CN117024561B - 一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，涉及蛋白纯化技术领域。所述纯化方法包括：将PEG化IFN反应液吸附到平衡后的阳离子层析柱上，与离子交换填料上的活性基团相互作用，使得包括目的蛋白在内的反应液吸附在柱子上，利用与IFN偶联部位不同造成IFN裸露外部的电荷数及分布的不同以及其对阳离子交换剂的色谱行为的表现差异分离蛋白，并采用含有33‑80mM氯化钠的缓冲液冲洗层析柱，单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除，再用含有58‑100mM氯化钠的缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α‑2b的组分，最终采用较少的纯化层析步骤，即可获得较高纯度PEG‑IFN样品。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白纯化技术领域，具体而言，涉及一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法。
背景技术
干扰素（IFN）是一类具有抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖等多种生物活性的细胞因子，其中，干扰素α、β及其亚型具有抗病毒活性。由于IFN拥有良好的抗病毒、免疫调节作用，使得其在医药领域有广泛的应用，并且成为对抗未知病毒的首选药物之一。IFN是小分子蛋白，作为生物制剂具有起效快、靶向性、剂量低等优点；但是，也存在副作用较大、半衰期短等缺点。以治疗乙肝为例，治疗周期长达4-6个月，作为短效制剂，患者依存性低。因此，延长IFN血液半衰期，减少给药次数，具有重要临床价值。
PEG化IFN，即利用聚乙二醇（PEG）化学修饰IFN，可以增加IFN分子量、改善理化性质，是延长IFN半衰期的重要手段之一。一般是将PEG通过化学合成反应偶联到IFN某个氨基酸位点，通过色谱层析技术获得高纯度PEG化IFN。但由于化学反应条件的不同，使得反应液中含有单偶联PEG化IFN、多偶联副产物、未参与反应的底物、杂质等多种混合物，给后续的分离纯化带来诸多困难。
发明内容
本发明所要解决的问题是如何分离纯化聚乙二醇修饰的干扰素蛋白，获得单偶联PEG化IFN目的蛋白。
为解决上述问题，本发明提供一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，包括：
获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液；
用第一缓冲液平衡阳离子层析柱，将所述反应液上样，并再次平衡所述阳离子层析柱；
用第二缓冲液冲洗所述阳离子层析柱，其中，所述第二缓冲液为含有33-80mM氯化钠的第一缓冲液；
用第三缓冲液洗脱所述阳离子层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的阳离子洗脱液，其中，所述第三缓冲液为含有58-100mM氯化钠的第一缓冲液，且所述第二缓冲液中氯化钠的浓度小于所述第三缓冲液中氯化钠的浓度。
较佳地，所述阳离子层析柱所用填料为SP-HP填料，所述填料的配基密度为0.15-0.20mmol/mL，平均颗粒34μm。
较佳地，所述反应液与所述阳离子层析柱的体积比为5-10:1，所述反应液在所述阳离子层析柱中的流速为1-40mL/min。
较佳地，所述第一缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的pH为5.0±0.1，浓度为30mM。
较佳地，所述聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法还包括：
将所述阳离子洗脱液用3M硫酸铵浓储液调制硫酸铵终浓度为0.6M，得到第二洗脱液；
用第四缓冲液平衡疏水层析柱，将所述第二洗脱液上样，并再次平衡所述疏水层析柱，其中，所述第四缓冲液为含有0.6M硫酸铵的第一缓冲液；
用第五缓冲液冲洗所述疏水层析柱，其中，所述第五缓冲液为含有450mM硫酸铵的第一缓冲液；
用第六缓冲液洗脱所述疏水层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的第三洗脱液，其中，所述第六缓冲液为含有280mM硫酸铵的第一缓冲液，所述第三洗脱液中所述单偶联PEG化干扰素的纯度大于或等于98%。
较佳地，所述疏水层析柱所用填料为phenyl-HP填料，所述填料的配基密度为25μmol/mL，平均颗粒34μm。
较佳地，所述第二洗脱液与所述疏水层析柱的体积比为6:1，所述第二洗脱液在所述疏水层析柱中的流速为1-10mL/min。
