CN101384623B - 白蛋白与治疗剂的预成型偶联物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了白蛋白预成型偶联物的制备方法。本发明具体提供了一种治疗性化合物与重组白蛋白体外偶联的方法，其中包含反应基的治疗性化合物与重组白蛋白在溶液中接触形成偶联物。所述方法提供了与增加均质性的白蛋白品种的偶联。所获得的偶联物通过层析来纯化，具体是包括苯基琼脂糖凝胶和丁基琼脂糖凝胶层析的疏水相互作用层析。

Description

白蛋白与治疗剂的预成型偶联物的制备方法
本申请要求2005年12月22日提交的申请号为60/753,680的美国临时申请的优先权，其内容在此整体以参考的方式并入本文。
1.技术领域
本发明提供了白蛋白预成型偶联物(conjugate)的制备方法。本发明具体提供了一种治疗性化合物与重组白蛋白体外偶联的方法，其中包括反应基的治疗性化合物与重组白蛋白在溶液中接触形成偶联物。
2.背景技术
为了能够用于人体，治疗性分子必须符合严格的标准。除了安全和有效之外，它们必须在足够的时间内以足够的数量可利用，以在人体体内达到有效。不幸的是，许多提出的治疗性分子从人体体内不是被清除就是被降解，或者上述全部，因此其治疗效果受到限制。许多提出的肽疗法受到上述药物动力学缺陷的影响。
通过将它们与如白蛋白的载体分子共价偶联，一些提出的疗法在药物动力学上已经取得突破。确实，一些白蛋白偶联物正应用于人体临床实验。
因而，需要高效和有效的方法来制备和纯化上述白蛋白偶联物。
3.发明简述
本发明提供了白蛋白预成型偶联物的制备方法。在某些方面，本发明提供了在宿主细胞中生产白蛋白，在化合物的反应基和白蛋白半胱氨酸34之间能够形成共价键的条件下，将所述白蛋白与包含治疗基和反应基的化合物接触，并纯化由此形成的偶联物的方法。
在一方面，本发明提供了一种白蛋白预成型偶联物的制备方法，所述方法包括如下步骤：在宿主细胞中生产白蛋白；部分纯化白蛋白产物以减少宿主蛋白、抗原、内毒素等等；在有助于白蛋白半胱氨酸34和化合物反应基偶联的条件下使白蛋白与所述化合物接触；通过一个或多个疏水相互作用层析步骤来纯化所得的偶联物，随后可选择地进行超滤和配制。
因此，本发明的一实施方案提供了一种制备白蛋白预成型偶联物的方法，包括如下步骤：
(a)在宿主细胞中生产重组白蛋白；
(b)从宿主细胞中纯化重组白蛋白；
(c)在反应基能与重组白蛋白的Cys34巯基共价结合的反应条件下，将纯化的重组白蛋白与化合物接触形成偶联物，所述化合物包括反应基；和
(d)通过疏水相互作用层析纯化所述偶联物，随后可选择地进行超滤和配制。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在偶联反应步骤(c)之前，富集巯基白蛋白(mercaptalbumin)，即由游离和活性半胱氨酸34组成的白蛋白。尽管不倾向于受任何特定操作理论的限制，人们相信通过半胱氨酸、谷胱甘肽、金属离子、或其它加成物对白蛋白半胱氨酸34巯基的氧化、或“加帽”能够减少与所述化合物活性基的特异性偶联。因此，巯基白蛋白能够通过与现有技术中已知的能够将加帽白蛋白-Cys34转化为白蛋白-Cys34-SH的试剂接触从还原的或氧化的白蛋白异质池中富集。在某些实施方案中，巯基白蛋白能够通过白蛋白与巯基乙酸(FGA)接触进行富集。在某些实施方案中，巯基白蛋白能够通过白蛋白与二硫苏糖醇(DTT)接触进行富集。在一些实施方案中，巯基白蛋白可以通过进行疏水相互作用层析来富集，所述层析使用苯基或丁基琼脂糖凝胶，或其组合。在其它实施方案中，巯基白蛋白可以通过白蛋白与TGA或DTT接触进行富集，随后通过疏水相互作用层析纯化，所述层析采用苯基或丁基琼脂糖凝胶树脂，或其全部。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在偶联反应步骤(c)之前的糖基化白蛋白的还原反应。可通过本领域技术人员公知的任何还原糖基化白蛋白的技术来进行非酶糖基化形式的白蛋白的还原反应。在一些实施方案中，非酶糖基化白蛋白可通过将溶液进行亲和层析，如氨基苯基硼酸琼脂糖树脂、或者伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶、或者其组合来从白蛋白溶液中还原。
本发明的第二方面提供了一种白蛋白预成型偶联物的制备方法，其中在液体培养基中的宿主细胞生产的重组白蛋白与化合物接触形成偶联物，其无须从培养基中中间纯化所述重组白蛋白。因此，本发明的实施方案提供了制备白蛋白预成型偶联物的方法，所述方法包括如下步骤：
(a)在宿主细胞中生产重组白蛋白，其中宿主细胞在液体培养基中培养；
(b)在反应基能够与重组白蛋白中包含的Cys34巯基共价结合的反应条件下，将液体培养基与化合物接触形成偶联物，所述化合物包括反应基；和
(c)通过疏水相互作用层析纯化所述偶联物，随后可选择地进行超滤和配制。
在某些实施方案中，所述方法进一步包括在偶联反应步骤(b)之前裂解宿主细胞的步骤以促进细胞内存储的白蛋白的释放。在某些实施方案中，所述方法进一步包括从液体培养基中分离完整的或裂解的宿主细胞的步骤，因此为步骤(b)偶联反应提供粗制上清液。
本领域技术人员公知的任何重组白蛋白均可用于形成按本发明方法制备的偶联物。在一些实施方案中，所述重组白蛋白为哺乳动物的白蛋白，例如小鼠、大鼠、牛、羊、或人白蛋白。在一优选实施方案中，所述白蛋白为人重组白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白为人重组白蛋白的片段、变异体、或衍生物。在一些实施方案中，所述白蛋白为包含与治疗性肽遗传融合的重组白蛋白的白蛋白衍生物。
此外，本领域技术人员公知的任何治疗性化合物均可用于按照本发明的方法形成偶联物。在一些实施方案中，所述化合物的治疗部分选自由肽、蛋白质、有机分子、RNA、DNA和其组合构成的组。在一些实施方案中，所述化合物包含治疗性肽、或其分子量小于30kDa的衍生物。示例性的治疗性肽包括如胰高血糖素样肽1(GLP-1)、exendin-3和exendin-4的促胰岛素肽以及生长激素释放因子(GRF)。在一特定实施方案中，所述治疗部分为胰高血糖素样肽1，或其衍生物。在一特定实施方案中，所述化合物的治疗部分为exendin-3，或其衍生物。在一特定实施方案中，所述化合物的治疗部分为exendin-4，或其衍生物。在一特定实施方案中，所述治疗部分为人GRF，或其衍生物。
在某些实施方案中，所述化合物包含直接或通过连接基与治疗部分相连的反应基。在一些实施方案中，所述反应基为Michael受体、含琥珀酰亚胺基的基团、含马来酰亚胺基的基团、或亲电子受体。在一些实施方案中，所述反应基为能够进行二硫键交换的化学部分。在一些实施方案中，所述反应基包括游离巯基。在某些实施方案中，所述反应基为半胱氨酸残基。用于间接连接反应基的连接基包括，但不限于：(2-氨基)乙氧基乙酸(AEA)、乙二胺(EDA)、和2-[2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸(AEEA)。当所述治疗部分为肽时，所述反应基可连接到任何肽残基上。有用的连接位点包括氨基末端、羧基末端、和氨基酸侧链。
根据本发明的某些方法，重组白蛋白在宿主细胞中生产。能够制备外源重组蛋白的任何宿主细胞均可用于此处描述的方法。在一些实施方案中，所述宿主细胞是可转化产生重组白蛋白的酵母、细菌、植物、昆虫、动物、或人类细胞。在一些实施方案中，所述宿主在液体培养基中培养。在某些实施方案中，所述宿主可以是细菌株，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。在其它实施方案中，所述宿主可以是酵母菌株，例如酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、Arxula adeninivorans、和多形汉森酵母。在一具体实施方案中，所述宿主为毕赤酵母。
进一步根据本发明的方法，在反应基能够共价结合重组白蛋白的反应条件下，将粗制或部分纯化的重组白蛋白溶液与包括反应基的化合物接触以形成偶联物。在一些实施方案中，反应条件包括反应温度在1-37℃之间，或者更优选在20-25℃之间。在某些实施方案中，该重组白蛋白与所述化合物在低至中性pH值的溶液中接触。在一些实施方案中，pH值在约4.0和7.0之间。在某些实施方案中，重组白蛋白与所述化合物通过在至少30分钟的期间内滴加该化合物来进行接触。在一些实施方案中，所述化合物与重组白蛋白的最终摩尔比为0.1∶1至1∶1之间。在一些实施方案中，所述化合物与重组白蛋白的最终摩尔比为0.5∶1至0.9∶1。在一具体实施方案中，所述化合物与重组白蛋白的最终摩尔比为约0.7∶1。
进一步根据本发明的方法，所述偶联物通过疏水相互作用层析(HIC)来纯化。在一实施方案中，第一纯化步骤包括对偶联反应产物进行苯基琼脂糖层析。在某些实施方案中，该步骤从游离或偶联的白蛋白品种中分离出未偶联的化合物。在某些实施方案中，苯基琼脂糖层析柱在相对低盐和中性pH值的缓冲液，如包括5mM辛酸钠和5mM硫酸铵的pH 7.0的磷酸盐缓冲液中平衡。在上述条件下，未偶联化合物能够与树脂结合而偶联物能够流过层析柱。
在某些实施方案中，偶联物的纯化进一步包括在苯基琼脂糖层析之后的温和降解步骤以减少或降低任何包括非Cys34白蛋白偶联物的副反应产物。所述降解可在进行进一步纯化之前，在室温下对苯基琼脂糖流出液(flow-through)温育7天来实现。在某些实施方案中，所述温和降解步骤之后通过第二次使用苯基琼脂糖以进一步从偶联物中分离降解产物，即未偶联化合物。
在某些实施方案中，所述偶联物的纯化进一步包括第二HIC步骤，其中对苯基琼脂糖凝胶流出液进行丁基琼脂糖凝胶层析，以进一步将所述偶联物从未偶联白蛋白、二聚未偶联白蛋白、和残留的未偶联化合物中分离。在某些实施方案中，丁基琼脂糖凝胶柱在包括5mM辛酸钠和750mM硫酸铵的中性或接近中性pH值的缓冲液中平衡。在某些实施方案中，当所述化合物的分子量相对较低，如2kDa或更低，可改变所述盐条件和梯度。例如，可选择1.5M的起始硫酸铵浓度。在某些实施方案中，可采用线性或逐步递减的盐梯度或者其组合来完成洗脱，其中未偶联白蛋白采用750mM硫酸铵洗脱，二聚未偶联白蛋白采用550mM硫酸铵洗脱，化合物-白蛋白偶联物采用100mM硫酸铵洗脱，而未偶联化合物和其它种类采用水洗脱。这些种类可能包括，例如，二聚的、三聚的、或多聚的白蛋白偶联物、或包括化合物和白蛋白化学剂量比大于1∶1的白蛋白偶联物产物。
在某些实施方案中，偶联物的纯化进一步包括在HIC之后通过超滤法洗涤和浓缩所述偶联物。在一些实施方案中，无菌水、盐水、或缓冲液可被用来从纯化的偶联物中除去硫酸铵和缓冲液成分。
4.附图简述
图1显示了通过毕赤酵母表达的重组人白蛋白的DEAE琼脂糖凝胶阴离子交换纯化；
图2显示了通过毕赤酵母表达的重组人白蛋白的Q琼脂糖凝胶阴离子交换纯化；
图3显示了通过毕赤酵母表达的重组人白蛋白的HiTrapTMBlue亲和纯化；
图4显示了通过毕赤酵母表达的重组人白蛋白的苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用纯化；
图5显示了通过毕赤酵母表达并用巯基乙酸处理以富集巯基白蛋白的重组人白蛋白的苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用纯化；
图6显示了人血清白蛋白的氨基-苯基硼酸亲和层析以减少非酶糖基化白蛋白种类；
图7显示了人血清白蛋白的伴刀豆球蛋白A(Con A)亲和层析以减少非酶糖基化白蛋白种类；
图8显示了在被加样至苯基琼脂糖凝胶流出柱之前的来自DAC-Exendin-4(CJC-1134)和重组人白蛋白间偶联反应的未结合的Exendin-4的HPLC色谱；
图9显示了DAC-Exendin-4(CJC-1134)和重组人白蛋白间偶联反应的苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用层析；
图10显示了在加样所述反应混合物至苯基琼脂糖凝胶流出柱后的来自DAC-Exendin-4(CJC-1134)和重组人白蛋白间偶联反应产物的非结合的DAC-Exendin-4的HPLC色谱；
图11显示了在第一苯基琼脂糖凝胶流出物纯化后的DAC-Exendin-4(CJC-1134)和重组人白蛋白间偶联反应的丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用层析；
图12显示了在加样至苯基琼脂糖凝胶流出柱之前的来自DAC-GLP-1(CJC-1131)和重组人白蛋白间偶联反应的非结合DAC-GLP-1(CJC-1131)的HPLC色谱；
图13显示了DAC-GLP-1(CJC-1131)和重组人白蛋白间偶联反应的苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用层析；
图14显示了在加样所述反应混合物至苯基琼脂糖凝胶流出柱之后的来自DAC-GLP-1(CJC-1131)和重组人白蛋白间反应的非结合DAC-GLP-1的HPLC色谱；
图15显示了重组人白蛋白(道3)和GLP-白蛋白偶联物(道4)的考马斯染色凝胶；
图16显示了重组人白蛋白(道3)和GLP-白蛋白偶联物(道4)样品的白蛋白免疫检测；
图17显示了来自DAC-GLP-1和重组人白蛋白间偶联反应纯化的苯基和丁基琼脂糖凝胶片段的考马斯染色；和
图18显示了来自DAC-GLP-1和重组人白蛋白间偶联反应纯化的苯基和丁基琼脂糖凝胶片段的免疫检测。
5.发明详细描述
5.1定义
本文所用的“白蛋白”指本领域技术人员公知的任何血清白蛋白。白蛋白是血浆中最丰富的蛋白质，取决于来源的种类，其单体形式的分子量约为65至67千道尔顿。术语“白蛋白”可与“血清白蛋白”互换使用，其并不意味着定义根据本发明方法形成偶联物的白蛋白的来源。
本文所用的“治疗性肽”为具有如下定义的治疗活性的介于2-50个氨基酸之间的氨基酸链。每个治疗性肽具有氨基末端(也称为N-末端或氨基末端氨基酸)，羧基末端(也称为C-末端或羧基末端氨基酸)和位于氨基末端和羧基末端之间的内部氨基酸。氨基末端被定义为治疗性肽链中唯一具有游离α-氨基的的氨基酸。羧基末端被定义为治疗性活性肽中唯一具有游离α-羧基的氨基酸。在一些实施方案中，所述羧基末端可被酰胺化。
5.2发明实施方案
本发明提供了预成型白蛋白偶联物的制备方法。本发明具体提供了一种治疗性化合物与重组白蛋白体外偶联的方法，其中包括反应基的治疗性化合物与重组白蛋白在溶液中接触形成偶联物。
提供了在具有各种程度异质性的白蛋白溶液中与白蛋白体外偶联的方法。在一些实施方案中，白蛋白溶液为来自宿主有机体的液体培养基。在一些实施方案中，白蛋白溶液是液体培养物。在一些实施方案中，白蛋白溶液为粗制裂解液。在一些实施方案中，白蛋白溶液为澄清裂解液。在一些实施方案中，白蛋白溶液为纯化的白蛋白溶液。在一些实施方案中，白蛋白溶液为富基了巯基白蛋白的纯化的白蛋白溶液。在一些实施方案中，白蛋白溶液为纯化的去糖基化白蛋白溶液。
获得的偶联物通过层析纯化，例如包括苯基琼脂糖凝胶和丁基琼脂糖凝胶层析的疏水相互作用层析，随后可选择地进行超滤。
5.3治疗性化合物
5.3.1治疗基
通过本文所述方法形成的偶联物包括与包括治疗基和反应部分的化合物共价结合的重组白蛋白。在一些实施方案中，本领域技术人员公知的任何治疗性分子都可能包含所述化合物的治疗基。在一些实施方案中，治疗分子选自由肽、蛋白质、有机分子、RNA、DNA、及其组合构成的组。在一些实施方案中，治疗性分子为小分子，如长春瑞滨、吉西他滨、阿霉素、或紫杉醇。
在本发明具体实施方案中，所述治疗性分子为治疗性肽或蛋白质。在一些实施方案中，治疗性肽包括分子量低于30kDa的肽。示例性的治疗性肽包括抗肥胖肽，例如在美国专利申请号11/067,556(出版公开号US2005/176643)中描述的肽YY，其内容全文以参考的方式并入本文。在一些实施方案中，治疗性肽为利钠肽，例如心钠肽(ANP)或脑钠肽(BNP)，两者均在美国专利申请号10/989,397(出版公开号US 2005/089514)中描述，其内容全文以参考的方式并入本文。在一些实施方案中，治疗性肽为在美国专利申请号10/203,809(出版公开号US 2003/073630号)中描述的生长激素释放因子(GRF)，其内容全文以参考的方式并入本文。在一些实施方案中，治疗性肽为抗融合基因肽，例如T-20、C34或T-1249。其它有用的肽包括胰岛素、强啡肽、Kringle 5、TPO、T-118、和urocortin。
