resto quelante se selecciona del grupo que consiste en ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético y derivados de los mismos.

13. Un conjugado para la administración de un metal al cuerpo, comprendiendo dicho conjugado un portador en forma de una molécula proteica o una partícula formada a partir de moléculas proteicas, estando acoplado el portador mediante un agente quelante con dicho metal y conjugado con un resto orientador que tiene afinidad por una localización específica en el cuerpo, en el que la molécula portadora se acopla con el resto orientador mediante un agente reticulante heterobifuncional que tiene una reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y otra reactividad que es específica de grupos funcionales presentes en el resto orientador y ausentes en el portador.

14. Un conjugado según la reivindicación 5 o una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, en el que se acoplan entre 10 y 100 restos quelantes con cada molécula proteica.

15. Un conjugado según la reivindicación 14, en el que se acoplan entre 20 y 60 restos quelantes con cada molécula proteica.

16. Un conjugado según la reivindicación 1, que es para uso en la formación de imágenes por rayos X.

17. Un conjugado según la reivindicación 16, en el que el agente de contraste es un compuesto de yodo.

18. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que la molécula proteica es una molécula proteica única, completa o sustancialmente completa.

19. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que la molécula proteica es un oligómero de moléculas proteicas conjugadas completas o sustancialmente completas.

20. Un conjugado según la reivindicación 19, en el que el oligómero comprende de 2 a 20 moléculas de proteína discretas, más preferiblemente hasta 10, o hasta 5 moléculas de proteína discretas.

21. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína deriva de seres humanos, o es idéntica, o lo es sustancialmente, en estructura a proteína de origen humano.

22. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que la proteína es una albúmina.

23. Un conjugado según la reivindicación 22, en el que la albúmina es seroalbúmina humana.

24. Un conjugado según la reivindicación 23, en el que la albúmina es seroalbúmina humana recombinante.

25. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, que es soluble y en el que el portador comprende una molécula proteica.

26. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, en el que el portador está en forma de una partícula formada a partir de moléculas proteicas.

27. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que el resto orientador se selecciona del grupo constituido por anticuerpos, otras proteínas y péptidos.

28. Un conjugado según la reivindicación 27, en el que el resto orientador es un anticuerpo.

29. Un conjugado según la reivindicación 28, en el que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

30. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que el agente reticulante comprende grupos que son reactivos con grupos -SH en el portador.

31. Un conjugado según la reivindicación 30, en el que el agente reticulante comprende un grupo seleccionado del grupo constituido por maleimida, 2-piridilditio, haloacetato, haloacetamida, aziridina, acriloílo/vinilo, 4-piridilditio y 2-nitrobenzoato-5-ditio.

32. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que el agente reticulante comprende grupos que son reactivos con restos carbohidrato, o derivados de los mismos, presentes en el resto orientador.

33. Un conjugado según la reivindicación 32, en el que el agente reticulante comprende un grupo hidrazida.

34. Un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en el que el agente reticulante se selecciona del grupo constituido por:

hidrazida del ácido maleimidocaproico;

hidrazida de 3-(2-piridilditio)propionilo;

hidrazida del ácido maleimidopropiónico;

hidrazida del ácido N-(\kappa-maleimidoundecanoico) e

hidrazida del ácido 4-(4-N-maleimidofenil)butírico.

35. Un conjugado según la reivindicación 25, en el que se acopla más de un portador con el resto orientador.

36. Un conjugado según la reivindicación 35, que comprende de 2 a 10 portadores por resto orientador.

37. Un conjugado según la reivindicación 36, que comprende de 2 a 5 portadores por resto orientador.

38. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que el resto orientador es un anticuerpo y está acoplado con el portador mediante un sitio de acoplamiento en la región constante del anticuerpo.

39. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, en el que al menos un 90%, más preferiblemente al menos un 95%, y lo más preferiblemente al menos un 99% de los agentes para administración al cuerpo (o precursores de los mismos) presentes en el conjugado están unidos covalentemente al portador.