较佳地，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM硼酸盐缓冲液；调节pH值为8.6-9.0；再加入mPEG2-NHS，其中，mPEG2-NHS与IFN-α2b的摩尔比为3：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应2小时；用1mol/L冰乙酸调节pH≤4.5，终止反应，得到所述反应液。
较佳地，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG2-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG2-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。
较佳地，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。
本发明的聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法相较于现有技术的优势在于：
本发明首先通过合成反应制备PEG化IFN，在第一缓冲液平衡条件下，将PEG化IFN反应液吸附到阳离子层析柱上，与离子交换填料上的活性基团即配基相互作用，使得包括目的蛋白（即单偶联PEG化IFN）在内的反应液吸附在柱子上，由于PEG整体不带电，局部显负电，IFN理论等电点为5.97，PEG与IFN偶联后，造成IFN表面电荷分布和极性发生变化，但由于PEG本身不带电，所以PEG-IFN与IFN等电点范围存在很大程度重叠，对PH值洗脱不敏感，而本发明选择阳离子层析柱，可避免PEG与阳离子层析柱的结合。由于IFN酸性条件下带正电，可与层析柱结合，且由于PEG与IFN的偶联对IFN电荷的遮挡作用，造成PEG化IFN与层析柱的结合力度与其他成分有很大差异，因此可以利用与IFN偶联部位不同造成IFN裸露外部的电荷数及分布的不同以及其对阳离子交换剂的色谱行为的表现差异，从而获取目的分子。又由于盐离子可以与产物竞争柱子上的活性基团，因此盐浓度越高，反应液与层析柱上的配基结合越不紧密，越容易被洗脱下来。因此，本发明先采用含有33-80mM氯化钠的缓冲液冲洗层析柱，单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除，再用含有58-100mM氯化钠的缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α-2b的组分，最终采用较少的纯化层析步骤，即可获得较高纯度PEG-IFN样品。
附图说明
图1为本发明实施例2中CM-FF纯化梯度洗脱色谱图；
图2为本发明实施例2中CM-FF纯化收集液的SDS-PAGE电泳图；
图3为本发明实施例2中SP-HP纯化梯度洗脱色谱图；
图4为本发明实施例2中SP-HP纯化收集液的SDS-PAGE电泳图-碘染色；
图5为本发明实施例2中SP-HP优化纯化条件的SDS-PAGE电泳图-碘染色；
图6为本发明实施例中聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法流程图；
图7为本发明实施例3中单偶联mPEG2-NHS化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-碘染色；
图8为本发明实施例3中单偶联mPEG2-NHS化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-考马斯亮蓝染色；
图9为本发明实施例4中单偶联mPEG2-pALD化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-碘染色；
图10为本发明实施例4中单偶联mPEG2-pALD化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-考马斯亮蓝染色；
图11为本发明实施例5中单偶联mPEG-pALD化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-碘染色；
图12为本发明实施例5中单偶联mPEG-pALD化IFN-α2b的SDS-PAGE电泳图-考马斯亮蓝染色；
图13为本发明实施例中 三种PEG化IFN SDS-PAGE的电泳图-考马斯亮蓝染色。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