在具体的实施方案中，治疗性肽为促胰岛素肽。促胰岛素肽包括胰高血糖素样肽1(GLP-1)、exendin-3和exendin-4、以及它们的前体、衍生物和片段。上述促胰岛素肽包括那些在美国专利号6,514,500；6,821,949；6,887,849；6,849,714；6,329,336；6,924,264；和6,593,295以及国际公开号为WO 03/103572中公开的，其内容全文以参考的方式并入本文。在一些实施方案中，治疗性肽为GLP-1。在一些实施方案中，治疗性肽为GLP-1的衍生物。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-3。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-3的衍生物。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-4。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-4的衍生物。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-4(1-39)。在一些实施方案中，治疗性肽为exendin-4(1-39)Lys40。在一些实施方案中，治疗性肽为GRF。在一些实施方案中，治疗性肽为GRF的衍生物。在一些实施方案中，治疗性肽为天然GRF肽序列(1-29)或(1-44)，其包括以下独立或联合突变：在位置2的D-丙氨酸；在位置8的谷氨酰胺；在位置11的D-精氨酸；在位置12的(N-Me)Lys；在位置15的丙氨酸；在位置27的亮氨酸。在一些实施方案中，治疗性肽为GRF(D-ala2gly8 ala15 leu27)Lys30。
在某些实施方案中，治疗性肽的衍生物包括不存在于天然肽中的一个或多个氨基酸取代、缺失、和/或增加。优选地，氨基酸取代、缺失、或增加的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一实施方案中，上述衍生物在所述肽的氨基和/或羧基末端包括一个或多个氨基酸缺失、替代或增加。在另一实施方案中，上述衍生物在肽链长度内部任何残基中包括一个或多个氨基酸缺失、替代、或增加。
在某些实施方案中，氨基酸取代可以是保守或非保守氨基酸取代。保守氨基酸取代以涉及的氨基酸在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性中的相似性为基础进行的。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括：丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和蛋氨酸；极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺；带正电(碱性)氨基酸包括：精氨酸、赖氨酸、和组氨酸；和带负电(酸性)氨基酸包括：天冬氨酸和谷氨酸。此外，甘氨酸和脯氨酸为可影响链方向的残基。非保守性替代需要上述种类的一个与另一类发生交换。
在某些实施方案中，氨基酸取代可以是非典型氨基酸或化学氨基酸类似物的替代。非典型氨基酸包括，但不限于：普通氨基酸的D-异构体、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6-氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己烷丙氨酸、β-丙氨酸、氟代氨基酸，设计的氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、和氨基酸的一般类似物。
在某些实施方案中，治疗性肽的衍生物与肽的全序列同源性为至少75％、至少85％、或至少95％。本文中同源性百分比是指在比对序列和必要时引入间隙以获得最大百分比的序列同源性之后，候选序列中的氨基酸残基与肽中相对应的氨基酸残基相同(即在比对中确定位置的氨基酸残基是相同的残基)或相似(即如上所讨论，在比对中确定位置的氨基酸取代为保守性替代)的百分比。在某些实施方案中，治疗性肽的衍生物通过与肽的序列一致性百分比或序列相似性百分比来表征。序列同源性，包括序列一致性或相似性的百分比，通过使用现有技术中公知的比对技术来确定，优选使用为该目的设计的计算机算法，使用所述计算机算法缺省参数或者包括上述算法的软件包。
计算机算法和整合上述算法的软件包包括下述非限制性的例子。BLAST程序族为用于比较两个序列的优选的、非限制性的数学算法例子(例如Karlin& Altschul.1990，Proc.Nail.Acad.Sci.USA 87：2264-2268(在Karlin & Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中修改)。Altschul等，1990.J.Mol.Biol.215：403-410(描述了NBLAST和XBLAST)，Altschul等，1997.Nucleic Acids Res.25：3389-3402(描述了Gapped BLAST和PSI-Blast)。另一优选地例子为整合至ALIGN程序(2.0版本)并可作为GCG序列比对软件包的部分的Myers和Miller算法(1988 CABlOS 4：11-17)。同样优选地是FASTA程序(Pearson W.R.和Lipman DJ.，Proc.Nat Acad.Sci.USA，85：2444-2448，1988)，其可作为Wisconsin序列分析包的部分。另外的例子包括BFSTFIT，其使用Smith和Waterman“局部同源性”算法(Advances in AppliedMathematics，2：482-489，1981)来寻找两个序列之间最佳单一区域相似性，并当两个相比较的序列长度不相似时更适合。以及GAP，其根据Neddleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48：443-354，1970)寻找“最大相似性”来比对两种序列，并当两个序列长度大致相同且期望进行全长比对时更为适合。
在某些实施方案中，治疗性肽的衍生物与肽在全长序列中共有至少55％、至少65％、至少75％、或至少85％初级氨基酸序列同源性(没有间隙)。在优选实施方案中，治疗性肽的衍生物与肽在全长序列中共有至少90％或95％初级氨基酸序列同源性(没有间隙)。
在优选实施方案中，同一性或相似性百分比通过确定在一区域的氨基酸中相同氨基酸(同一性百分比)或保守氨基酸(相似性百分比)的数量来确定，该区域与相比较的两种肽中最短的全长相等(或如果两个序列长度相等，为两者全长)。在另一实施方案中，同一性或相似性百分比采用缺省参数的BLAST算法来确定。
5.3.1.1GLP-1和GLP-1衍生物
荷尔蒙胰高血糖素可根据本领域技术人员公知的任何方法合成。在一些实施方案中，其作为一种高分子量前体分子合成，随后用蛋白水解酶酶切为三种肽：胰高血糖素、GLP-1、和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。呈未加工形式的GLP-1具有37个氨基酸，如SEQ ID NO：1中所示(HDEFERH AEGTFTSD VSSYL HGQAAKEFIA WLVKGRG)。未处理的GLP-1本质上不能介导胰岛素生物合成的诱导。然而，未处理的GLP-1肽自然地转化为具有GLP-1的7-37位氨基酸(“GLP-1(7-37)”)SEQ ID NO：2(HAEGTFTSDVSSYL EGQAAKEFIA WLVKGRG)的31个氨基酸长的肽(7-37肽)。GLP-1(7-37)还能经过蛋白酶水解除去C末端甘氨酸以产生GLP-1(7-36)，其也主要以C末端残基精氨酸的酰胺化形式(精氨酰胺)存在，GLP-1(7-36)酰胺。该过程发生在肠内并以少得多的程度发生在胰腺内，且生成一种具有GLP-1(7-37)促胰岛素活性的多肽。
如果一种化合物能够刺激荷尔蒙胰岛素的合成或表达，或引起这样的刺激，则认为该胰岛素具有“促胰岛素活性”。GLP-1(7-37)和GLP-1(7-36)的荷尔蒙活性显示为对胰腺β细胞的特异性，在这些细胞中它们显示诱导胰岛素的合成。胰高血糖素样肽荷尔蒙在成熟期发病的糖尿病的发病机理研究中有用，其为胰岛素分泌动力学异常导致的特征为血糖过高的病症。此外，胰高血糖素样肽可用于治疗和处理该疾病、以及治疗和处理高血糖。
肽部分(片段)可选自确定的人GLP-1氨基酸序列。可互换的术语“肽片段”和“肽部分”指包括来源于天然存在的氨基酸序列，或者采用重组方式产生的合成的和天然存在的氨基酸序列。
GLP-1的氨基酸序列已被很多研究者报道过。参见Lopez，L.C.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：5485-89(1983)；Bell，G.I.等，Nature 302：716-718(1983)；Heinrich，G.等，Endocrinol.1 15：2176-81(1984)，其内容以参考的方式并入本发明。胰高血糖素前原mRNA和其相应的氨基酸序列是公知的。前体基因产物胰高血糖素原蛋白水解加工成胰高血糖素和两种促胰岛素肽也被描述过。此处所用符号GLP-1(1-37)指一种具有所有从1(N-末端)到37(C-末端)氨基酸的GLP-1多肽。相似地，GLP-1(7-37)指具有所有从7(N-末端)到37(C-末端)氨基酸的GLP-1多肽。相似地，GLP-1(7-36)指具有所有从7(N-末端)到36(C-末端)氨基酸的GLP-1多肽。
在一实施方案中，GLP-1(7-36)和其肽片段通过如下描述的常规方法合成，如通过Merrifield，Chem.Soc.85：21491962(1962)和Stewart&Young，Solid Phase Peptide Synthesis，Freeman，San Francisco，1969，第27-66页中描述的众所周知的固相肽合成法，其内容在此处以参考的方式并入本发明。然而，还可以通过天然存在的氨基酸序列片段化，例如使用蛋白水解酶来得到胰高血糖素原多肽或GLP-1的片段。进一步的，还可通过使用重组DNA技术得到所需的胰高血糖素原或GLP-1的片段，如Maniatis，T.等公开的Molecular Biology：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor.N.Y.(1982)，其内容在此处以参考的方式并入本发明。
对本文所述方法有用的肽包括那些来源于GLP-1，如GLP-1(1-37)和GLP-1(7-36)的肽。如果能通过片段化天然存在的序列得到，或者能够根据天然存在的氨基酸序列或者编码该序列的遗传物质(DNA或RNA)的相关知识合成，则该肽被认为是“来源于天然存在的氨基酸序列”。
那些被认为是GLP-1“衍生物”的分子，如GLP-1(1-37)和特别是GLP-1(7-36)，也是可用的。上述衍生物具有如下特征：(1)其与GLP-1或GLP-1类似大小的片段具有基本同源性；(2)其具有促胰岛素荷尔蒙的功能；和(3)该衍生物具有至少0.1％、1％、5％、10％、15％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的GLP-1促胰岛素活性的促胰岛素活性。
如果衍生物的氨基酸序列与GLP-1(1-37)至少75％、至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同，所述GLP-1衍生物被认为与GLP-1具有“基本同源性”。
除了包括与天然存在的GLP-1肽基本同源的序列外，有用的衍生物还可包括那些在它们的氨基和/或羧基末端、或所述序列内部包含一个或多个附加的氨基酸的GLP-1衍生物。因而，有用的衍生物包括可包含一个或多个可能不存在于天然存在的GLP-1序列中的氨基酸的GLP-1多肽片段，只要所述多肽具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的GLP-1促胰岛素活性的促胰岛素活性。所述附加的氨基酸可以是D-氨基酸或L-氨基酸或其组合。
有用的GLP-1片段还包括那些片段，其虽然包含与天然存在的GLP-1肽基本同源的序列，但在其氨基和/或羧基末端缺失一个或多个在GLP-1肽中天然存在的氨基酸。因而，有用的GLP-1多肽片段可缺失一个或多个通常存在于天然存在的GLP-1序列中的氨基酸，只要所述多肽具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的GLP-1促胰岛素活性的促胰岛素活性。在某些实施方案中，所述多肽片段缺失一个通常存在天然存在的GLP-1序列中的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽片段缺失两个通常存在天然存在的GLP-1序列中的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽片段缺失三个通常存在天然存在的GLP-1序列中的氨基酸。在一些实施方案中，所述多肽片段缺失四个通常存在天然存在的GLP-1序列中的氨基酸。
具有不连贯氨基酸取代(因而具有与天然序列不同的氨基酸序列)的上述片段的明显的或微小的变异体也可使用，只要所述变异体具有与上述GLP-1衍生物基本相同的促胰岛素活性。
除了具有促胰岛素活性的GLP-1衍生物外，刺激细胞葡萄糖摄取但不刺激胰岛素表达或分泌的GLP-1衍生物也可用于本文所述方法。这些GLP-1衍生物在美国专利号5,574,008中描述，其在此全文以参考的方式并入本发明。
可用于本文所述方法中的刺激细胞葡萄糖摄取但不刺激胰岛素表达或分泌的GLP-1衍生物包括：
R1-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Xaa-Gly-Arg-R2(SEQ ID NO：3)
其中R1选自：
a)H2N；b)H2N-Ser；c)H2N-Val-Ser；d)H2N-Asp-Val-Ser；e)H2N-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：4)；f)H2N-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：5)；g)H2N-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：6)；h)H2N-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：7)；i)H2N-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ IDNo：8)；j)H2N-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：9)；和k)H2N-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID No：10)；I)H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：11)；m)H2N-His-D-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser(SEQ ID NO：12)。在肽中，Xaa选自Lys和Arg，并且R2选自NH2、OH、Gly-NH2、和Gly-OH。
上述肽为C-末端GLP-1片段，其不具有促胰岛素活性，但对治疗糖尿病和高血糖病症仍然有效，如美国专利号5,574,008中描述，在此全文以参考的方式并入本发明。
5.3.1.2Exendin-3和Exendin-4肽及其衍生物
exendin-3和exendin-4肽可为本领域技术人员公知的任何exendin-3或exendin-4肽。Exendin-3和exendin-4为39氨基酸肽(残基2和3不同)，其与GLP-1有约53％的同源性并能作为促胰岛素剂使用。
天然exendin-3序列为
HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS(SEQ IDNO：13)，和exendin-4序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS(SEQ ID NO：14)。
还可用于本文所述方法的是exendin-4促胰岛素片段，其包括氨基酸序列：exendin-4(1-31)(SEQ ID NO：15)氨基酸序列HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY和exendin-4(1-31)(SEQ IDNO：16)HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY。
同样有用是天然exendin-4的抑制片段，其包括氨基酸序列：exendin-4(9-39)(SEQ ID NO：17)DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS。
其它示例性的促胰岛素肽如SEQ ID NO：18-24所示：
  HDFFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK   SEQ ID NO：18
  HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK   SEQ ID NO：19
  HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK   SEQ ID NO：20
  HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK   SEQ ID NO：21
  HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY   SEQ ID NO：22
  HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY   SEQ ID NO：23
  DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS   SEQ ID NO：24
可用于本文所述方法的有用的肽还包括来源于天然存在的exendin-3和exendin-4肽的肽。如果能通过片段化天然存在的序列得到，或者能够根据天然存在的氨基酸序列或者编码该序列的遗传物质(DNA或RNA)的相关知识合成，则该肽被认为是“来源于天然存在的氨基酸序列”。
本文所述方法中有用的分子还包括那些被认为是exendin-3和exendin-4的“衍生物”的分子。上述“衍生物”具有下述特征：(1)其与exendin-3或exendin-4或者类似大小的exendin-3或exendin-4片段具有基本同源性；(2)其具有促胰岛素荷尔蒙的功能；和(3)该衍生物具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的exendin-3或exendin-4的促胰岛素活性的促胰岛素活性。
如果衍生物的氨基酸序列与exendin-3或4或者具有相同数目氨基酸残基的exendin-3或4的片段衍生物的序列至少75％、至少80％、和优选至少90％、和最优至少95％相同，则该exendin-3和exendin-4衍生物被认为与exendin-3和exendin-4具有“基本同源性”。
除了包括与天然存在的exendin-3或exendin-4肽基本同源的序列外，有用的衍生物还可包括那些在它们的氨基和/或羧基末端、或所述序列内部包含一个或多个附加的氨基酸的exendin-3或exendin-4片段。因而，有用的衍生物包括可包含一个或多个可能不存在于天然存在的exendin-3或exendin-4序列中的氨基酸的exendin-3或exendin-4多肽片段，只要所述多肽具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的exendin-3或exendin-4促胰岛素活性的促胰岛素活性。
类似地，有用的衍生物包括exendin-3或exendin-4片段，所述片段虽然包含与天然存在的exendin-3或exendin-4肽基本同源的序列，还可以是在其氨基和/或羧基末端缺失一个或多个在exendin-3或exendin-4肽中天然存在的氨基酸。因而，有用的衍生物包括可缺失一个或多个通常存在于天然存在的exendin-3或exendin-4序列中的氨基酸的exendin-3或exendin-4多肽片段，只要所述多肽具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的exendin-3或exendin-4的促胰岛素活性的促胰岛素活性。
有用的衍生物还包括具有不连贯氨基酸取代(因而具有与天然序列不同的氨基酸序列)的上述片段的明显的或微小的变异体，只要所述变异体具有与上述exendin-3或exendin-4衍生物基本相同的促胰岛素活性。
5.3.1.3GRF和GRF衍生物
生长荷尔蒙(GH)，又称生长激素，是由垂体前叶中被称为促生长细胞的细胞合成和分泌的约含190个氨基酸的蛋白质激素。其为控制生长和新陈代谢的主要参与者。其也是一种用于人类和动物的相当重要的药物制剂。GH的产生由多种因素调控，包括压力、营养、睡眠以及GH本身。然而，其主要控制者为两种下丘脑激素：生长激素释放因子(GRF或GHRH)，一种刺激GH合成和分泌的44氨基酸序列；和生长激素抑制剂(SS)，其抑制GH对GRF应答的释放。
研究表明GRF(1-44)的生物活性存在于肽的N-末端部分。GRF(1-29)在体内和体外均显示出全部的固有活性和能力。此外，GRF的持续施用诱导与在常规生理条件下相同的GH从脑下垂体中间断式分泌方式。因而当生长激素存在的情况下，GRF具有很大的治疗作用。例如其可用于治疗垂体功能减退性侏儒症、由于GH产生异常引起的糖尿病、和延迟老化过程。许多其它可受益于GRF内源生成或释放的疾病或病症列举如下。更进一步，GRF可用于农业领域。农业用途的例子包括提高猪、牛及其类似的肉产量以允许更早进入市场。GRF还已知可刺激奶牛的牛奶产量。其它示例性的应用在美国专利申请号10/203,809(美国专利公开号2003/073630)中描述，其内容在此全文以参考的方式并入本发明。
因而，在某些实施方案中，包含GRF作为治疗性肽的偶联物可通过本发明的方法形成。有用的肽还包括GRF衍生物，其尽管包含与天然存在的GRF肽基本同源的序列，还可在其氨基和/或羧基末端缺失一个或多个在GRF天然肽中天然存在的附加氨基酸。因而，有用的肽包括可缺失一个或多个通常在天然存在的GRF序列中存在的氨基酸的GRF多肽片段，只要所述多肽具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的GRF生长激素释放活性的生长激素释放活性。
GRF衍生物可被认为与GRF具有“基本同源性”，如果所述衍生物与GRF的氨基酸序列至少75％、至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同。
对本文所述方法有用的肽还可包括具有不连贯氨基酸取代(因而具有与天然序列不同的氨基酸序列)的上述片段类似物的明显的或微小的变异体，只要所述变异体具有至少0.1％、1％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、或超过100％的GRF生长激素释放活性的生长激素释放活性。
在具体实施方案中，对本文所述方法有用的GRF肽具有下述序列：
A1-A2-Asp-A4-Ile-Phe-A7-A8-A9-Tyr-A11-A12-A13-Leu-A15-Gln-Leu-A18-Ala-A20-A21-A22-Leu-A24-A25-A26-A27-A28-A29-A30
其中
A1为Tyr、N-Ac-Tyr、His、3-MeHis、desNH2 His、desNH2 Tyr、Lys-Tyr、Lys-His或Lys-3-MeHis；
A2为Val、Leu、Ile、Ala、D-Ala、N-甲基-D-Ala、(N-甲基)-Ala、Gly、Nle ou Nval；
A4为Ala或Gly；
A5为Met或Ile；
A7为Asn、Ser或Thr；
A8为Asn、Gln、Lys或Ser；
A9为Ala或Ser；
A11为Arg、D-Arg、Lys或D-Lys：
A12为Lys、(N-Me)Lys或D-Lys；
A13为Val或Leu；
A15为Ala、Leu或Gly；
A18为Ser或Thr；
A20为Arg、D-Arg、Lys或D-Lys；
A21为Lys、(N-Me)Lys或Asn；
A22为Tyr或Leu；
A24为Gln或His；
A25为Ser或Asp；
A26为Leu或Ile；
A27为Met、Ile、Leu或Nle；
A28为Ser、Asn、Ala或Asp；
A29为Lys或Arg；和
A30为缺失、X或X-Lys，其中X为缺失或为序列Gln-Gln-Gly-Glu-Ser-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu或其片段，其中所述片段从C-末端减少1至15个氨基酸；且其中来源于片段的一个氨基酸残基可选择地被赖氨酸残基取代；C-末端可以是游离的羧酸或者相应的酰胺，
只要如果A2为Ala时，所述片段不是减少5-8氨基酸的片段。
除了促进生长激素的内源生成或释放，此处的GRF衍生物可以在GRF肽“主链”内部的一个或多个位点发生氨基酸取代，或者是GRF种类的变体，其中C-末端和/或N-末端已通过增加一个或多个碱性残基而改变，或者被修饰以整合肽化学领域中常用类型的阻断基以防止肽末端受到不希望的生化攻击和体内降解。因而，此处的GRF衍生物包括任何GRF种类中的氨基酸取代，其包括但不限于人GRF、牛GRF、鼠GRF、猪GRF等，其序列已经被多名作者报道过。在一优选实施方案中，赖氨酸残基被加到GRF肽序列的C-末端或N-末端。
5.4反应基
在一优选实施方案中，通过本文所述方法形成的偶联物包括通过反应基共价结合于重组白蛋白的治疗分子。所述反应基通过其与白蛋白形成稳定共价键的能力(如通过与白蛋白上的一个或多个氨基、羟基、或巯基反应)来进行选择。优选地，反应基只与白蛋白上的一个氨基、羟基、或巯基进行反应。优选地，反应基只与白蛋白上特定的氨基、羟基、或巯基进行反应。在一些实施方案中，通过本文所述方法形成的偶联物包括治疗性肽，或其经修饰的衍生物，其通过反应基与白蛋白上的氨基、羟基、或巯基反应与白蛋白共价相连。因而，通过本发明方法形成的偶联物可包括治疗性肽，或其经修饰的衍生物，其中反应基形成共价键与白蛋白相连。更优选地，所述反应基与白蛋白的Cys34巯基形成共价键。
为了与蛋白质上的功能基形成共价键，各种活性羧基，尤其是酯可用作为化学反应基。所述羧基通常转化成为反应中间体，如易于受到蛋白质上的氨基、巯基和羟基官能团攻击的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或马来酰亚胺。将NHS和马来酰亚胺反应基导入蛋白质可通过使用双官能连接剂来进行，例如，马来酰亚胺-苯酰-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、二硫代双-N-hydrohy琥珀酰亚胺丙酸酯(DTSP)、琥珀酰亚胺基3(2-硫代吡啶丙酸酯)(SPDP)、琥珀酰亚胺基反-4-(马来酰亚胺甲基)环己基-1-羧酸酯(SMCC)、琥珀酰亚胺基乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、苯甲酮4-马来酰亚胺、N-((2-吡啶二硫)乙基)-4-azidosalicylamide(PEAS；AET)。上述双官能连接剂将根据保护基的选择活化肽的羧基或氨基。
可选择地，向肽中添加马来酰亚胺可通过使用偶联剂进行，如N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、和类似物质来活化衍生物，如马来酰亚胺丙酸，[2-[2-[2-马来酰亚胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基]乙酸，随后与肽上的氨基反应。类似的试剂如DCC和EDAC也可被用于添加如马来酰亚胺烷基的衍生物至肽的羧基。
伯胺是NHS酯的主要目标。存在于蛋白质N-末端可接近的ε-氨基与NHS酯反应。然而，蛋白质上的ε-氨基并不理想或能够用于NHS联结。虽然在其侧链上具有氮的氨基酸有五种，但是只有赖氨酸的ε-氨基与NHS酯反应明显。当NHS酯偶联反应与伯胺反应时，能形成酰胺键，释放N-羟基琥珀酰亚胺。这些包括琥珀酰亚胺基的反应基在本文也称为琥珀酰亚胺基。
在一具体实施方案中，白蛋白的功能基为位于氨基酸残基34(Cys34)的单一游离巯基，化学反应基为包括马来酰亚胺基的基团，如MPA。MPA代表马来酰亚胺基丙酸或马来酰亚胺基丙酸酯。上述包括马来酰亚胺基的基团在本文也称为马来酰亚胺基。
在一些实施方案中，通过本文所述方法形成的偶联物包括与治疗性肽上的琥珀酰亚胺基或马来酰亚胺基共价结合的白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白的氨基、羟基或巯基与治疗性肽上的琥珀酰亚胺或马来酰亚胺基共价结合。在一些实施方案中，白蛋白半胱氨酸34巯基与治疗性肽的赖氨酸的ε-氨基上的[2-[2-[2-马来酰亚胺基丙酰胺基(乙氧基)乙氧基]乙酰胺接头共价结合。
在一具体实施方案中，反应基为在单个限定的氨基酸处连接于肽的单一MPA反应基，可选地通过连接基连接，并且所述MPA在白蛋白单一氨基酸残基，优选半胱氨酸34上共价连接至白蛋白。在一优选实施方案中，所述白蛋白为重组人白蛋白。
在某些实施方案中，反应基，优选MPA，通过一个或多个连接基，优选AEEA、AEA、或辛酸，连接到肽上。在实施方案的某些例子中，所述反应基，优选MPA，通过多于一个的连接基连接到肽上，每一连接基可独立选自优选由AEA((2-氨基)乙氧基乙酸)、AEEA([2-(2-氨基)乙氧基)]乙氧基乙酸)、和辛酸构成的组。在一实施方案中，所述反应基，优选MPA，通过0、1、2、3、4、5或6个串联次序的AEEA连接基连接到肽上。在另一实施方案中，反应基，优选MPA，通过0、1、2、3、4、5或6个串联次序的辛酸连接基连接到肽上。在某些实施方案中，连接基可以包括，例如，0-30个原子、或0-20个原子、或0-10个原子的链。在某些实施方案中，连接基可由例如0-30个原子、或0-20个原子、或0-10个原子的链组成。这些原子可选自如C、N、O、S、P构成的组。
在某些实施方案中，所述反应基可与任何适合连接上述反应基的治疗性肽的残基连接。所述残基可以是肽的末端或内部残基。在某些实施方案中，所述反应基连接到肽的羧基末端或氨基末端。在有益的实施方案中，所述反应基连接到肽的单一位置。这可通过使用本领域技术人员公知的保护基来实现。在某些实施方案中，所述治疗性肽的衍生物可包括用于连接所述反应基的残基。用于连接的有用的残基包括但不限于：赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸残基。所述残基可整合至肽的内部或末端，如通过末端游离α-氨基连接于N-末端氨基酸残基。在某些实施方案中，所述反应基连接至内部赖氨酸残基。在某些实施方案中，所述反应基连接至末端赖氨酸残基。在某些实施方案中，所述反应基连接至氨基末端赖氨酸残基。在某些实施方案中，所述反应基连接至羧基末端赖氨酸残基，例如在GLP-1、GLP-1(7-37)或exendin-4的羧基末端的赖氨酸残基。
在其它实施方案中，活化的二硫键可以通过基于选择性巯基活化方案的优先形成分子间二硫键的方法与治疗性肽半胱氨酸或半胱氨酸类似物连接。基于用活化基选择活化一个巯基后，与第二游离巯基反应，从而在蛋白质或肽之间选择性地形成不对称二硫键的方法已被描述用来缓解由于对称二硫键形成导致的还原产物问题。参见D.Andreu等，“Methods in MolecularBiology”(M.W.Pennington and B.M.Dunn，编)，第35卷，第91页.HumanaPress，Totowa.N.J.，(1994)，其内容以全文参见的形式并入本文。优选地，上述活化基为那些基于吡啶-甲硫基的活化基(M.S.Bernatowicz等，Int.J.Pept.Protein Res.28：107(1986))。更优选，2，2’-二巯基二吡啶(DTDP)(Carlsson等，Biochem.J.173：723(1978)；L.H.Kondejewski等，Bioconjugate Chem.5：602(1994)或2，2’-二巯基二(5-硝基吡啶)(NPYS)(J Org.Chem.56：6477(1991))也可被采用。此外，5，5’-二巯基二(2-硝基苯甲酸)(Ellman试剂)或6，6’-二巯基二烟酸也可被用作活化基。
根据这些方法，二硫键活化基首先与包含半胱氨酸或半胱氨酸类似物的治疗性肽在活化基过量的条件下反应。上述条件非常有利于包含与活化二硫基偶合的治疗性肽的治疗性化合物的形成，而几乎没有二硫键肽同型二聚体生成。偶合反应之后，得到的肽化合物被纯化，如通过反向HPLC法。当肽化合物与血液成分，优选血清白蛋白，反应时，发生与第二巯基的反应，从而形成治疗性化合物和血清白蛋白的偶联物。
治疗性肽半胱氨酸或半胱氨酸类似物通过亚硫酸分解反应方案转化成为具有S-磺酸。在该方案中，治疗性肽首先通过以合成或重组的方式合成。然后亚硫酸分解反应被用来通过其半胱氨酸或半胱氨酸类似物巯基使S-磺酸与治疗性肽连接。亚硫酸分解反应后，纯化该肽化合物，如通过梯度柱层析。然后所述S-磺酸复合物被用于在治疗性肽和血液成分，优选血清白蛋白，之间形成偶联物。
根据包含治疗性肽的各种成分的性质的不同，用反应基修饰治疗性肽从而与白蛋白偶联的方法将大不相同。可选择简单、高效和能够得到高纯度产物的合成工艺。通常，化学反应基将在肽合成的最后阶段形成，例如，采用羧基，酯化作用形成活性酯。用于生产经修饰的促胰岛素肽的具体制备方法在美国专利号6,329,336、6,849,714或6,887,849中描述，其内容以全文参照的方式并入本文。
5.5白蛋白