40. Un conjugado según cualquier reivindicación precedente, que tiene una actividad de unión del resto orientador en el conjugado, medida en un ensayo de unión competitiva, de al menos un 50%, más preferiblemente al menos un 60%, 70%, 90% o al menos un 90% de la del resto orientador libre.

41. Una formulación que comprende un conjugado según cualquier reivindicación precedente, mezclado con un medio líquido farmacéuticamente aceptable.

42. Una formulación según la reivindicación 41, en la que el medio líquido es acuoso.

43. Un procedimiento para la preparación de un conjugado orientado de un agente para administración al cuerpo con un portador, comprendiendo dicho procedimiento

(b) (i) hacer reaccionar el conjugado intermedio con un agente reticulante heterobifuncional para activar el conjugado intermedio y hacer reaccionar entonces el conjugado intermedio activado con un resto orientador, o (ii) hacer reaccionar el conjugado intermedio con un resto orientador que se ha activado mediante reacción con un agente reticulante heterobifuncional, o (iii) hacer que el conjugado intermedio, un agente reticulante heterobifuncional y un resto orientador reaccionen simultáneamente entre sí,

en el que el agente reticulante tiene una funcionalidad que es específica de reacción con grupos presentes en el portador y ausentes en el resto orientador, y una segunda funcionalidad que es específica de reacción con grupos presentes en el resto orientador y ausentes en el portador.

44. Un procedimiento según la reivindicación 43, en el que el material portador es proteico.

45. Un procedimiento según la reivindicación 44, en el que el material portador es una albúmina.

46. Un procedimiento según la reivindicación 45, en el que la albúmina es seroalbúmina humana.

47. Un procedimiento según la reivindicación 46, en el que la albúmina es seroalbúmina humana recombinante.

48. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en el que el resto orientador es un anticuerpo.

49. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, en el que el agente reticulante comprende un grupo que es reactivo con los grupos sulfhidrilo.

50. Un procedimiento según la reivindicación 49, en el que el agente reticulante comprende un grupo seleccionado del grupo constituido por maleimida, 2-piridilditio, haloacetato, haloacetamida, aziridina, acriloílo/vinilo, 4-piridilditio y 2-nitrobenzoato-5-ditio.

51. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 48, en el que el agente reticulante comprende un grupo que es reactivo con restos carbohidrato o derivados de los mismos.

52. Un procedimiento según la reivindicación 51, en el que el agente reticulante comprende un grupo hidrazida.

53. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 52, en el que el agente para administración al cuerpo tiene, o está acoplado con el portador mediante un compuesto o resto intermedio que contiene, grupos carboxilo.

54. Un procedimiento según la reivindicación 49, en el que la etapa (b) está precedida por el desbloqueo de grupos sulfhidrilo presentes en el portador.

55. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 54, en el que la etapa (a) implica hacer reaccionar el portador con un agente quelante y el procedimiento comprende adicionalmente la formación de un quelato entre el agente quelante unido al material portador e iones metálicos añadidos a la mezcla de reacción, en el que el pH de la mezcla de reacción se mantiene a entre 5,0 y 6,5 durante la adición de dichos iones metálicos.

56. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, en el que el portador comprende una molécula proteica soluble.

57. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 55, en el que el portador es una partícula, y el procedimiento comprende la etapa preliminar de formar la partícula a partir de material formador de partícula.

58. Un procedimiento según la reivindicación 57, en el que la partícula se forma mediante un procedimiento que comprende las etapas de

i) formación de una suspensión del material formador de partícula;

y ii) secado por pulverización de dicha suspensión.

59. Un procedimiento según la reivindicación 58, en el que la suspensión de material formador de partícula se forma disolviendo el material formador de partícula en un disolvente, y añadiendo entonces un no disolvente para el material formador de partícula para causar la precipitación del material formador de partícula.

60. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 43 a 59, que es para la preparación de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40.

61. Un conjugado preparado mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 43 a 60.

62. El uso de un conjugado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 40 o la reivindicación 61 en la fabricación de una formulación para potenciar el contraste de una imagen que se va a obtener mediante una técnica de formación de imágenes médicas.