另需要说明的是，本发明中术语 “PEG化IFN”等同于“PEG化IFNα-2b”，表示“聚乙二醇修饰干扰素”，其中，“IFN”意指干扰素，是其英文缩写，“PEG”意指聚乙二醇，是其英文缩写。术语“硼酸盐缓冲液”意指硼酸-硼砂缓冲液。术语“多偶联PEG化IFN”或者“多PEG分子偶联”或者“多偶联PEG-IFN”表示的是两个以上PEG分子的活化基团与单个IFN分子中赖氨酸残基或与IFN的N-末端发生共价连接。术语“单偶联PEG化IFN”或者“单PEG分子偶联”或者“单偶联PEG-IFN”表示的是单个PEG分子的活化基团与单个IFN分子中赖氨酸残基或与IFN的N-末端发生共价连接。
本发明实施例提供一种从PEG和IFN-α2b合成反应产物中纯化单偶联PEG化干扰素的方法，以便于快速、稳定、高纯度获得单偶联PEG化干扰素产物。具体的，一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，包括：
获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液；
用第一缓冲液平衡阳离子层析柱，将所述反应液上样，并再次平衡所述阳离子层析柱；
用第二缓冲液冲洗所述阳离子层析柱，其中，所述第二缓冲液为含有33-80mM氯化钠的第一缓冲液；
用第三缓冲液洗脱所述阳离子层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的阳离子洗脱液，其中，所述第三缓冲液为含有58-100mM氯化钠的第一缓冲液，且所述第二缓冲液中氯化钠的浓度小于所述第三缓冲液中氯化钠的浓度。
本实施例首先通过合成反应制备PEG化IFN，在第一缓冲液平衡条件下，将PEG化IFN反应液吸附到阳离子层析柱上，与离子交换填料上的活性基团即配基相互作用，使得包括目的蛋白（即单偶联PEG化IFN）在内的反应液吸附在柱子上，由于盐离子可以与产物竞争柱子上的活性基团，因此盐浓度越高，反应液与层析柱上的配基结合越不紧密，越容易被洗脱下来。因此，本实施例先采用含有33-80mM氯化钠的缓冲液冲洗层析柱，单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除，再用含有58-100mM氯化钠的缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α-2b的组分。
所谓阳离子层析，是一种离子交换层析技术，是依据蛋白表面所带正电荷量不同进行蛋白分离纯化。蛋白表面通常会带有一定的电荷，在一定条件下可以与阳离子交换柱或阴离子交换柱结合。这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而达到分离的效果。
IFN是一种小分子蛋白质，由于具有多个修饰位点，因此PEG修饰后的反应液中含有多种混合物，例如单PEG分子偶联、多PEG分子偶联、未参与反应的底物（游离PEG、IFN）等。PEG整体不带电，局部显负电，IFN理论等电点为5.97，PEG与IFN偶联后，造成IFN表面电荷分布和极性发生变化，但由于PEG本身不带电，所以PEG-IFN与IFN等电点范围存在很大程度重叠，对PH值洗脱不敏感。本实施例选择阳离子层析柱，可避免PEG与阳离子层析柱的结合。而IFN酸性条件下带正电，可与层析柱结合。且由于PEG与IFN的偶联对IFN电荷的遮挡作用，造成PEG化IFN与层析柱的结合力度与其他成分有很大差异，因此可以利用与IFN偶联部位不同造成IFN裸露外部的电荷数及分布的不同以及其对阳离子交换剂的色谱行为的表现差异，从而获取目的分子。
其中一些实施方式中，所述阳离子层析柱所用填料为SP-HP填料，所述填料的配基密度为0.15-0.20mmol/mL，平均颗粒34μm。
本实施例中，阳离子层析柱所用填料为34μm颗粒的SP-HP填料，配基密度为0.15-0.20mmol/mL，是一种强阳离子层析，通过采用高分辨率填料，既保证目的蛋白与杂质的高区分度，又同时承担目的蛋白从反应液捕获任务，即将不同类型的蛋白质分别洗脱。
由于PEG化IFN得到的反应液一般量比较大，相关技术通常采用先粗纯去除杂质，捕获到含有目的蛋白的溶液，然后再精纯，以进一步洗脱目的蛋白。而本实施例直接一步纯化，通过选用具有高分辨率的填料以及控制洗脱液中所含盐的浓度，实现既能够捕获反应液也能够获得较高分离度的目的，相比常规的先粗提后精纯的纯化流程，整体减少了纯化步骤。
其中一些实施方式中，所述反应液与所述阳离子层析柱的体积比为5-10:1，所述反应液在所述阳离子层析柱中的流速为1-40mL/min。
本实施例中，纯化在装有Cytia公司的SP-HP填料的自装柱上进行，装柱体积按反应液：纯化柱体积=5：1（体积比）进行，阳离子层析柱的柱高2.5-10cm，流速设计为1-40mL/min，在该参数下洗脱，能够高效分离目的蛋白。
其中一些实施方式中，所述第一缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的pH为5.0±0.1，浓度为30mM。