本领域技术人员公知的任何白蛋白均可用于按照本发明的方法形成偶联物。在一些实施方案中，所述白蛋白可以是从宿主种类中分离并纯化用于形成偶联物的血清白蛋白。所述血清白蛋白可以是本领域技术人员公知的哺乳动物血清白蛋白，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、牛、羊、马、或人白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白为人血清白蛋白。
虽然本发明的方法可被用于形成包括许多来源的白蛋白的白蛋白偶联物，如血清或基因组来源，但是所述方法特别适合采用重组白蛋白形成的偶联物。所述重组白蛋白可以是本领域技术人员公知的哺乳动物白蛋白，包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、牛、绵羊、马、或人白蛋白。在一优选实施方案中，所述重组白蛋白为重组人白蛋白，尤其是重组人血清白蛋白(rHSA)。
人血清白蛋白(HSA)在血清渗透压方面负有的重要的比例，并具有内源和外源配体的载体的功能。在其成熟形式，HAS为含585个氨基酸的非糖基化单体蛋白，对应约66kD的分子量。其球状结构由形成一系列连续的9个双环的17个二硫键桥维持。参见Brown.J.R.，Albumin Structure，Functionand Uses，Rosenoer，V.M.等(编)，Pergamon Press，Oxford(1977)，其内容以全文参见的形式并入本文。因而，采用成熟形式的白蛋白形成的偶联物也包括在本文所述方法的范围内。
在一些实施方案中，通过本发明方法形成的偶联物包括白蛋白前体。人白蛋白在肝细胞中合成，然后分泌至血流中。该合成第一步生成前体，前原-HAS(prepro-HAS)，其包括18氨基酸的信号序列，其将新生多肽引入分泌通路。因而，以白蛋白前体形成的偶联物包括在本文所述方法范围内。
在某些实施方案中，通过本发明方法形成的偶联物包括白蛋白的分子变异体。白蛋白的变异体包括人类白蛋白多态性产生的天然变异体。通过在不同条件下的电泳分析已经确定了超过30种明显不同人血清白蛋白的遗传性变异体。参见，Weitkamp，Ann.Hum.Genet，36(4)：381-92(1973)；Weitkamp，Isr.J.Med.Sci.，9(9)：1238-48(1973)；Fine等，Biomedicine，25(8)：291-4(1976)；Fine等，Rev.Fr.Trans/us.Immunohematol，25(2)：149-63.(1982)；Rochu等，Rev.Fr.Transfus.Immunohematol，31(5)：725-33(1988)；Arai等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 86(2)：434-8(1989)，其内容以全文参见的形式并入本文。因而，以白蛋白分子的变异体形成的偶联物包括在本文所述方法范围内。
在一些实施方案中，通过本发明方法形成的偶联物包括与白蛋白基本同源的白蛋白衍生物。例如，偶联物可采用氨基酸序列与白蛋白至少75％、至少80％、至少85％、更优选至少90％、和最优选至少95％相同的白蛋白同源物形成。在某些实施方案中，所述白蛋白同源物包括游离半胱氨酸。在某些实施方案中，所述白蛋白同源物包括单个游离半胱氨酸。在一些实施方案中，所述白蛋白同系物包括游离半胱氨酸34。
在一些实施方案中，通过本发明方法形成的偶联物包括白蛋白的结构衍生物。白蛋白的结构衍生物可包括具有白蛋白类活性的蛋白质或肽，例如白蛋白功能片段。在一些实施方案中，该衍生物为白蛋白抗原决定簇，即可被抗白蛋白抗体识别的多肽部分。在一些实施方案中，所述重组白蛋白可以是可通过修饰编码人血清白蛋白的基因得到的具有高血浆半衰期的任何蛋白质。通过非限制性的例子，所述重组白蛋白可在白蛋白微量金属结合区域存在插入或缺失，上述微量金属的结合，如镍和/或铜被减少或去除，如美国专利号6,787,636中描述，其内容以全文参见的形式并入本文。减少的白蛋白与微量金属的结合可有利于减少经白蛋白组合物治疗的个体对微量金属过敏反应的可能性。
白蛋白结构衍生物可通过本领域技术人员公知的任何方法产生，包括但不限于，寡核苷酸介导(定点)诱变、丙氨酸扫描、和聚合酶链反应(PCR)诱变。定点诱变(参见Carter，Biochem.J.237：1-7(1986)；Zoller and Smith，Methods Enzymol.154：329-50(1987))，盒式突变，限制选择诱变(Wells等Gene 34：315-323(1985))或其它公知技术能在克隆白蛋白编码DNA上进行以制备白蛋白变体DNA或者编码白蛋白结构衍生物的序列(Ausubel等，Current Protocols In Molecular Biology，John Wiley和Sons，New York(现行版)；Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)，其内容以全文参照的方式并入本文。
在某些实施方案中，白蛋白衍生物包括通过体外修饰白蛋白得到的具有高血浆半衰期的任何大分子。在一些实施方案中，所述白蛋白用脂肪酸修饰。在一些实施方案中，所述白蛋白用金属离子修饰。在一些实施方案中，所述白蛋白用对白蛋白具有高亲和力的小分子修饰。在一些实施方案中，所述白蛋白用糖修饰，其包括但不限于葡萄糖、乳糖、甘露糖、和半乳糖。
在一些实施方案中，通过本文所述方法形成的偶联物可包括白蛋白融合蛋白，即与治疗性蛋白质或其片段或其变体融合的白蛋白分子、或其片段或变体。所述白蛋白融合蛋白可以通过翻译包括与编码所有或部分白蛋白的多核苷酸连接的编码所有或部分治疗性肽的多核苷酸的核酸来产生。本领域技术人员公知的任何白蛋白融合蛋白均可用于按照本发明的方法形成偶联物。示例性的白蛋白融合蛋白在美国专利号6,548,653、6,686,179、6,905,688、6,994,857、7,045,318、7,056,701、和7,141,547中描述，其内容以全文参照的形式并入本文。在一些实施例中，所述白蛋白融合蛋白如在美国专利号7,141,547中所描述的，包括与胰高血糖素样肽1相融合的白蛋白、或其片段或其变体。在一些实施方案中，所述白蛋白融合蛋白包括与exendin-3、或其片段或其变异体融合的白蛋白、或其片段或其变异体。在一些实施方案中，所述白蛋白融合蛋白包括与exendin-4、或其片段或其变异体融合的白蛋白、或其片段或其变异体。
用于按照本发明形成的偶联物的白蛋白可以通过使用本领域技术人员公知的方法或物质得到。例如，通过商业途径获得白蛋白，例如NovozymesInc.(Davis，CA；源于酿酒酵母的重组人白蛋白)；Cortex-Biochem(SanLeandro，Calif.；血清白蛋白)，Talecris Biotherapeutic(Research Triangle Park，North Carolina；血清白蛋白)，ZLB Behring(King of Prussia，PA)，或NewCentury Pharmaceuticals(Huntsville，Ala.；源于毕赤酵母的重组人白蛋白)。
5.6在宿主细胞中生产重组白蛋白
在某些实施方案中，编码白蛋白、或其变体、或其衍生物的DNA可以在适合的宿主细胞中表达以产生用于偶联的重组白蛋白。因而，编码白蛋白的表达载体可根据本领域技术人员公知的构建表达载体的技术来构建。然后该载体可被用于转化适合的宿主细胞用于表达和生产被用于根据本方法形成偶联物的白蛋白。
5.6.1表达载体
通常，表达载体为包括与编码多肽的核苷酸序列可操作性连接的表达控制序列的重组多核苷酸分子。通过包含适当的启动子，复制序列，选择性标记等等，表达载体可以容易的适应于真核和原核功能，从而得到稳定的mRNA转录和翻译。构建表达载体和包括表达载体的细胞中基因的表达技术为现有技术公知。参见Sambrook等2001，Molecular Cloning-A LaboratoryManual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.和Ausubel等编，现行版，Current Protocols in Molecular Biology，GreenePublishing Associates and Wiley Interscience，NY。
多种宿主载体系统均可用于表达白蛋白编码序列。包括，但不限于：感染病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)的哺乳动物细胞系；感染病毒(例如杆状病毒)的昆虫细胞系；微生物如含酵母载体的酵母；以噬菌体、DNA、质粒DNA、或粘粒(cosmid)DNA转化的细菌；或者以质粒DNA转染的人细胞系。载体表达元件在其强度和特异性方面均不同。根据所使用的宿主载体系统，许多适当的转录和翻译元件中的任何一种均可使用。在一些实施例中，人白蛋白cDNA被表达。在一些实施方案中，白蛋白分子变体被表达。在一些实施方案中，白蛋白前体被表达。在一些实施方案中，白蛋白结构衍生物被表达。在一些实施方案中，白蛋白融合蛋白被表达。
白蛋白的表达可以通过任何本领域公知的启动子/增强子控制。在一具体实施方案中，该启动子异源于(即非天然启动子)特定的白蛋白编码基因或核酸序列。可用于控制白蛋白编码基因或核酸序列在哺乳动物细胞中表达的启动子包括，但不限于：SV40早期启动子区域(Bemoist和Chambon，Nature290：304-310(1981))，劳氏肉瘤病毒3’长末端重复中包括的启动子(Yamamoto等，Cell 22：787-797(1980))，疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445(1981))，和金属硫蛋白基因的调控序列((Brinster等，Nature 296：39-42(1982))。
可用于原核表达载体的启动子包括，但不限于：β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731(1978))，或者tat启动子(DeBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25(1983))，也可参见“Useful Proteins From Recombinant Bacteria”，Scientific American.242：74-94(1980)，其内容全文以参考的方式并入本发明。
在植物表达载体中有用的启动子包括，但不限于：胭脂碱合成酶启动子区域(Herrera-Estrella等，Nature 303：209-213(1983))，花椰菜花叶病毒35SRNA启动子(Gardner等，Nucleic Acids Res.9：2871(1981))，和光合酶核酮糖二磷酸羧化酶启动子(Herrera-Estrella等，Nature 310：1 15-120(1984))。
用于在酵母或其它真菌中表达白蛋白的有用的启动子包括：Gal4启动子，ADC(乙醇脱氢酶)启动子，PGK(磷酸甘油激酶)启动子，碱性磷酸酶启动子，或者AOX 1(醇氧化酶1)启动子(Ellis等，Mol.Cell. Biol.5：1111-1121(1985))。
在本发明的实施方案中，当希望分泌重组白蛋白至宿主细胞培养基时，该表达载体可进一步包括“前导”序列，其位于编码白蛋白序列的上游，或者适当的介于转录和翻译起始区域和编码序列之间，其指引初生多肽进入所选宿主的分泌通路。在一些实施方案中，前导序列为人血清白蛋白的天然前导序列。在其它实施方案中，该前导序列为异源序列。所用前导序列的选择在很大程度上取决于宿主有机体的选择。例如，当宿主为酵母时，可采用信息素因子α、转化酶、或酸性磷酸酶的序列作为异源前导序列。在一具体实施方案中，该前导序列可以是酿酒酵母α因子前原(prepro)肽的前导序列。参见Cregg等，Biotechnology 11：905-910(1993)；Scorer等，Gene 136：111-119(1993)。在其它实施方案中，当宿主为细菌时，该前导序列可以是α-淀粉酶amyBamP或者中性蛋白酶nprBamP的前导序列。使用这些前导序列在枯草芽孢杆菌中分泌重组人血清白蛋白在Saunders等，J.Bacteriol.169(7)：2917-25(1987)中描述，其内容全文以参考的方式并入本发明。可选择地，可使用Sec通道将重组白蛋白运输到周质空间。Sec移位酶为细菌中蛋白质从胞浆穿过细胞质膜的移位提供了主要通道。参见Pugsley AP，Microbiol.Rev.，57(1)：50-108(1993)。SecA ATPase与SecYEG整体膜组分动力学相互作用从而驱使新合成的前体蛋白(preprotein)的跨膜运动。未成熟的蛋白质包括从而允许其被运输出细胞质的短信号序列，如pelB、ompA、和phoA，可在大肠杆菌中有效分泌生产重组白蛋白。
5.6.2生产重组白蛋白的宿主细胞
包含白蛋白编码序列的表达载体可被导入宿主细胞中以生产重组白蛋白。在一些实施方案中，任何能产生外源重组白蛋白的细胞均可用于本文所述的方法。
在一些实施方案中，所述宿主有机体为细菌菌株，例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。在一些实施方案中，所述宿主有机体为酵母菌株，例如酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、Arxula adeninivorans、和多形汉森酵母。在一具体实施方案中，所述宿主有机体为毕赤酵母。
在一些实施方案中，重组白蛋白在被病毒，如杆状病毒感染的昆虫细胞中生产。在一些实施方案中，所述重组白蛋白在动物细胞中制备。在某些实施方案中，重组白蛋白采用经载体转化，或编码白蛋白病毒、或其变体、或衍生物感染的哺乳动物细胞来生产。在某些实施方案中，所述哺乳动物细胞为COS、CHO、或C127细胞。在一具体实施方案中，所述哺乳动物细胞为人视网膜细胞系PER.C6R。
在一些实施方案中，重组白蛋白在转基因非人类动物中制备。所述动物可以是哺乳动物，即有蹄类(即牛、山羊、或绵羊)、猪、鼠或兔。在一些实施方案中，所述重组白蛋白分泌到动物乳汁中，如美国专利号5,648,243所描述，其内容在此全文以参考的方式并入本发明。在其它实施方案中，所述重组白蛋白分泌到动物血液中，如在美国专利号6,949,691中描述，其内容全文以参考的方式并入本发明。在其它实施方案中，所述重组白蛋白分泌到动物尿液中，如在美国专利申请号11/401,390中描述，其内容全文以参考的方式并入本发明。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物，尤其是鼠类动物的方法已经成为本领域常规技术。参见例如美国专利号4,870,009、4,736,866和4,873,191，其内容全文以参考的方式并入本发明。其它表达重组白蛋白的非鼠类转基因动物可通过类似的方法制备。
在一些实施方案中，所述宿主有机体为被转化以表达重组白蛋白的植物细胞。在植物细胞中表达人血清白蛋白的方法为本领域公知技术，参见例如Sijmons等，Biotechnology 8(3)：217-21(1990)；Farran等，Transgenic Res.11(4)：337-46(2002)；Fernandez-San Millan等，Plant Biotechnol.J.1(2)：71-9(2003)；Baur等，Plant Biotechnol.J.3(3)：331-40(2005)；和美国专利申请号11/406,522，其内容全文以参考的方式并入本发明。
5.6.3宿主细胞的转化
表达载体可不受限制的通过本领域普通技术人员公知的任何方法导入用于表达的宿主细胞。上述方法包括但不限于：例如，细胞从溶液中直接吸收该分子；或采用如脂质体或免疫脂质体的脂转染来促进吸收；颗粒介导的转染，等等。参见美国专利5,272,065号；Goeddel等编，1990，Methods inEnzymology，第185卷，Academic Press.Inc.，CA；Krieger.1990.Gene Transferand Expression-A Laboratory Manual.Stockton Press，NY；Sambrook等，1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory.NY；以及Ausubel等编，现行版，Current Protocols in MolecularBiology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience.NY。
在本发明一具体实施方案中，重组白蛋白在酵母细胞，尤其是毕赤酵母中生产。转化毕赤酵母的方法为现有技术公知。参见Hinnen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75：1292-3(1978)；Cregg等，Mol.Cell.Biol.5：3376-3385(1985)。示例性的技术包括但不限于：原生质球法、电穿孔、PEG 1000介导转化、或氯化锂介导转化。
