CN108840922A - 分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法,包括如下步骤:用洗脱液平衡色谱柱后,将含有白蛋白结合物和非结合的小分子化合物混合溶液上样至色谱柱;用洗脱液冲洗色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集含白蛋白结合物的冲洗液,当UV吸光度降至基线水平时停止收集;用纯化水冲洗色谱柱,当含游离的小分子化合溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含游离小分子化合物的冲洗液,当UV吸光度降至基线水平时停止收集。从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离游离小分子化合物,具有分离效果好,处理批量大的优点。解决了不能去除游离小分子化合物的缺点,克服了采用凝胶过滤层析方法处理批量小的缺陷。
Description
技术领域
本发明涉及用于从含有白蛋白非结合物及白蛋白结合物溶液中分离白蛋白非结合物及白蛋白结合物和游离小分子化合物的方法。
背景技术
白蛋白本身具有可生物降解、无毒、无抗原性、病人耐受和生物利用度高等特点,因此白蛋白受到生物医药领域的广泛关注。其中白蛋白载药技术应用比较广泛和成熟,白蛋白载药体系可改善药物的药代动力学特征,如延长药物半衰期,增强药物活性等。目前,已有多个药物采用相关技术上市,比如白蛋白纳米紫杉醇,索玛鲁肽等。
Conjuchem公司的药物亲和构建技术平台技术也是一种采用白蛋白偶联药物的技术平台,该平台是对母体药物进行结构修饰后与白蛋白的34位半胱氨酸残基(巯基)反应,由于并不是所有的白蛋白分子都含有34位半胱氨酸残基(巯基),因此在白蛋白和修饰后的小分子化合物耦合后需要去除未反应的游离白蛋白。CN1956998A 描述了纯化白蛋白结合物的方法,具体为一种用于通过疏水作用层析从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离白蛋白结合物的方法。CN1956998A具体是将含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液加样到用高含盐量的水性缓冲液平衡的疏水性填料上,通过降低盐的浓度梯度洗脱实现把含有白蛋白结合物与非结合白蛋白分离。
在白蛋白和小分子化合物结合反应后,除含有非结合白蛋白外,还会含有非结合的游离小分子化合物。CN1956998A只是有效地把白蛋白结合物和非结合物进行了分离,并不能把未反应的游离的小分子化合物去除。在含有小分子化合物的白蛋白溶液中,白蛋白的分子量是小分子化合物分子量的十几倍,因此本专业人员在分离小分子化合物时通常会根据分子量的较大差异,采用凝胶过滤层析的方法进行纯化,比如GE公司的superdex75或superdex200填料,采用凝胶过滤层析的方法虽然可以实现有效分离,但该采用该技术的缺点是上样量小,处理批量小。
发明内容
本发明提供一种用于从含有白蛋白非结合物及白蛋白结合物的溶液中将白蛋白非结合物及白蛋白结合物与非结合的小分子化合物分离的方法,以解决现有技术存在的问题。
为实现本发明目的,这种分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法,其特征在于包括如下步骤:
a. 用洗脱液平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱后,将含有白蛋白结合物和非结合的小分子化合物混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 用洗脱液持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的小分子化合溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含游离小分子化合物的冲洗液,当含游离小分子化合物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集。
所述洗脱液由磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠组成,所述洗脱液pH值为6.0,所述磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠之间的摩尔比为20:1~10:5。
所述小分子化合物为GLP-1类似物或胰岛素。
根据物质与固定在不带电的基质上的疏水性配体间疏水相互作用的不同强度而将其分离开来,初始洗脱液中的盐为中高浓度时,疏水相互作用层析填料上疏水配基与蛋白质以及氨基酸疏水表面相互作用。在纯水中,任何疏水效应都太弱而不能导致配基与蛋白或氨基酸之间的相互作用。然后,某些盐能增强疏水相互作用,加入这些盐可以导致疏水相互作用的结合(吸附)。对于选择性洗脱,盐浓度逐步的降低,样品组分会根据疏水性强弱依次洗脱。因此,疏水相互作用层析最终分离结果是如下几个因素交互作用的结果:暴露在表面的疏水氨基酸残基的多少和分布;填料的疏水性;样品的性质和组成;洗脱液中盐的浓度和种类。
当使用疏水相互作用层析时,某些盐能促进疏水相互作用的能力依赖于存在的离子种类和浓度。一种离子的洗脱能力用感胶离子序(Hofmeister series)来描述。
盐析效应
阴离子:PO4 3->SO4 2->CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-
离液序列高的效应
阳离子:NH4 +<Rb+<K+<Na+<Cs+<Li+<Mg2+<Ba2+
增加盐析效应可以增强疏水性相互作用,而增加离液序列高的效应则使之减弱。因此钠、钾或铵的硫酸盐能有效的促进疏水相互作用,并对蛋白质结构有一种稳定作用。因此,最常使用的盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化钾或醋酸铵。
在低浓度的硫酸铵条件下(1~10mM),由于疏水作用降低,因此基本上白蛋白非结合物及白蛋白结合物并不与配基结合。但在此条件下,游离的小分子多肽药物却与配基能牢固结合。因此,通过继续降低疏水作用而实现游离的小分子多肽药物的层析分离。
本发明取得的技术进步:
本发明通过疏水作用层析,从含有白蛋白结合物与非结合白蛋白的溶液中分离游离小分子化合物,具有分离效果好,处理批量大的优点。不仅有效解决了现有技术不能去除游离小分子化合物的缺点,而且也克服了采用凝胶过滤层析方法处理批量小的缺陷。
附图说明
图1为本发明实施例1苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
图2为本发明实施例2苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
图3为本发明实施例3苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
图4为本发明实施例4苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
图5为本发明实施例5苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
图6为本发明实施例6苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱。
具体实施方式
实施例1:
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,1mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将人血白蛋白和GLP-1类似物反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的GLP-1类似物的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,1mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的GLP-1类似物溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离GLP-1类似物的冲洗液,当含游离GLP-1类似物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,苯基琼脂糖凝胶色谱纯化图谱见图1,从图1可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离GLP-1),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