本实施例的第一缓冲液为基础缓冲液，所使用的基础缓冲液为pH为5.0±0.1、30mM醋酸钠-醋酸缓冲液，可根据需要添加不同成分盐浓度。
其中一些实施方式中，所述纯化方法还包括：
将所述阳离子洗脱液用3M硫酸铵浓储液调制硫酸铵终浓度为0.6M，得到第二洗脱液；
用第四缓冲液平衡疏水层析柱，将所述第二洗脱液上样，并再次平衡所述疏水层析柱，其中，所述第四缓冲液为含有0.6M硫酸铵的第一缓冲液；
用第五缓冲液冲洗所述疏水层析柱，其中，所述第五缓冲液为含有450mM硫酸铵的第一缓冲液；
用第六缓冲液洗脱所述疏水层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的第三洗脱液，其中，所述第六缓冲液为含有280mM硫酸铵的第一缓冲液，所述第三洗脱液中所述单偶联PEG化干扰素的纯度大于或等于98%。
由于蛋白质和多肽等生物大分子的表面常常暴露着一些疏水性基团，例如蛋白经变性处理或处于高盐环境下疏水残基会暴露于蛋白表面，疏水残基可以与固定相的疏水性层析介质发生疏水性相互作用而结合，不同的分子由于疏水性不同，它们与疏水性层析介质的疏水配基之间的疏水力的强弱就不同，因此可以根据分子表面疏水性的不同来分离蛋白质等生物大分子，按照“高盐上样，低盐洗脱”的原则：高浓度盐水溶液中蛋白质在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白质从柱上被洗脱，将蛋白质在高盐条件下吸附在疏水层析介质的疏水基团上，通过降低盐浓度使得不同蛋白按疏水性从弱到强依次被洗脱，从而达到分离纯化的目的。
PEG本身具有溶解性及疏水性，其与IFN偶联位点和数量的差异及对IFN包裹造成IFN裸露疏水部位的差异性，利用这两种特性可有效分离目的蛋白。此外，PEG随着分子量增大，疏水性也逐渐明显，具有较弱的疏水性。PEG化IFN合成反应中，有单偶联PEG-IFN和多偶联PEG-IFN两种形式，PEG与IFN的偶联的不同使得IFN的极性变化，因此对采用疏水层析色谱方法具有很好的分离效果。
因此，本实施例在进行阳离子层析以获得具有较高收率及一定纯度的目的蛋白后，还利用蛋白质的疏水特性进行疏水层析，先采用含450mM硫酸铵的第一缓冲液冲洗疏水层析柱，以洗脱杂质，再采用含280 mM硫酸铵的第一缓冲液冲洗疏水层析柱，通过降低盐浓度洗脱，来分离疏水性不同的蛋白。
可以理解，利用PEG化学修饰IFN是延长蛋白类药物半衰期的有效途径，但IFN经PEG修饰后，PEG与IFN相连，线性的PEG分子包裹于IFN外部，导致IFN与离子交换介质的吸附能力大幅降低。因此，常规思路是采用更高或更低盐浓度预洗除杂或洗脱，以获得高纯度的目的蛋白，但是会牺牲收率，即纯度越高，收率越低。而本实施例的思路是，在预洗及洗脱条件的设置不能兼顾收率和纯度的情况下，先保证目的蛋白收率及一定纯度，再利用疏水特性二次纯化，以期维持收率基本不变的基础上，进一步提高纯度。由此，通过两步纯化获得具有较高纯度和收率的目的蛋白。
具体地，本实施例中，疏水层析使用硫酸铵溶液，初始调至0.6M，此浓度下可使溶液中蛋白仍处于溶解状态，并且疏水区暴露于溶液中，便于分离不同疏水属性蛋白。同时，发明人在试验中还意外发现，硫酸铵对PEG疏水性影响远不如对蛋白的影响，因此，采用硫酸铵溶液的疏水层析柱可以比较容易的对阳离子层析残留溶液中的PEG进一步去除，同时对不同疏水结构的蛋白进行纯化分离。
其中一些实施方式中，所述疏水层析柱所用填料为phenyl-HP填料，所述填料的配基密度为25μmol/mL，平均颗粒34μm。
其中一些实施方式中，所述第二洗脱液与所述疏水层析柱的体积比为6:1，所述第二洗脱液在所述疏水层析柱中的流速为1-10mL/min。
相关技术中，为了获得高纯度目的蛋白，可能也会采用一种纯化方式重复操作的情况，这种方式，第一次操作时一般根据样品不同成分与层析柱填料结合力强弱，选择适当盐浓度进行洗脱，以获得目的蛋白。在第二次操作之前，一般会先检测第一次操作收集液各成分等电点，依据不同成分等电点不同，选择适当pH进行洗脱以获得目的蛋白，或者在不具备等电点检测条件下，配制两种不同pH缓冲液，在一定范围内进行pH梯度洗脱。由于缓冲液具有缓冲作用，pH较为稳定，因此pH梯度洗脱具有一定难度。若一种纯化方式重复操作都是基于盐浓度洗脱分离目的蛋白，那么可以合并成一步，牺牲收率以获得更高纯度目的蛋白。
本实施例采用两种纯化方式结合，是基于反应液中各成分，以及各成分结构的分析，评估各成分对层析柱填料结合力的强弱区别，基于理论知识充分挖掘不同成分的结构不同所引起的不同理化属性，采用两种纯化方式组合，利用更多的理化属性，以达到分离目的蛋白的目的，同时尽量减少纯化过程中的不必要步骤和实施难度。