5.6.4重组白蛋白的表达
扩增、诱导、和发酵表达重组白蛋白的宿主有机体的方法为本领域公知技术。参见，如Ausubel等编，现行版，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Interscience，NY。通过非限制性举例的方式，在酵母，例如毕赤酵母中表达重组蛋白的一般程序如下：将置于250ml挡板瓶中的25ml合适的培养基用单个重组克隆接种。细胞在振荡式培养箱(250-300rpm)中在28-30℃下生长，直到培养基达到OD600＝2-6(大约16-18小时)，其中所述细胞呈对数生长。通过在室温下，1500-3000×g离心5分钟收获细胞。倒出上清液并在合适的培养基中再次悬浮细胞沉淀至1.0的OD600以诱导表达(大约100-200ml)。然后所述培养物可置于带有2层无菌纱布或干酪包布的1升挡板瓶中并回到恒温箱继续生长。可每隔24小时向培养基中加入适当的诱导剂维持诱导。培养物样本可周期取样(时间点(小时))：0、6、12、24(1天)、36、48(2天)、60、72(3天)、84、和96(4天)并用于分析表达水平以确定诱导后收获的最佳时间。然后细胞可在室温下在台式微量离心机中以最大速度离心分离2-3分钟。当重组白蛋白被分泌时，上清液可被转至单独的试管中。上清液和细胞沉淀可存储于-80℃下直到进行实验。对于胞内表达，可丢弃上清液并将细胞沉淀储存于-80℃下直到进行实验。随后可对上清液和细胞沉淀进行蛋白质表达分析，例如通过考马斯染色SDS-PAGE和western印迹法或功能性分析。
5.7从宿主细胞中纯化重组白蛋白
在本发明的一个方面，制备偶联物的方法可选择地包括在偶联反应之前从宿主有机体中纯化所述重组白蛋白。尽管下述步骤按顺序列出，本领域技术人员应当知道许多步骤的顺序可以调换，例如，巯基白蛋白的富集步骤和白蛋白的去糖基化步骤的顺序，其并不超出本发明的保护范围。在某些实施方案中，当希望与分泌的重组白蛋白的偶联直接在培养基中发生时，可以理解下述的纯化步骤可以省略，且所述偶联可按照下节的描述进行。
5.7.1从培养基中分离宿主细胞
在某些实施方案中，本发明方法提供了当宿主细胞在液体培养基中培养且重组白蛋白在其中分泌时，在偶联反应之前从培养基中分离宿主细胞的方法。现有技术中任何从培养基中分离宿主细胞的方法均可使用。在一些实施方案中，宿主细胞通过过滤从培养基中分离。在一优选实施方案中，宿主细胞通过离心从培养基中分离。分离之后，获得的上清液可用于进一步分离其中所含的重组白蛋白。可选择地，当期望直接在培养物上清液中发生偶联时，下述步骤可以省略，且偶联可按照下节的描述进行。
5.7.2宿主细胞的裂解
在某些实施方案中，本发明方法选择性的提供了当宿主细胞在液体培养基中培养且重组白蛋白主要存储于细胞内时，在偶联反应之前宿主细胞的裂解方法。本领域技术人员公知的任何裂解细胞的方法均可使用。在一些实施方案中，宿主细胞可通过机械方法来裂解，例如通过使用高速搅拌机、涡漩、匀浆机、弗氏细胞压碎器、Menton Gaulin压碎器、或超声破碎器。
在宿主有机体为酵母的具体实施方案中，可通过本领域技术人员公知的任何裂解酵母细胞的方法来裂解细胞。在一些实施方案中，细胞可通过如下方法裂解：通过与含裂解酶或多糖水解酶的溶液接触首先将细胞转化成为原生质球，然后对该原生质球进行渗压休克或Dounce匀质，或其组合。渗压休克可通过与本领域技术人员公知的任何低渗透势溶液接触来实现。在某些实施方案中，渗压休克可通过将原生质球与去离子水接触来实现。在其它实施方案中，酵母细胞的细胞裂解可在玻璃微珠存在的情况下通过涡漩进行机械性破坏来实现。
在宿主有机体为细菌的具体实施方案中，细胞裂解可通过本领域技术人员公知的任何裂解细菌细胞的方法来实现。在一些实施方案中，细胞裂解可通过在螯合剂如EDTA存在下将细胞与溶菌酶接触来实现。
在白蛋白在细菌细胞中表达的具体实施方案中，可采取附加步骤从而获得用于偶联的适当折叠的重组白蛋白。在细菌中，尤其大肠杆菌中，大量表达的真核蛋白质，通常沉淀成为被称作“包涵体”的不溶性的聚合体。参见Braun等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99：2654-59(2002)。包涵体必须被分离、纯化并用变性剂溶解，随之进行构成蛋白质的复性。利用简单稀释、基质辅助方法、和向复性缓冲剂加入溶质的蛋白质重折叠的方法为现有公知技术。参见Cabrita等，Biotechnol.Annu.Rev.10：31-50(2004)；Mayer等，MethodsMol.Med.94：239-254(2004)；Middelberg，Trends Biotechnol.20：437-443(2002)；Clark，Curr.Opin.Biotechnol.9-157-163(1998)；和Clark，Curr.Opin.Biotechnol.12：202-207(2001)，其内容全文以参考的方式并入本发明。因此，本领域技术人员公知的任何恢复和复性细菌表达的真核蛋白质的方法均可用于恢复和复性表达于细菌中的重组白蛋白。
宿主细胞裂解后，细胞碎片和颗粒物质可从粗制裂解液中分离。任何现有技术中公知的从粗制裂解液中分离细胞碎片的方法均可使用。在一些实施方案中，细胞碎片和颗粒物质可通过微滤分离。在一优选实施方案中，碎片和颗粒的分离通过离心实现。所得的澄清裂解液可用于进一步纯化其中所含的重组白蛋白。可选择地，当期望直接在澄清裂解液中发生偶联时，下述步骤可以省略，且偶联可如5.8节描述进行。
5.7.3通过层析纯化重组白蛋白
在某些实施方案中，本发明的方法选择性地提供了在偶联反应之前，通过层析除去宿主蛋白质和抗原、颗粒物、内毒素等纯化重组白蛋白的方法。在某些实施方案中，所述层析可以是本领域技术人员公知的对蛋白质纯化有用的任何层析方法。通过非限制性例子的方式，所述层析可以是离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析、或疏水相互作用层析。
在一些实施方案中，重组白蛋白通过离子交换层析纯化。根据本领域技术人员判断能结合白蛋白的任何离子交换树脂均可使用。在一些实施方案中，所述离子交换剂为弱碱性阴离子交换剂，如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素。在某些实施方案中，所述DEAE-纤维素树脂在pH 7.0，10mM磷酸钠缓冲液中平衡。在加样并结合于树脂后，所述白蛋白可采用渐增的盐梯度进行洗脱，所述梯度可以是线性或逐步的、或其组合。例如，所述白蛋白可通过将树脂与pH 7.0，含20到200mM的磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 7.0，含30-150mM的磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 7.0，40到125mM磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 7.0，50到100mM磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 7.0，约60mM磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在上述条件下纯化重组白蛋白的示例性的例子在下文实施例1中提供。
在其它实施方案中，所述离子交换剂为强碱性阴离子交换剂，如Q琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，所述Q琼脂糖凝胶树脂在pH 8.0，20mM Tris-HCl缓冲液中平衡。在加样并结合于树脂后，所述白蛋白可采用渐增的盐梯度进行洗脱，所述梯度可以是线性或逐步的、或其组合。例如，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 8.0，含0到2M NaCl的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 8.0，含0.1到1M NaCl溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 8.0，200到900mM NaCl溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 8.0，300到800mM NaCl溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白可通过将该树脂与pH 8.0，约500mM磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在上述条件下纯化重组白蛋白的示例性的例子在下文实施例2中提供。
在一些实施方案中，所述重组白蛋白通过亲和层析纯化。根据本领域技术人员判断能够结合白蛋白的任何亲和层析配体均可使用。在一些实施方案中，所述配体为Cibacron Blue F3G-A，含于例如HiTrapTM Blue HP层析柱中(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。在某些实施方案中，所述配体在pH 8.0，20mM Tris-HCl缓冲液中平衡。当Cibacron Blue F3G-A通过与芳烃阴离子配体的静电和/或疏水作用结合白蛋白时，可采用渐增的盐梯度进行洗脱，所述梯度可以是线性或逐步的、或其组合。因而，在加样并与配体结合后，白蛋白的洗脱可以通过，例如将配体与pH 8.0，含0到2M NaCl的溶液接触来实现。在一些实施方案中，白蛋白通过该树脂与pH 8.0，0.2到1.5mM NaCl接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过该树脂与pH 8.0，0.5到1.0mM NaCl接触洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过该树脂与pH 8.0，约750mM磷酸钠缓冲液接触来洗脱。在上述条件下纯化重组白蛋白的示例性的例子在下文实施例3中提供。
在一些实施方案中，重组白蛋白通过疏水相互作用层析纯化。根据本领域技术人员判断可结合白蛋白的任何疏水性树脂均可使用。示例性的疏水性树脂包括，但不限于，辛基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶、和丁基琼脂糖凝胶。在一具体实施方案中，所述疏水性树脂为苯基琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶树脂在例如pH 7.0，含20mM磷酸钠、5mM辛酸钠、和750mM(NH4)2SO4缓冲液中平衡。在加样并结合于树脂后，所述白蛋白可采用递减的盐梯度进行洗脱，所述梯度可以是线性或逐步的、或其组合。例如，所述白蛋白可通过与含0到750mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与含约300到500mM(NH4)2SO4的溶液接触洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与含约350到450mM(NH4)2SO4的溶液接触洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与含约375到425mM(NH4)2SO4的溶液接触洗脱。在某一实施方案中，所述白蛋白通过与含约400mM(NH4)2SO4的溶液接触洗脱。在上述条件下纯化重组白蛋白的示例性的例子在下文实施例4中提供。
在某些实施方案中，含重组白蛋白的洗脱液可采用低分子量过滤器过滤以浓缩样品并洗掉残留的内毒素等。在一些实施方案中，采用AmiconR 10kDa微孔滤膜(Millipore Corporation.Bedford，Mass.)进行超滤。在某些实施例中，所述重组白蛋白用无菌水洗涤。在其它实施方案中，所述重组白蛋白可用0.9％的盐水(154mM NaCl)洗涤。在其它实施方案中，所述重组白蛋白可用无菌缓冲液洗涤。
在某些实施方案中，所述白蛋白溶液可以浓缩到约5-250mg/ml的总蛋白，相当于约0.5-25％的白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白溶液的最终浓度为含约5mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml、约40mg/ml、约80mg/ml、约120mg/ml、约150mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml、约225mg/ml、或约250mg/ml的总蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白溶液含约0.5％、约1％、约2％、约4％、约8％、约12％、约15％、约17.5％、约20％、或约25％的白蛋白。然后白蛋白样品可重新配制成期望的配方组合物。
所得的重组白蛋白溶液可用于进一步纯化所述重组白蛋白，例如，巯基白蛋白的富集或去糖基化，或全部。可选择地，当偶联反应期望直接在该部分纯化的白蛋白溶液中进行时，下述步骤可以省略，偶联反应可如下文5.8节中描述进行。
5.7.4巯基白蛋白的富集
人血清白蛋白的制备，无论是血清来源或者重组制备的，均可包含非巯基白蛋白即“加帽的”白蛋白与巯基白蛋白即“非加帽的”白蛋白的异质混合物。人白蛋白多肽含35个半胱氨酸残基，其中34个半胱氨酸残基形成17个稳定的二硫键桥。尽管位于巯基白蛋白34位的半胱氨酸残基包含游离的SH基，在非巯基白蛋白的相同残基包括与例如半胱氨酸或谷胱甘肽形成的混合二硫键，或经金属离子或其它加合物氧化从而使巯基活性降低或无法利用。尽管不倾向于受任何具体操作理论的限制，人们认为巯基白蛋白的富集可以产生具有对与治疗性化合物偶联有利特性的白蛋白。具体的，由于Cys34的巯基与治疗性化合物的反应基共价偶联的有效性，提高了偶联的特异性。因而，在本发明的一优选实施方案中，在进行偶联反应之前，所述纯化的重组白蛋白进行巯基白蛋白富集。
通常，巯基白蛋白的富集可在本领域技术人员公知的转化氧化的或“加帽的”白蛋白为巯基白蛋白的任何技术和任何条件下进行。在一些实施方案中，通过将重组白蛋白与能够转化氧化的白蛋白-Cys34成为还原的白蛋白-Cys34的任何试剂接触实现富集。在某些实施方案中，所述试剂为二硫苏糖醇(DTT)。在一优选实施方案中，所述试剂为巯基乙酸(TGA)。在一些实施方案中，所述试剂为β-巯基乙醇(BME)。通常，所述试剂在本领域技术人员公知的适合转化加帽白蛋白-Cys34成为巯基白蛋白的条件下与重组白蛋白接触。上述条件包括，例如，在合适的pH、合适的试剂浓度、合适的温度、和合适的时间条件下将重组白蛋白与试剂接触。通常，在从氧化状态下还原白蛋白-Cys34时，本领域熟练技术人员将会考虑到白蛋白链内部的二硫键桥的保护。
在某些实施方案中，重组白蛋白在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的pH下与TGA接触。在某些实施方案中，重组白蛋白在pH约为5到6、或约5.2到5.8、或约5.3到5.7时与TGA接触。在具体的实施方案中，重组白蛋白在pH约为5.6时与TGA接触。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为为巯基白蛋白的浓度条件下与TGA接触。在某些实施方案中，重组白蛋白与浓度为约1mM、约5mM、约10mM、约20mM、约40mM、约60mM、约80mM、约100mM、约150mM、约200mM、约250mM、或约300mM的TGA在合适缓冲液中接触。在某些实施方案中，在合适缓冲液中的TGA浓度为约1-300mM、约5-250mM、约10-200mM、约20-150mM、约40-100mM、或约60-80mM。在具体的实施方案中，所述重组白蛋白在250mM Tris醋酸盐缓冲液中与75mM的TGA接触。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白与TGA在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的温度下接触。在某些实施方案中，重组白蛋白在约0-8℃、约1-7℃、约2-6℃、或约3-5℃下与TGA接触。在具体的实施方案中，重组白蛋白在约4℃下与TGA接触足够转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的时间。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的时间长度内与TGA接触。在某些实施方案中，重组白蛋白与TGA接触至少0.1、1、5、10、15、20、25、或30小时。在某些实施方案中，所述重组白蛋白与TGA接触约5-30小时、约10-25小时、或约20-25小时。在某些实施方案中，所述重组白蛋白与TGA接触约8、16、24或32小时。在具体的实施方案中，所述重组白蛋白在250mMTris-醋酸盐缓冲液中，pH 5.6，约4℃下与75mM TGA接触约20小时。