实施例2:本实施例与实施例1不同之处是,硫酸铵浓度由1mM调整为5mM。
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,5mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将白蛋白和GLP-1类似物反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的GLP-1类似物的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,5mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的GLP-1类似物溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离GLP-1类似物的冲洗液,当含游离GLP-1类似物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,色谱纯化图谱见图2,从图2可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离GLP-1),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
实施例3:本实施例与实施例1不同之处是,硫酸铵浓度由1mM调整为10mM。
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,10mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将白蛋白和GLP-1类似物反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的GLP-1类似物的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,10mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的GLP-1类似物溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离GLP-1类似物的冲洗液,当含游离GLP-1类似物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,色谱纯化图谱见图3,从图3可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离GLP-1),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
实施例4:本实施例与实施例1不同之处是,与白蛋白反应的小分子为胰岛素。
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,1mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将白蛋白和胰岛素反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的胰岛素的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,1mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的胰岛素溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离胰岛素的冲洗液,当含游离胰岛素溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,色谱纯化图谱见图4,从图4可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离胰岛素),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
实施例5:本实施例与实施例4不同之处是,硫酸铵浓度由1mM调整为5mM。
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,5mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将白蛋白和胰岛素反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的胰岛素的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,5mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的胰岛素溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离胰岛素的冲洗液,当含游离胰岛素溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,色谱纯化图谱见图5,从图5可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离胰岛素),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
实施例6:本实施例与实施例4不同之处是,硫酸铵浓度由1mM调整为10mM。
a. 将苯基琼脂糖凝胶色谱柱清洗消毒后,用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,10mM硫酸铵,5mM辛酸钠)2个柱体积平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱,然后将白蛋白和胰岛素反应结束后的含有白蛋白结合物和非结合的胰岛素的混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 上样后,继续用pH6.0低盐装样洗脱液(组成为20mM磷酸钠,10mM硫酸铵,5mM辛酸钠)持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集只含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的胰岛素溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含有游离胰岛素的冲洗液,当含游离胰岛素溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集,色谱纯化图谱见图6,从图6可看出,前面的大峰主要为白蛋白非结合物及白蛋白结合物,后面的小峰主要为游离小分子(游离胰岛素),两个峰的分离效果很好,从而实现了产品中游离小分子的去除。
Claims (3)
1.一种分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法,其特征在于包括如下步骤:
a. 用洗脱液平衡苯基琼脂糖凝胶色谱柱后,将含有白蛋白结合物和非结合的小分子化合物混合溶液上样至苯基琼脂糖凝胶色谱柱;
b. 用洗脱液持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当色谱柱中流出液体的UV吸光度达到10mAU时开始收集含白蛋白结合物的冲洗液,当色谱柱中流出液体的UV吸光度降至基线水平时停止收集;
c. 停止收集白蛋白结合物后,再用纯化水持续冲洗苯基琼脂糖凝胶色谱柱,当含游离的小分子化合溶液的UV吸光度达到10mAU时开始收集含游离小分子化合物的冲洗液,当含游离小分子化合物溶液的UV吸光度降至基线水平时停止收集。
2.根据权利要求1所述的分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法,其特征在于所述洗脱液由磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠组成,所述洗脱液pH值为6.0,所述磷酸钠、硫酸铵、辛酸钠之间的摩尔比为20:1~10:5。
3.根据权利要求1所述的分离白蛋白非结合物、白蛋白结合物和小分子化合物的方法,其特征在于所述小分子化合物为GLP-1类似物或胰岛素。
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