其中一些实施方式中，选取三种PEG与IFN-α2b分别进行合成反应，提供含PEG化IFN-α2b的反应液。三种PEG分别为：分枝单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺羧酸酯，简称mPEG2-NHS，分子量40KD；分枝甲氧基聚乙二醇丙醛，简称mPEG2-pALD，分子量40KD；单甲氧基聚乙二醇丙醛，简称mPEG-pALD，分子量20KD。
对于mPEG2-NHS化IFN，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM硼酸盐缓冲液；调节pH值为8.6-9.0；再加入mPEG2-NHS（分枝单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺羧酸酯），其中，mPEG2-NHS与IFN-α2b的摩尔比为3：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应2小时；用1mol/L冰乙酸调节pH≤4.5，终止反应，得到所述反应液。对终止后的合成反应溶液，进行包括阳离子交换层析和疏水层析的两步纯化。
经电泳检测，反应液主要包括PEG、多偶联PEG化IFN、IFN、单偶联PEG化IFN，其中单偶联PEG-IFN占比25%-30%，多偶联占比约9%。
其中，SP-HP层析中，预洗盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含32-35mM氯化钠，更优选含33mM氯化钠；洗脱盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含48-60mM氯化钠，更优选含58mM氯化钠；
phenyl-HP层析中，预洗盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含450-480mM硫酸铵，更优选含450mM硫酸铵；洗脱盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含280-300mM硫酸铵，更优选含280mM硫酸铵。
对于mPEG2-pALD化IFN，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG2-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG2-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。对终止后的合成反应溶液，优选进行阳离子交换层析纯化。
经电泳检测，反应液主要包括PEG、多偶联PEG化IFN、IFN、单偶联PEG化IFN，其中单偶联PEG-IFN占比26%-31%，多偶联占比约0.9%。
其中，SP-HP层析中，预洗盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含50-55mM氯化钠，更优选含50mM氯化钠；洗脱盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含80-83mM氯化钠，更优选含82mM氯化钠。
对于mPEG-pALD化IFN，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。对终止后的合成反应溶液，优选进行阳离子交换层析纯化。
经电泳检测，反应液主要包括PEG、多偶联PEG化IFN、IFN、单偶联PEG化IFN，其中单偶联PEG-IFN占比41-49%，多偶联占比约4.5%。
其中，SP-HP层析中，预洗盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含78-83mM氯化钠，更优选含80mM氯化钠；洗脱盐浓度范围优选为：pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液含100-110mM氯化钠，更优选含100mM氯化钠。
下面通过具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
本实施例通过合成反应制备三种PEG化IFN，分别是mPEG2-NHS与IFN-α2b的合成、mPEG2-pALD与IFN-α2b的合成、mPEG-pALD与IFN-α2b的合成。
其中，IFNα-2b来源于哈药集团生物工程有限公司的生产原液，由纯度98%以上IFNα-2b溶解于pH为4.5±0.1、浓度为20mM的醋酸钠-醋酸缓冲液中。根据合成反应条件超滤置换相对应缓冲液，并调制适当浓度。
a）mPEG2-NHS与IFN-α2b的合成反应：