在其它实施方案中，巯基白蛋白的富集通过将所述白蛋白与DTT接触来实现。在某些实施方案中，所述重组白蛋白在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的pH下与DTT接触。在某些实施方案中，所述重组白蛋白在pH约7到8、或约7.2到7.8、或约7.3到7.7条件下与DTT接触。在具体实施方案中，所述重组白蛋白在约pH 7.6下与DTT接触。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的浓度下与DTT接触。在某些实施方案中，重组白蛋白与浓度为约0.1mM、约0.25mM、约0.5mM、约0.75mM、约1.0mM、约1.5mM、约2.0mM、约2.5mM、约3.0mM、约3.5mM、约4.0mM、或约5.0mM的DTT在合适的缓冲液中接触。在某些实施方案中，在适合的缓冲液中的DTT的浓度为约0.1到5.0mM、约0.25到4mM、约0.5到3.5mM、约0.75到3.0mM、约1.0到2.5mM、或约1.5到2mM DTT。在具体的实施方案中，所述重组白蛋白在1mM磷酸钾缓冲液中与约2mMDTT接触。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白在根据本领域技术人员判断适合转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的温度下与DTT接触。在某些实施方案中，重组白蛋白在约15-40℃、约20-35℃、约20-30℃、或约23-27℃下与DTT接触。在具体实施方案中，所述重组白蛋白在约23-27℃下与DTT接触可充分转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白的时间。
在某些实施方案中，所述重组白蛋白在根据本领域技术人员判断可转化加帽白蛋白成为巯基白蛋白合适的时间长度下与DTT接触。在某些实施方案中，重组白蛋白与DTT接触至少1、2、3、4、5、10、15、20、25、或30分钟。在某些实施方案中，所述重组白蛋白与DTT接触至少约1到30分钟、约2到25分钟、或约5至10分钟。在某些实施方案中，所述重组白蛋白与DTT接触约1、5、10或30分钟。在具体的实施方案中，所述重组白蛋白在1mM磷酸钾缓冲液中与2mM DTT在约23-27℃下接触约5分钟。
在另一实施方案中，巯基白蛋白可通过层析从白蛋白中富集。在某些实施方案中，所述层析可以是本领域公知的可用于纯化蛋白质的任何层析方法。层析既可以用作独立的富集步骤，又可以，例如在白蛋白与TGA或DTT、或者其组合接触之后立即联合使用。在一些实施方案中，通过层析方法富集巯基白蛋白可包括上文所述的纯化白蛋白的任何层析方法，包括但不限于：离子交换、亲和、凝胶过滤、或疏水相互作用层析。
在优选实施方案中，在与TGA或DTT，或者其组合接触后，所述巯基白蛋白通过疏水相互作用层析进一步富集和纯化。示例性的疏水性树脂包括但不限于：辛基琼脂糖凝胶、苯基琼脂糖凝胶、或丁基琼脂糖凝胶。在一优选实施方案中，所述树脂为苯基琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶树脂在例如，含20mM磷酸钠、5mM辛酸钠、和750mM(NH4)2SO4，pH 7.0的缓冲液中平衡。在加样并结合于树脂后，巯基白蛋白通过采用线性的或逐步的、或者其组合的递减的盐梯度，从加帽白蛋白以及TGA或DTT中分离。例如，巯基白蛋白可通过与包含0到750mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与含约400到600mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与包含约450到550mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，所述白蛋白通过与包含约475到525mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在一特定实施方案中，所述白蛋白通过与含约500mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。在上述条件下，巯基白蛋白可在加帽白蛋白之前洗脱。在上述条件下巯基白蛋白纯化的示例性的例子在下文实施例5中提供。
在某些实施方案中，包含重组白蛋白的洗脱液可用低分子量过滤器过滤以浓缩样品并洗掉残留的内毒素等。在一些实施方案中，可用AmiconR 10kDa Millipore滤器(Millipore Corporation，Bedford，Mass.)进行超滤。在某些实施方案中，所述重组白蛋白可用无菌水洗涤。在其它实施方案中，该重组蛋白可用0.9％的盐水(154mM NaCl)洗涤。
在某些实施方案中，所述白蛋白溶液可浓缩至约5-250mg/ml总蛋白，相当于约0.5-25％白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白溶液的最终浓度包含约5mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml、约40mg/ml、约80mg/ml、约120mg/ml、约50mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml、约225mg/ml、或约250mg/ml总蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白溶液包含约0.5％、约1％、约2％、约4％、约8％、约12％、约15％、约17.5％、约20％、或约25％的白蛋白。然后所述白蛋白样品可被配制成期望的配方组合物。
溶液中巯基白蛋白与加帽白蛋白的比率特征可通过液相色谱/质谱来测定，例如通过Kleinova等，Rapid Commun.Mass Spectrom.19：2965-73(2005)描述的方法，其内容在此处全文以参考的方式并入本发明。
获得的巯基白蛋白富集的白蛋白溶液可被用于进一步纯化，例如在进行偶联反应之前，非酶糖基化种类的白蛋白的还原。可选择地，如果偶联期望直接在巯基白蛋白溶液中进行，下述步骤可省略，且偶联可按照5.8节描述进行。
5.7.5白蛋白去糖基化
在与在宿主有机体，尤其是如酿酒酵母和毕赤酵母的酵母菌株中生产重组白蛋白相关的本发明实施方案中，可采取进一步的步骤限制与重组白蛋白生产相关的杂质水平。尤其是，与血清来源的人白蛋白相比重组人白蛋白糖基化图谱的潜在不同增强了采用白蛋白组合物治疗的个体的潜在的过敏和/或免疫应答。参见Bosse等，J.Clin.Pharmacol.45：57-67(2005)。进一步的，白蛋白的非酶糖基化，例如葡萄糖结合在Lys525和Lys548，以及Amadori产物形成于上述残基可诱导局部蛋白二级结构的构象变化，从而影响白蛋白的配体结合以及功能活性。参见Shaklai等，J.Biol.Chem.259(6)：3812-17(1984)；Wada，J.Mass.Spectrom.31：263-266(1996)；Howard等，J.Biol.Chew.280(24)：22582-89(2005)。因此，尽管不倾向于受任何操作理论的限制，人们相信白蛋白的去糖基化，尤其是在酵母中产生的重组白蛋白，可得到就与之形成偶联物而言具有有利的耐受性和稳定性的白蛋白。因此，在本发明的具体实施方案中，所述白蛋白可在继续进行偶联反应之前被去糖基化。
通常，白蛋白的去糖基化可在本领域技术人员公知的对还原非酶糖基化蛋白质有用的任何技术和任何条件下进行。示例性的方法在Miksik等在J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.Appl.699(1-2)：31 1-45(1997)中描述，其内容在此处全文以参考的方式并入本发明。在一些实施方案中，非酶糖基化白蛋白可通过层析法还原。在某些实施方案中，所述层析可为本领域技术人员公知的对从非糖基化蛋白质中分离糖基化蛋白质有用的任何层析。通过非限制性举例的方式，所述层析可为尺寸排阻层析、离子交换层析、或亲和层析。
在一些实施方案中，糖基化和非糖基化白蛋白的分离通过尺寸排阻层析进行。在某些实施方案中，根据本领域技术人员判断可用于从非糖基化白蛋白中分离糖基化白蛋白的任何尺寸排阻凝胶均可使用。例如，尺寸排阻层析可用
Figure G2006800531729D00491
6HR(GE Healthcare，Piscataway，NJ)进行，其在如pH 6.8的0.05M磷酸、0.15M氯化钠中进行平衡。在一些实施方案中，洗脱可在流动速率为约0.5ml/min的平衡缓冲液中进行。
在某些实施方案中，尺寸排阻层析可采用
Figure G2006800531729D00492
CL-4B(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)进行，其在如pH 7.2的0.01M磷酸盐缓冲液中平衡。在一些实施方案中，洗脱在流动速率约20ml/h的平衡缓冲液中进行。在某些实施方案中，各单独片段在如饱和硫酸铵中透析，且所述沉淀物在pH7.2，0.01M磷酸盐缓冲液中再溶解。
在另一实施方案中，糖基化和非糖基化白蛋白的分离通过离子交换层析进行。在某些实施方案中，根据本领域技术人员判断能从非糖基化白蛋白分离糖基化白蛋白的任何离子交换树脂均可使用。例如，所述离子交换剂可以是强碱性阴离子交换剂，如Hydropore AX(Rainin，Woburn，MA)，其在pH7.1的10mM磷酸盐缓冲液中平衡。在一些实施方案中，当加样并结合于树脂后，白蛋白的洗脱可采用线性的或逐步的、或其组合的渐增的盐梯度进行。例如，糖基化和非糖基化白蛋白品种可通过与包含0到1M NaCl，pH7.1的溶液接触以进行分离和洗脱。在其它实施方案中，所述离子交换剂可以是弱碱性阴离子交换剂，如DEAE Sephacel(GE Healthcare，Piscataway，NJ)，其在pH 7.2的0.01M磷酸盐中平衡。在一些实施方案中，洗脱通过从0到0.5M的渐增的线性梯度的NaCl，在4℃下进行。
在优选实施方案中，去糖基化通过亲和层析进行。根据本领域技术人员判断能从非糖基化白蛋白中分离糖基化白蛋白的任何亲和配体均可使用。尽管不倾向于受任何特定理论的限制，人们相信由酵母分泌至高葡萄糖培养基的重组白蛋白导致位于白蛋白赖氨酸残基的葡萄糖共价结合。因而，从非糖基化白蛋白中分离糖基化白蛋白可用硼酸基亲和层析进行，其中所述糖基化白蛋白包含共价结合的葡萄糖。在某些实施方案中，氨基苯基硼酸基琼脂糖作为亲和配体。在某些实施方案中，所述树脂用含0.25M醋酸铵、0.05M氯化镁，pH 8.5的缓冲液平衡。在所述白蛋白样品加样且糖基化品种结合于树脂后，非糖基化品种的洗脱可用平衡缓冲液进行。结合的糖基化蛋白可通过将该氨基苯基硼酸基琼脂糖树脂与含0.2M山梨醇，pH 8.5的0.1M Tris-HCl缓冲液接触来洗脱。大部分结合蛋白被洗脱后，可用0.5％的乙酸再生层析柱并洗脱更紧密结合的蛋白品种。在上述条件下从非糖基化白蛋白中分离糖基化白蛋白的示例性的例子在下文实施例6中提供。
在另一优选实施方案中，通过亲和层析的白蛋白去糖基化采用伴刀豆球蛋白A(Con A)作为亲和配体。伴刀豆球蛋白A与各种糖中间和非还原末端α-甘露糖基特异结合。在某些条件下，Con A可选择性结合糖基化白蛋白品种，其中糖类为不同于葡萄糖的糖类，如甘露糖、半乳糖、乳糖等等。进一步的，Con A可成功的与由更复杂的糖即高阶糖组成的白蛋白品种结合，所述糖通过在如丝氨酸和/或苏氨酸的氨基酸残基的侧链氧原子上的共价键O-连接到所述重组白蛋白上。在一些实施方案中，该Con A树脂在含0.1M醋酸盐缓冲液、1M NaCl、1mM MgCl2、1mM MnCl2、1mM CaCl2，pH6的溶液中平衡。在加样所述白蛋白样品且结合糖基化品种于树脂后，非糖基化白蛋白品种立即在平衡缓冲液中洗脱，而糖基化品种的洗脱可用0.1M葡萄糖、0.1M甘露糖在平衡缓冲液中进行。在上述条件下从非糖基化白蛋白中分离糖基化白蛋白的示例性的例子在下文实施例7中提供。
在某些实施方案中，包括去糖基化白蛋白的洗脱液可用低分子量过滤器过滤以浓缩该样品并洗掉盐类。在一些实施方案中，可采用
Figure G2006800531729D00511
10kDaMillipore滤器(Millipore Corporation，Bedford，Mass.)进行超滤。在某些实施方案中，所述重组白蛋白可用无菌水洗涤。在其它实施方案中，所述重组白蛋白可用0.9％的盐水(154mM NaCl)洗涤。在其它实施方案中，所述重组白蛋白可用无菌缓冲液洗涤。
在某些实施方案中，所述白蛋白溶液可浓缩至约5-250mg/ml总蛋白，相当于约0.5-25％白蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白溶液的终浓度含约5mg/ml、约10mg/ml、约20mg/ml、约40mg/ml、约80mg/ml、约120mg/ml、约150mg/ml、约175mg/ml、约200mg/ml、约225mg/ml、或约250mg/ml总蛋白。在一些实施方案中，所述白蛋白溶液含约0.5％、约1％、约2％、约4％、约8％、约12％、约15％、约17.5％、约20％、或约25％白蛋白。随后白蛋白样品可重新配制成期望的配方组合物。
去糖基化效率的确定可按照本领域公知的任何测量糖基化蛋白的方法进行。在一些实施方案中，所述去糖效率可通过本领域公知的可用于测量糖基化白蛋白的任何分析方法来确定。在一些实施方案中，糖基化白蛋白的测量采用果糖胺来进行，其方法如美国专利号5,866,352中描述，其内容全文以参考的方式并入本发明。果糖胺是由于葡萄糖和蛋白质氨基酸残基之间的非酶美拉德反应形成的。在一些实施方案中，糖基化白蛋白的测定通过硝基蓝四唑(NBT)比色法进行，如Mashiba等在Clin.Chim.Acta 212：3-15(1992)中描述。该方法基于在碱性溶液中NBT被糖基化蛋白质的酮胺部分还原的原理。在一些实施方案中，该糖基化白蛋白的测量通过酶联硼基免疫分析(HLBIA)进行，如Ikeda等在Clin.Chem.44(2)：256-63(1998)中描述的那样。所述方法取决于硼酸和被包埋于微量滴定孔板的抗白蛋白抗体捕捉的糖基化白蛋白的顺式二醇的相互作用。
5.7.6白蛋白去糖基化
在另一实施方案中，白蛋白去糖基化可通过酶法进行。所述酶可以是本领域技术人员公知能从蛋白质中除去糖类的任何酶。在一些实施方案中，所述酶为内切糖苷酶。在一些实施方案中，所述酶为内切糖苷酶D。在一些实施方案中，所述酶为内切糖苷酶H。在一些实施方案中，所述酶为内切糖苷酶F。在一些实施方案中，白蛋白的去糖基化通过白蛋白与多种内切糖苷酶接触来进行。通常，糖基化的白蛋白在本领域技术人员公知的适合除去糖类的条件下与去糖酶接触。上述条件包括，例如，将糖基化白蛋白和酶在适合的pH、适合的酶浓度、适合的温度和适合的时间下接触。在某些实施方案中，酶去糖基化可联合使用，随后进行如前所述的层析去糖基化步骤。
5.7.7阻断白蛋白非Cys34反应位点
如果需要，可进一步处理所述重组白蛋白以获得良好的偶联特异性，即减少非Cys34偶联物的形成。在一优选实施方案中，包含治疗基和反应基，更优选马来酰亚胺基的单一化合物与白蛋白、或其片段、变体、或衍生物的单一定义位点共价结合。在一具体优选实施方案中，与白蛋白结合的单一位点为Cys34巯基。因而，在某些实施方案中，非Cys34白蛋白偶联物的形成可通过阻断白蛋白上其它潜在的反应位点来减少。
在一些实施方案中，所述重组白蛋白可与试剂接触，该试剂化学阻断已知在人血清白蛋白上形成共价加合物形成的残基。本领域公知的能阻断白蛋白Cys34之外反应位点的试剂均可使用。在一些实施方案中，该试剂阻断赖氨酸残基。白蛋白含52个赖氨酸残基，其中25-30个位于白蛋白表面，其可用于进行偶联。因而，在一些实施方案中，该试剂阻断本领域技术人员公知的任何具有潜力形成共价加合物的赖氨酸残基。在一些实施方案中，所述化合物阻断了白蛋白Lys71。在一些实施方案中，所述化合物阻断了白蛋白Lys199。在一些实施方案中，所述化合物阻断了白蛋白Lys351。在一些实施方案中，所述化合物阻断了白蛋白Lys525。在一些实施方案中，所述化合物阻断了白蛋白Lys541。
在某些实施方案中，白蛋白的非Cys34反应位点通过与非甾体抗炎药(NSAID)接触来阻断。在一些实施方案中，白蛋白的非Cys34反应位点通过与乙酰水杨酸接触来阻断。在一些实施方案中，所述重组白蛋白在白蛋白Lys71可充分乙酰化的条件下与乙酰水杨酸接触。参见，Gambhir等，J.Bio.Chew.250(17)：6711-19(1975)。在一些实施方案中，所述重组白蛋白在白蛋白Lys199可充分乙酰化的条件下与乙酰水杨酸接触。参见Walker，FEBS Lett.66(2)：173-5(1976)。