配制50mM硼酸盐缓冲液，pH值为8.6-9.0，按摩尔比PEG：IFN=3：1加入底物，反应体系从10mL-500mL，处于密封状态，减少氧气对反应的影响。将反应液置于低温冷柜，温度控制4-8℃，搅拌速度120-160rpm。待反应时间2小时后，用1mol/L冰乙酸调节pH≤4.5终止反应，所得含PEG化IFN的反应混合物可被用于纯化。
b）mPEG2-pALD与IFN-α2b的合成反应：
配制50mM HAC-NaAC缓冲液，pH值为4.0，按摩尔比PEG：IFN=2：1加入底物，反应体系10mL-500mL，加入还原剂氰基硼氢化钠，终浓度10mM，然后使反应容器处于密封状态，置于冷柜4-8℃，搅拌速度120-160rpm。待反应发生23小时后，加入10mM终浓度甘氨酸终止反应，所得含PEG化IFN的反应混合物可被用于纯化。
c）mPEG-pALD与IFN-α2b的合成反应：
配制50mM HAC-NaAC缓冲液，pH值为4.0，按摩尔比PEG：IFN=2：1加入底物，反应体系10mL-500mL，加入还原剂氰基硼氢化钠，终浓度10mM，然后使反应容器处于密封状态，置于冷柜4-8℃，搅拌速度120-160rpm。待反应发生23小时后，加入10mM终浓度甘氨酸终止反应，所得含PEG化IFN的反应混合物可被用于纯化。
实施例2
本实施例针对PEG-IFN纯化层析介质的选择进行实验，以弱阳离子层析介质CM-FF为对比。
弱阳离子层析介质CM-FF一般用于快速捕获、初步纯化步骤，主要完成对目的蛋白的粗提，而本实施例所用强阳离子层析介质SP-HP分辨率较高，可用于进一步提高目的蛋白纯度。
首先选用装有CM-FF填料层析柱，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡，然后将含有mPEG2-NHS化IFN-α2b的反应混合物上样，并再次平衡。
用含300mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，0-300mM氯化钠浓度梯度洗脱，纯化情况如图1所示，图1中曲线a为电导曲线，曲线b为UV280曲线，收集洗脱峰，SDS-PAGE碘染检测结果如图2所示，图中”1”为Marker，表示分子标记，用于作为参照，通过对比来确定样品的大小；“2”为上样；“3”为峰1；“4”为峰2。
选用SP-HP填料层析柱，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡，然后将含有mPEG2-NHS化IFN-α2b的反应混合物上样，并再次平衡，用含300mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，0-300mM氯化钠浓度梯度洗脱，纯化情况如图3所示，图3中曲线a为电导曲线，曲线b为UV280曲线。根据洗脱情况收集，SDS-PAGE碘染检测结果如图4所示，图中”1”为Marker；“2”为上样；“3”、“4”为平衡及梯度洗脱开始；“5”、“6”、“7”、“8”、“9”为梯度洗脱后各部分收集液。
比较两种填料纯化mPEG2-NHS化IFN-α2b的反应混合物的色谱行为以及电泳分析。两种填料对反应液的处理量上无明显差异。如图2所示，CM-FF层析柱分离两个峰，目的蛋白集中在峰2（图2中标记4所示），目的蛋白包含单PEG偶联的IFN目的蛋白以及多偶联的IFN蛋白。
SP-HP层析柱在平衡时有物质与层析柱解离，电泳检测为PEG和多偶联PEG化IFN。然后，在盐梯度洗脱形成若干未完全分离峰，对其各部分连续取样，电泳检测发现SP-HP对PEG偶联IFN蛋白，不论单偶联还是多偶联都有一定区分度。
对SP-HP层析柱纯化条件进一步优化尝试，最终确认，预洗条件为含33mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，洗脱条件为含58mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，可以获得91.2%的纯度，如图5所示，图中”1”为Marker；“2”为上样；“3”为预洗；“4”为洗脱。
经比较，SP-HP在结合载量与CM-FF无明显差异情况下，SP-HP可以获得更高纯度目的蛋白。
实施例3
如图6所示，本实施例进行单偶联mPEG2-NHS化IFN-α2b的纯化，图中括号内内容为可以包括也可以不包括，在本实施例中采用两步纯化方法，步骤如下：
a）在SP-HP上的第一步纯化
第一步纯化在装有Cytia公司的SP-HP填料的自装柱上进行，装柱体积按反应液：纯化柱体积=5：1（体积比）进行，柱高2.5-10cm，流速1-40mL/min。
首先，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡3-5个柱体积，然后将含有mPEG2-NHS化IFN-α2b的反应混合物上样，并再次平衡3-5个柱体积。
接着用含33mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液冲洗层析柱，冲洗2-3个柱体积。单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除。
再用含58mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α-2b的组分，定义为SP-HP洗脱液，收集并冷藏保存。
最后用0.5-1M浓度的NaOH溶液清洗层析柱，清除单体IFN及其他附着杂质，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡。
b）在phenyl-HP上的第二步纯化
第二步纯化在装有Cytia公司的phenyl-HP填料的自装柱上室温进行，装柱体积按反应液：纯化柱体积=6：1（体积比）进行，柱高2.5-5cm，流速1-10mL/min。
首先，将含单偶联PEG化IFNα-2b的SP-HP洗脱液用3M硫酸铵浓储液调制硫酸铵终浓度为0.6M，静置半小时稳定、无浑浊。
用含0.6M硫酸铵的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡3-4个柱体积，然后将SP-HP洗脱液上样，并再次平衡3-4个柱体积。
平衡后，用含450mM硫酸铵的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液冲洗2-4个柱体积，进一步清除可能的PEG和其他有关物质。
随后用含280mM硫酸铵的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱并收集洗脱液，收集的含单偶联PEG化干扰素α-2b的洗脱液，根据后续要求超滤除盐。
层析柱用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液冲洗2-3个柱体积，再用0.5-1M浓度的NaOH清洗，最后用平衡液平衡。
如图7、图8所示，洗脱液经SDS-PAGE电泳检测，获得单偶联PEG化干扰素α-2b，纯度在98%以上。图7中M表示Marker，A表示预洗，B表示洗脱；a代表PEG，b代表单偶联，c代表多偶联。图8中M表示Marker，A表示预洗，B表示洗脱；a代表多偶联，b代表单偶联。
其中，纯度98%以上单偶联PEG化干扰素α-2b，其纯度指SDS-PAGE还原电泳经考马斯亮蓝R250染色或碘染色法所获得的纯度，下同。
实施例4
如图6所示，本实施例进行单偶联mPEG2-pALD化IFN-α2b的纯化，图6中括号内容表示可以包括也可以不包括，本实施例中使用强阳离子交换层析一步纯化方法。纯化在装有Cytia公司的SP-HP填料的自装柱上进行，装柱体积按反应液：纯化柱体积=6：1（体积比）进行，柱高2.5-8cm，流速1-40mL/min。具体步骤如下：
首先，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡3-5个柱体积，然后将含有mPEG2-pALD化IFN-α2b的反应混合物上样，并再次平衡3-5个柱体积。
接着用含50mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液冲洗层析柱，冲洗2-3个柱体积。单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除。
再用含82mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α-2b的组分，收集并冷藏保存。
最后用0.5-1M浓度的NaOH溶液清洗层析柱，清除单体IFN及其他附着杂质，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡。
如图9、图10所示，洗脱液经SDS-PAGE电泳检测，获得单偶联PEG化干扰素α-2b，含有少量的PEG，目的蛋白纯度在98%以上。图9中，A表示预洗，B表示洗脱；a代表多偶联， b代表单偶联，c代表PEG。图10中，A表示预洗，B表示洗脱；a代表单偶联。
实施例5
如图6所示，本实施例进行单偶联mPEG-pALD化IFN-α2b的纯化，图6中括号内内容表示可以包括也可以不包括，本实施例使用强阳离子交换层析一步纯化方法。纯化在装有Cytia公司的SP-HP填料的自装柱上进行，装柱体积按反应液：纯化柱体积=10：1（体积比）进行，柱高2.5-8cm，流速1-40mL/min。具体步骤如下：
首先，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡3-5个柱体积，然后将含有mPEG-pALD化IFN-α2b的反应混合物上样，并再次平衡3-5个柱体积。