在一些实施方案中，白蛋白非Cys34反应位点通过与萘普生酰基辅酶A(萘普生-CoA)接触来阻断。在一些实施方案中，所述重组白蛋白在白蛋白Lys199、Lys351、或Lys541、或其组合可充分酰化的条件下与萘普生-CoA接触。参见Olsen等Anal.Biochem.312(2)：148-56(2003)。
在一更优选实施方案中，白蛋白非Cys34反应位点通过与白蛋白表面特定位点具有高亲和力，但不会在白蛋白表面形成共价加合物的分子接触而被阻断。在一些实施方案中，非Cys34反应位点具有更少的反应性，即更少的亲核性，其通过在有助于限制非Cys34反应性的缓冲液中，例如，使用低于中性pH值的缓冲液，即3＜pH＜7，配制血清白蛋白或重组白蛋白来实现。
5.8白蛋白与治疗性化合物的偶联
在本发明的另一方面，形成偶联物的方法包括：将白蛋白与包括治疗基和反应基的化合物，在所述反应基能与白蛋白Cys34巯基共价结合的反应条件下接触以形成偶联物。在一些实施方案中，所述偶联反应可在任何包括白蛋白的液体培养基中进行。
在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在表达重组白蛋白的转基因非人类动物的血液、乳汁、或尿液中，与化合物接触。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在转化生产重组白蛋白的任何宿主细胞，例如，动物细胞、植物细胞、细菌细胞、或酵母细胞的粗品或澄清裂解液中，与化合物接触。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在产生重组白蛋白的宿主有机体的培养基中，其中重组白蛋白分泌其中，与化合物接触。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中，例如通过前文描述的任何层析方法、或其组合纯化得到的溶液中，与所述化合物接触。在一些实施方案中，所述白蛋白在血清白蛋白溶液中与化合物接触。
在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白被去糖基化。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中白蛋白的非Cys34反应位点已被共价或非共价阻断。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集和去糖基化。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集、且非Cys34反应位点已被共价或非共价阻断。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白进行了去糖基化、且非Cys34反应位点已被共价或非共价阻断。在一些实施方案中，所述白蛋白在足以形成偶联物的条件下，在纯化的白蛋白溶液中与所述化合物接触，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集、去糖基化、且非Cys34反应位点已被共价或非共价阻断。
通常，有利于重组白蛋白Cys34巯基与化合物反应基共价结合的反应条件包括适合的pH。尽管不倾向于任何特定理论的限制，人们相信在pH低于3.0条件下，人血清白蛋白展开并变性为伸长的无规卷曲。从而，在某些实施方案中，所述重组白蛋白在pH至少3.0条件下与所述化合物接触。在一些实施方案中，所述重组白蛋白在低至中性pH值条件下与所述化合物接触。在具体的实施方案中，所述pH在约4.0和7.0之间。在一些实施方案中，该pH在约4.0和5.0之间。在一些实施方案中，所述pH在约5.0和6.0之间。在一些实施方案中，所述pH在约6.0和7.0之间。在一些实施方案中，所述pH为约3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、或7.0。
导致形成偶联物的有利反应条件还包括适合的温度。偶联的合适温度将根据重组白蛋白制剂的相对纯度而不同。在具体的实施方案中，当所述重组白蛋白在含有或不含宿主有机体的培养基、或在宿主有机体的粗品或澄清裂解液中与所述化合物接触时，该反应可在约34-40℃、约35-39℃、或约36-38℃下进行。在一具体实施方案中，所述重组白蛋白在约37℃下与所述化合物接触。在其它实施方案中，当偶联反应在纯化的重组白蛋白溶液，例如通过前文描述的任何层析方法、或其组合纯化得到的重组白蛋白溶液中进行，该反应可在约17-25℃、约18-24℃、或约19-23℃下进行。在一些实施方案中，该反应在约20-25℃下进行。在一具体实施方案中，当偶联反应在纯化的白蛋白溶液中进行时，反应在约20-25℃且不高于该温度下进行。在另一实施方案中，反应可在低温条件下进行，即约+1℃-+8℃。该反应比在高温下更慢，但可得到对Cys34特异性更高的白蛋白偶联产物。
导致形成偶联物的有利的反应条件还包括合适的反应时间。在某些实施方案中，所述重组白蛋白与所述化合物接触至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。在一具体实施方案中，所述重组白蛋白与所述化合物接触至少30分钟。在一些实施方案中，所述重组白蛋白与所述化合物接触约1-60分钟、约5-55分钟、约10-50分钟、约20-40分钟、或约25-35分钟。
在其它实施方案中，所述重组白蛋白与所述化合物接触至少0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或24小时。在一些实施方案中，所述重组白蛋白与所述化合物接触至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、或20天。
导致形成偶联物的有利的反应条件还包括溶液中反应物合适的化学剂量比。溶液中白蛋白的值可根据现有技术公知的任何方法确定，例如SDS-PAGE；白蛋白特异酶联免疫测定(ELISA)；吸光度测定(280nm，205nm)；比色测定，如Lowry测定、Bradford测定、Bicinchoninic测定；凯氏法等。通常，化合物和白蛋白的最终摩尔比将根据化合物与白蛋白接触的溶液的相对纯度、以及进行接触的白蛋白的纯度而不同。例如，当所述化合物加入到含完整或裂解的宿主细胞的溶液中，宿主蛋白质和抗原可与重组白蛋白竞争结合到化合物的反应基上，因而相对于白蛋白需要更高摩尔量的化合物。在其它实施方案中，当所述化合物加到白蛋白的纯化制剂中，例如白蛋白被去帽、去糖基化、和/或在非Cys34反应位点被阻断，相对于白蛋白可需要较低摩尔量的化合物。因而，在一些实施方案中，该偶联反应可包括，相对于白蛋白而言含更高摩尔浓度的化合物的溶液。在一些实施方案中，该偶联反应包括含有与白蛋白相同摩尔浓度的溶液。在具体的实施方案中，该偶联反应包括含比白蛋白摩尔浓度低的化合物的溶液。
在一些实施方案中，所述白蛋白在化合物与白蛋白最终摩尔比为约0.1∶1到约10,000∶1的溶液中与所述化合物接触。在一些实施方案中，最终摩尔比为约7500∶1、5000∶1、约2500∶1、约1000∶1、约750∶1、约500∶1、约250∶1、约100∶1、约75∶1、约50∶1、约25∶1、约10∶1、约7.5∶1、约5∶1、约2.5∶1、或约1∶1。
在一些实施方案中，该最终摩尔比介于约0.1∶1到1∶1。在一些实施方案中，该最终摩尔比为约0.1∶1、0.2∶1、0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1、0.8∶1、0.9∶1。在一具体实施方案中，化合物与白蛋白的最终摩尔比为约0.7∶1。
在具体的实施方案中，当化合物为粉末状时，在加入进行偶联反应之前所述化合物可用无菌水溶解。在其它实施方案中，所述化合物可溶解于缓冲溶液，更适宜的其pH不高于9.0。在一优选实施方案中，该溶解的化合物在足以形成偶联物的条件下，通过滴加所述化合物进入白蛋白溶液与白蛋白接触。
5.9偶联物纯化
根据本文所述方法形成的包含偶联物的溶液可通过下述方法纯化，从而从宿主蛋白质、抗原、内毒素、颗粒物、还原剂、修饰酶、盐、未结合的化合物、加帽的或去帽的未结合的白蛋白、或聚合物的单体或二聚体、和/或聚集物形式中分离出所述偶联物的单体形式。
因而，在一些实施方案中，包含在含宿主有机体的培养基中形成的偶联物的溶液，其中重组白蛋白由宿主有机体分泌，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，包含在培养基上清液中形成的偶联物的溶液，其中所述重组白蛋白由宿主有机体分泌，且在偶联之前所述宿主有机体从培养基中分离，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，包含在澄清裂解液中形成的偶联物的溶液，其中所述重组白蛋白在细胞内产生，且在偶联反应之前所述宿主有机体被裂解并从培养基中分离，其可根据下述步骤纯化。
在一些实施方案中，包含在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物的溶液可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了去糖基化，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白在非Cys34反应位点被阻断，其可根据下述步骤纯化。
在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集和去糖基化，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了去糖基化并且非Cys34反应位点被阻断，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集且非Cys34反应位点被阻断，其可根据下述步骤纯化。在一些实施方案中，在由宿主细胞生产的重组白蛋白的纯化溶液中形成的偶联物，其中所述白蛋白进行了巯基白蛋白富集、去糖基化、和非Cys34反应位点被阻断，其可根据下述步骤纯化。
在优选实施方案中，偶联产物可采用疏水相互作用层析纯化。在一些实施方案中，根据本领域技术人员判断能结合白蛋白的任何疏水性树脂均可使用。在一些实施方案中，所述疏水性树脂可以是辛基琼脂糖凝胶、丁基琼脂糖凝胶、或苯基琼脂糖凝胶、或其组合。在优选实施方案中，所述纯化包括2步纯化，随后可选择地进行超滤。
在一些实施方案中，偶联物的HIC纯化包括首先用苯基琼脂糖凝胶的流动经过(flow through)步骤从溶液中除去未结合的化合物。在具体的实施方案中，该流动经过步骤在偶联反应之后立即进行，从而限制非Cys34白蛋白偶联物的形成。苯基琼脂糖凝胶树脂在低盐例如5mM硫酸铵、或5mM硫酸镁、或5mM硫酸铵、或5mM辛酸钠，中性pH(例如，pH 7.0的磷酸盐缓冲液)中平衡。在一些实施方案中，平衡缓冲液的电导率设在5.8mS/cm。在这些条件下，未偶联的化合物结合于树脂，而大部分化合物-白蛋白偶联物流出，并可在5-6倍柱体积内洗脱。
从所述苯基琼脂糖凝胶层析柱洗脱后，所述流出液可选择性地进行温和降解步骤，以进一步减少非Cys34白蛋白偶联产物量。所述降解可在进行进一步纯化之前，在室温和中性pH下温育该流出液7天来实现。在一些实施方案中，在进行第二步的疏水相互作用层析步骤前，所述苯基琼脂糖凝胶流出液可在室温下温育1、2、3、4、5、6、或7天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育1天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育2天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育3天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育4天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育5天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温下温育6天。在一些实施方案中，所述苯基琼脂糖凝胶流出液在室温和中性pH下温育7天。
在具体的实施方案中，在温和降解步骤之后，所述苯基琼脂糖凝胶流出液可在与第一次相同的条件下，进行第二次苯基琼脂糖凝胶流动经过步骤，例如5mM硫酸铵、或5mM硫酸镁、或5mM硫酸铵、或5mM辛酸钠，pH7.0；电导率5.8mS/cm，以从该降解步骤中除去未偶联的化合物分子。
在苯基琼脂糖凝胶层析后，所述流出液进行包括与丁基琼脂糖凝胶树脂接触的第二疏水相互作用层析。采用丁基琼脂糖凝胶疏水相互作用层析纯化白蛋白偶联物的方法在美国专利申请号11/112,277中描述，其内容以全文参见的形式并入本发明。所述纯化步骤从游离的未结合的白蛋白、二聚白蛋白、其它未结合的化合物、和聚集形式的偶联物中分离出单体化合物-白蛋白偶联物。在一些实施方案中，丁基琼脂糖凝胶树脂可在设定中性pH，750mM硫酸铵、5mM辛酸钠(例如pH 7.0的磷酸盐缓冲液)中平衡。在加样并结合于树脂后，化合物-白蛋白偶联物单体的分离可通过线性的或逐步的、或者其组合的递减的盐梯度来实现。例如，单体化合物-白蛋白偶联物可通过与包含0-750mM(NH4)2SO4的溶液接触来洗脱。
在一些实施方案中，未偶联的白蛋白可通过与包含约750mM(NH4)2SO4，电导率为118mS/cm的溶液接触来洗脱。在一些实施方案中，二聚未偶联白蛋白可通过与含约550mM(NH4)2SO4，电导率为89mS/cm的溶液接触洗脱。
在一些实施方案中，偶联的白蛋单体可通过与含约50到150mM(NH4)2SO4溶液接触洗脱。在一些实施方案中，偶联的白蛋单体可通过与含约75到125mM(NH4)2SO4溶液接触洗脱。在一些实施方案中，偶联的白蛋单体可通过与含约100mM(NH4)2SO4，电导率为21mS/cm的溶液接触洗脱。
在一些实施方案中，所述偶联物在HIC纯化后，可通过超滤进行脱盐和浓缩，例如通过使用
Figure G2006800531729D00611
超离心(30kDa)过滤装置(Millipore Corporation，Bedford，Mass.)。在一些实施方案中，所述偶联物可重新配制成期望的配方组合物。在其它实施方案中，通过将所述偶联物溶液浸入液氮并冻干所述偶联物，且在-20℃保存，所述偶联物被制备用于长期保存。
6.实施例
本发明通过下述不倾向于以任何方式限制的实施例进行说明。下述实施例的层析方法使用AKTA纯化器进行(Amersham Biosciences，Uppsala，Sweden)。
6.1实施例1：毕赤酵母表达的重组白蛋白的纯化
本实施例阐述了通过不同层析方法对毕赤酵母表达的重组白蛋白的纯化。重组白蛋白按照生产商的说明书，采用毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)来表达。
6.1.1DEAE琼脂糖凝胶：弱阴离子交换层析
毕赤酵母表达的重组白蛋白的纯化在用pH 7.0、10mM磷酸盐缓冲液中平衡的DEAE琼脂糖凝胶层析柱中进行。采用如下递增的盐梯度(50ml柱体积，2ml/min流动速率)：超过5倍柱体积的66mM磷酸钠；超过2倍柱体积的66mM磷酸钠；超过0倍柱体积的200mM磷酸钠；超过1倍柱体积的200mM磷酸钠；pH 8.0，20mM Tris-HCl缓冲液和2M NaCl中再生。图1中随着渐增的磷酸钠梯度纯化的白蛋白片段被分部分洗脱。
6.1.2Q琼脂糖凝胶：强阴离子交换层析
毕赤酵母表达的人重组白蛋白的纯化在用pH 8.0，20mM Tris HCl缓冲液平衡的Q琼脂糖凝胶层析柱中进行。采用如下递增的盐梯度(50ml柱体积，2.5ml/min流动速率)：超过8倍柱体积的1M NaCl；超过0倍柱体积的2M NaCl；超过2倍柱体积的2M NaCl。图2中所述纯化的白蛋白部分在0到1MNaCl渐增的NaCl梯度中洗脱。
6.1.3Hitrap Blue：亲和层析
毕赤酵母表达的人重组白蛋白的纯化在用pH 8.0，20mM Tris HCl中平衡的HiTrapTM Blue HP(GE Healthcare，Piscataway，NJ)层析柱中进行。采用如下递增的盐梯度(5ml柱体积，2.5ml/min流动速率)：超过2倍柱体积的1MNaCl；超过0倍柱体积的2M NaCl；超过1倍柱体积的2M NaCl。图3中所述纯化的白蛋白部分在0到2M NaCl渐增的NaCl梯度中洗脱。
6.1.4苯基琼脂糖凝胶：疏水相互作用层析
毕赤酵母表达的人重组白蛋白的纯化在用pH 7.0，20mM磷酸钠、5mM辛酸钠和750mM(NH4)2SO4中平衡的苯基琼脂糖凝胶层析柱中进行。采用如下递减的盐梯度(5ml柱体积，5ml/min流动速率)：超过2倍柱体积的20mM磷酸钠、5mM辛酸钠；超过1倍柱体积的水进行洗涤；超过1倍柱体积的20％的乙醇；以及超过1倍柱体积的水。图4中所述纯化的白蛋白部分在750到0M(NH4)2SO4递减的梯度中洗脱。
6.2实施例2：巯基白蛋白富集后重组白蛋白的纯化
本实施例阐述了采用苯基琼脂糖凝胶疏水相互作用层析纯化毕赤酵母表达的和富集了巯基白蛋白的重组白蛋白。重组白蛋白(0.2％终浓度)在4℃下用74mM巯基乙酸在250mM Tris-乙酸缓冲液中处理20小时。纯化在用pH7.0，20mM磷酸钠、5mM辛酸钠和750mM(NH4)2SO4中平衡的苯基琼脂糖凝胶层析柱中进行。采用如下递减的盐梯度(5ml柱体积，5ml/min流动速率)：超过2倍柱体积的20mM磷酸钠、5mM辛酸钠；超过1倍柱体积的水进行洗涤；超过1倍柱体积的20％的乙醇；以及超过1倍柱体积的水。图5中，所述纯化的白蛋白部分在750到0M(NH4)2SO4递减的梯度中洗脱。收集F2并用Amicon 10kDa微孔过滤器浓缩并用注射用水(WFI)洗涤4次。
6.3实施例3：去糖基化后重组白蛋白的纯化
本实施例阐述了用氨基-苯基硼酸和伴刀豆球蛋白A作为配体通过亲和层析对人血清白蛋白的去糖基化。层析在AKTA纯化装置(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)中进行。
6.3.1采用琼脂糖的氨基-苯基硼酸层析
包括琼脂糖(Sigma，St.Louis，MO)的氨基-苯基硼酸树脂用pH 8.5，4倍柱体积的0.25M的乙酸铵、0.05MgCl2(0.5ml/min流动速率)冲洗和平衡。25％的人血清白蛋白溶液(Cortex Biochem，San Leandro，CA)在平衡缓冲液中以1∶2稀释并装柱。收集流出液(F3)并用4倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。以3倍柱体积的pH 8.5、0.1M Tris与0.2M山梨醇进行洗脱并收集于F2。F3和F2用Amicon 10kDa微孔过滤器浓缩并用注射用水(WFI，AbbottLaboratories，Abbott Park，IL)洗涤4次。所述层析柱用5倍柱体积的pH 9.8、0.1M硼酸盐缓冲液、1M NaCl；5倍柱体积pH 9.8、0.1M硼酸盐缓冲液，5倍柱体积的水，和5倍柱体积的2M NaCl再生。代表性的色谱图如图6所示。
6.3.2伴刀豆球蛋白A(Con A)层析
Con A树脂(Amersham，Piscataway，NJ)用4倍柱体积的pH 6.0、0.1M乙酸盐缓冲液、1MNaCl、1mM MgCl2，1mM MgCl2、1mM CaCl2(2ml/min流动速率)洗涤和平衡。20％的重组人血清白蛋白溶液(中国北方药业公司，石家庄，中国)在平衡缓冲液中以1∶2稀释并装柱。收集流出液(F3)并用4倍于柱体积的平衡缓冲液洗涤层析柱。洗脱以3倍柱体积的平衡缓冲液以及0.1M葡萄糖和0.1M甘露糖进行，并收集于F2。F3和F2用Amicon 10kDa微孔过滤器浓缩并用注射用水(WFI，Abbott Laboratories，Abbott Park，IL)洗涤4次。该层析柱用5倍柱体积pH 9.8、0.1M硼酸盐缓冲液；1M NaCl；5倍柱体积的水；5倍柱体积pH 8.5、0.1M硼酸盐缓冲液；和5倍柱体积的pH4.5、0.1M硼酸盐缓冲液再生。代表性的色谱图如图7所示。
6.4实施例4：化合物-白蛋白偶联物单体的纯化
毕赤酵母表达的重组白蛋白在如前述实施例2中所描述的那样进行纯化并用巯基乙酸处理，并在与CJC-1134(包括反应基MPA的Exendin-4)偶联之前通过苯基琼脂糖HIC纯化。所述偶联反应包括35μl的10mM CJC-1134与175μl巯基白蛋白富集的白蛋白以最终摩尔比为0.7∶1结合。所述反应在37℃下进行30分钟，然后保存在4℃下用于液相色谱/质谱分析，并通过丁基琼脂糖凝胶HIC纯化。
图8显示了在CJC-1134和重组白蛋白偶联之后，加样至第一苯基琼脂糖凝胶流出柱之前的未结合的CJC-1134的HPLC色谱图。未结合的CJC-1134的保留时间为8.2分钟，而CJC-1134-白蛋白偶联物则在12分钟之后。
对于第一HIC，苯基琼脂糖凝胶在5mM辛酸钠和5mM硫酸铵组成的20mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中预平衡。直接加样偶联反应产物至树脂可在流出物中观察到蛋白质(白蛋白和偶联白蛋白)与未结合的CJC-1134的物理分离。因此，上述树脂的容量主要保留给包含反应部分的未结合化合物。代表性的色谱如图9所示。
图10显示了在CJC-1134和重组白蛋白偶联之后，加样至第一苯基琼脂糖凝胶流出柱之后的未结合的CJC-1134的HPLC色谱图。未结合的CJC-1134的保留时间为8.2分钟，而CJC-1134-白蛋白偶联物则在12分钟之后。因而，未结合的CJC-1134可有效地从偶联反应产物池中分离。
对于第二HIC，丁基琼脂糖凝胶树脂在pH 7.0，20mM磷酸钠盐缓冲液，5mM辛酸钠，750mM(NH4)2SO4中平衡。采用如下递减的盐梯度(5ml柱体积，2.5ml/min流动速率)：超过4倍柱体积的pH 7.0，20mM磷酸，5mM辛酸钠；1倍柱体积的水洗涤；超过1倍柱体积的20％乙醇；和超过1倍柱体积的水。F2被收集并用Amicon 10kDa微孔过滤器浓缩且用WFI洗涤4次。图11显示了沿梯度不同点洗脱的3种不同类型：约750mM(NH4)2SO4，相当于未偶联的白蛋白；约550mM(NH4)2SO4，相当于二聚未偶联的白蛋白；和约100m(NH4)2SO4，相当于偶联白蛋白单体。
在重组白蛋白和含GLP-1以及反应基MPA的化合物之间也观察到成功的偶联。图12显示了在DAC-GLP-1(CJC-1131)和rHA偶联后，加样至苯基琼脂糖凝胶流出柱前观察到的未结合的DAC-GLP-1(CJC-1131)的HPLC色谱图。未结合的CJC-1131的保留时间为27.5分钟，而白蛋白偶联物在50分钟后。
对于第一HIC，苯基琼脂糖凝胶在5mM辛酸钠和5mM硫酸铵组成的20mM磷酸钠盐缓冲液(pH 7.0)中预平衡。直接加样偶联反应产物至树脂能在流出液中观察到蛋白质(白蛋白和偶联的白蛋白)与非偶联DAC-GLP-1(CJC-1131)的物理分离，如图13所示。图14显示了在DAC-GLP-1(CJC-1131)和重组白蛋白偶联反应之前，并加样该偶联反应产物至苯基琼脂糖凝胶流出柱之后的非偶联的DAC-GLP-1的HPLC色谱图。未结合的CJC-1131的保留时间为27.5分钟，而白蛋白偶联物在46分钟后。因而，未结合的CJC-1131被有效的从所有蛋白质中分离。具有20.5分钟保留时间的峰值对应于辛酸。
GLP-1白蛋白偶联物还进行SDS-PAGE和Western印迹分析。简要地，在上述偶联反应之后，约20μg物质在Laemmli 3×缓冲液中稀释，煮沸3分钟，并加样至8％聚丙烯酰胺-双丙烯酰胺凝胶中。蛋白质在非还原条件下迁移。在转移到硝酸纤维素膜后(恒定电流；100mA/凝胶1小时(2mA/cm2))，用丽春红进行膜染色和用TBS完全脱色；膜置于0.05％Tween20、Tween20中的5％的牛奶在4℃下过夜饱和，然后用0.05％Tween20洗涤3次，置于Tween20中10分钟，随后用红考马斯亮蓝染色并用30％MeOH、10％的乙酸完全脱色。白蛋白的免疫检测采用与HRP-标记的山羊抗体抗人白蛋白(GAHu/Alb/PO，Nordic immunology，批号5457)在室温下温育1小时。GLP-1的免疫检测采用与兔抗GLP-1抗体温育1小时，随后与HRP-标记的山羊抗兔抗体在室温下温育1小时进行。膜随后用TBS-0.05％Tween20在10分钟内洗涤3遍。用ECL进行信号检测(Aersham Pharmacia Biotech，RPN 2209)。
图15和图16分别显示了未偶联的重组白蛋白(道3)和GLP-1白蛋白偶联反应的反应产物(道4)的考马斯染色和抗白蛋白Western印迹。在偶联之后相对于未偶联的白蛋白，观察到更高分子量的种类，其代表了GLP-1-白蛋白偶联种类单体和聚合物。
图17和图18分别是在如上所述的GLP-1和重组人白蛋白之间的偶联反应之后，纯化不同阶段的片段的考马斯染色和抗GLP-1Western印迹。样本加样如下：
(1)rHA
(2)预纯化
(3)苯基F8
(4)丁基F3 750mM(NH4)2SO4
(5)丁基F5 550mM(NH4)2SO4
(6)丁基F6A 100mM(NH4)2SO4，在PC 200-2000mAU之前
(7)丁基F6B 100mM NH4)2SO4 PC WFI
(8)丁基F6B 100mM(NH4)2SO4 PC乙酸
(9)标准
6.5实施例4：在培养基中偶联至白蛋白
重组白蛋白按照生产商的说明书，采用毕赤酵母表达试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，Calif)进行表达。在28-30℃下进行3天白蛋白表达并分泌到培养基上清液中后，离心100ml的发酵液从而从粗制上清液中物理分离出宿主细胞。然后所述粗制上清液用
Figure G2006800531729D00681
离心管(MW截断点＝10kDa)浓缩至20-100mg/ml终蛋白浓度(如使用标准BCA方法来估计)，然后进行液相色谱-电喷雾质谱分析(LC-EMS)。在第3天，通过直接加入由宿主细胞组成的发酵液，在最终摩尔比为1000倍DAC-GLP-1(CJC-1131)比白蛋白的情况下进行偶联反应。
在偶联反应之前和之后的LC-EMS数据显示没有相应于巯基白蛋白的MW范围的种类被检测到。1000倍的CJC-1131(DAC-GLP-1；Mw＝3,721Da)被直接加入培养基发酵液中(由宿主细胞组成)，并允许在25℃下反应60分钟。反应后，通过离心，从粗制上清液中物理分离出宿主细胞。该粗制上清液进一步采用
Figure G2006800531729D00682
离心管(Mw截断点＝10kDa)浓缩至20-100mg/ml的终浓度，随后进行LC-EMS分析。总质量为70,160-70,170的蛋白质种类将对应于GLP-1-白蛋白偶联物的产生。然而，在偶联反应后，未观察到可检的上述大小的质量。
当在还原试剂，如L-半胱氨酸被去除或耗尽的条件下，进行重组白蛋白的表达和分泌，可成功地在培养基中进行偶联。此外，由于白蛋白Cys34残基易于氧化，重组白蛋白的分泌可在更严格的通风条件下进行。通过非限制性实施例的方式，上述发酵条件可有利于偶联物在培养基中的形成。
正如同每一单独的出版物、专利或专利申请被特别地及个别地指出以引用的方式并入本发明，所有在本说明书中引用的出版物、专利和专利申请均以引用的方式并入本文。尽管为了更清楚理解的目的，上述发明已经通过附图和实施例的方式进行了一些详细的描述，本领域普通技术人员应该明确根据本发明的教导所作的某些变化和修改并不超出所附权利要求书的主旨或范围。

Claims (43)

1.一种偶联物的制备方法，所述偶联物包含与化合物共价连接的白蛋白，所述方法包括采用第一次疏水相互作用层析，随后进行第二次疏水相互作用层析来纯化所述偶联物，
其中，所述化合物包括反应基，所述偶联物是在所述反应基能与白蛋白的半胱氨酸34巯基共价结合形成偶联物的条件下，通过将溶液中的白蛋白与化合物接触在该溶液中形成的；
其中，所述第一次疏水相互作用层析为苯基琼脂糖凝胶层析，所述苯基琼脂糖凝胶层析包括在5mM辛酸钠和5mM硫酸铵组成的pH7.0、20mM磷酸钠缓冲液中预平衡；并且
其中，所述第二次疏水相互作用层析为丁基琼脂糖凝胶层析，所述丁基琼脂糖凝胶层析包括：
a.在pH7.0，20mM磷酸钠盐缓冲液，5mM辛酸钠，750mM硫酸铵中平衡丁基琼脂糖凝胶树脂；
b.将该丁基琼脂糖凝胶树脂与包含所述偶联物的溶液接触；和
c.运用从750-0mM硫酸铵的递减的盐梯度从非单体白蛋白种类中分离单体偶联白蛋白种类。
2.根据权利要求1的方法，进一步包括用超滤进一步纯化所述偶联物的步骤。
3.根据权利要求1的方法，进一步包括采用选自离子交换层析、亲和层析、和尺寸排阻层析的方法进一步纯化所述偶联物的步骤。
4.根据权利要求1的方法，其中所述溶液包括宿主有机体分泌重组白蛋白于其中的培养基。
5.根据权利要求4的方法，其中在所述白蛋白与所述化合物接触之前，将所述培养基与所述宿主有机体分离。
6.根据权利要求1的方法，其中所述溶液为生产重组白蛋白的宿主有机体的裂解液。
7.根据权利要求1的方法，其中所述溶液包括采用疏水相互作用层析纯化的重组白蛋白。
8.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为巯基白蛋白-富集的白蛋白。
9.根据权利要求8的方法，其中巯基白蛋白通过白蛋白与巯基乙酸接触进行富集。
10.根据权利要求8的方法，其中巯基白蛋白通过白蛋白与二硫苏糖醇接触进行富集。
11.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为去糖基化白蛋白。
12.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为巯基白蛋白富集的去糖基化白蛋白。
13.根据权利要求11或12的方法，其中所述白蛋白通过氨基苯基硼酸琼脂糖亲和层析去糖基化。
14.根据权利要求11或12的方法，其中所述白蛋白通过伴刀豆球蛋白A琼脂糖凝胶亲和层析去糖基化。
15.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括在20℃到25℃的反应温度。
16.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括至少30分钟的反应时间。
17.根据权利要求1的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.1∶1至1∶1的化合物与重组白蛋白的最终摩尔比。
18.根据权利要求17的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.5∶1至0.9∶1的化合物与白蛋白的最终摩尔比。
19.根据权利要求17的方法，其中所述形成偶联物的条件包括0.7∶1的化合物与白蛋白的最终摩尔比。
20.根据权利要求1的方法，其中所述化合物包括氨基酸、肽、蛋白质、有机分子、RNA或DNA。
21.根据权利要求1的方法，其中所述化合物低于30kDa。
22.根据权利要求1的方法，其中所述化合物为胰岛素、心钠肽、脑钠肽、肽YY、生长激素释放因子、胰高血糖素样肽-1、exendin-3或exendin-4。
23.根据权利要求22的方法，其中所述化合物为GLP-1。
24.根据权利要求22的方法，其中所述化合物为exendin-3。
25.根据权利要求22的方法，其中所述化合物为exendin-4。
26.根据权利要求1的方法，其中所述反应基为Michael受体、含琥珀酰亚胺基的基团、含马来酰亚胺基的基团或者亲电子巯基受体。
27.根据权利要求1的方法，其中所述反应基为含马来酰亚胺基的基团。
28.根据权利要求1的方法，其中所述反应基为马来酰亚胺基-丙酸。
29.根据权利要求1的方法，其中所述反应基为半胱氨酸残基。
30.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为重组血清白蛋白。
31.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白为重组人血清白蛋白。
32.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白与肽融合。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述肽为胰高血糖素样肽1，exendin3、或exendin-4。
34.根据权利要求1的方法，其中所述偶联物如下所示：
Figure FDA00002898083600051
其中所述蛋白质为白蛋白且X为半胱氨酸34的S。
35.根据权利要求1的方法，其中所述偶联物如下所示：
Figure FDA00002898083600052
其中蛋白质为白蛋白且X为半胱氨酸34的S。
36.根据权利要求1的方法，其中所述白蛋白通过宿主有机体制备。
37.根据权利要求36的方法，其中所述宿主为被转化以表达重组白蛋白的酵母菌株。
38.根据权利要求37的方法，其中所述酵母选自酿酒酵母、毕赤酵母、乳酸克鲁维酵母、Arxula adeninivorans、和多形汉逊酵母。
39.根据权利要求36的方法，其中所述宿主为被转化以表达重组白蛋白的细菌。
40.根据权利要求39的方法，其中所述细菌为大肠杆菌。
41.根据权利要求36的方法，其中所述宿主为表达重组白蛋白的转基因植物。
42.根据权利要求36的方法，其中所述宿主为表达重组白蛋白的转基因动物。
43.根据权利要求1的方法，其中所述重组蛋白通过由编码白蛋白、或其变体或衍生物的载体转化的哺乳动物细胞来制备。
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