接着用含80mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液冲洗层析柱，冲洗2-3个柱体积。单体PEG及多偶联PEG化干扰素在上样流穿，平衡及冲洗中被清除。
再用含100mM氯化钠的pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液洗脱包含单偶联PEG化干扰素α-2b的组分，收集并冷藏保存。
最后用0.5-1M浓度的NaOH溶液清洗层析柱，清除单体IFN及其他附着杂质，用pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液平衡。
如图11、图12所示，洗脱液经SDS-PAGE电泳检测，获得单偶联PEG化干扰素α-2b，含有少量IFN及微量多偶联PEG化IFN，目的蛋白纯度在98%以上。图11中，A表示预洗，B表示洗脱；a代表多偶联，b代表多偶联，c代表单偶联，d代表单偶联。图12中，A表示预洗，B表示洗脱；a代表单偶联，b代表IFN。
如图13所示，根据本实施例的纯化方法，可以获得经修饰的高纯度目的蛋白，因此此方法也可用于更大规模PEG化IFN的纯化。图13中，1代表Marker，2代表mPEG2-pALD化IFN，3代表mPEG2-NHS化IFN，4代表mPEG-pALD化IFN。
综上，本发明实施例采用较少的纯化层析步骤，即可获得较高纯度PEG-IFN样品，所使用的基础缓冲液为pH为5.0±0.1、浓度为30mM的醋酸钠-醋酸缓冲液，不同使用场景添加不同成分盐，具有一定便利性。
虽然本发明披露如上，但本发明的保护范围并非仅限于此。本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围的前提下，可进行各种变更与修改，这些变更与修改均将落入本发明的保护范围。
Claims (4)
1.一种聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，其特征在于，包括：
获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液；
用第一缓冲液平衡阳离子层析柱，将所述反应液上样，并再次平衡所述阳离子层析柱；其中，所述第一缓冲液为醋酸钠-醋酸缓冲液，所述醋酸钠-醋酸缓冲液的pH为5.0±0.1，浓度为30mM；所述阳离子层析柱所用填料为SP-HP填料，所述填料的配基密度为0.15-0.20mmol/mL，平均颗粒34μm；所述反应液与所述阳离子层析柱的体积比为5-10:1，所述反应液在所述阳离子层析柱中的流速为1-40mL/min；
用第二缓冲液冲洗所述阳离子层析柱，其中，所述第二缓冲液为含有33-80mM氯化钠的第一缓冲液；
用第三缓冲液洗脱所述阳离子层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的阳离子洗脱液，其中，所述第三缓冲液为含有58-100mM氯化钠的第一缓冲液，且所述第二缓冲液中氯化钠的浓度小于所述第三缓冲液中氯化钠的浓度；
将所述阳离子洗脱液用3M硫酸铵浓储液调制硫酸铵终浓度为0.6M，得到第二洗脱液；
用第四缓冲液平衡疏水层析柱，将所述第二洗脱液上样，并再次平衡所述疏水层析柱，其中，所述第四缓冲液为含有0.6M硫酸铵的第一缓冲液；所述疏水层析柱所用填料为phenyl-HP填料，所述填料的配基密度为25μmol/mL，平均颗粒34μm；所述第二洗脱液与所述疏水层析柱的体积比为6:1，所述第二洗脱液在所述疏水层析柱中的流速为1-10mL/min；
用第五缓冲液冲洗所述疏水层析柱，其中，所述第五缓冲液为含有450mM硫酸铵的第一缓冲液；
用第六缓冲液洗脱所述疏水层析柱，并收集洗脱液，得到包含单偶联PEG化干扰素的第三洗脱液，其中，所述第六缓冲液为含有280mM硫酸铵的第一缓冲液，所述第三洗脱液中所述单偶联PEG化干扰素的纯度大于或等于98%。
2.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，其特征在于，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM硼酸盐缓冲液；调节pH值为8.6-9.0；再加入mPEG2-NHS，其中，mPEG2-NHS与IFN-α2b的摩尔比为3：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应2小时；用1mol/L冰乙酸调节pH≤4.5，终止反应，得到所述反应液。
3.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，其特征在于，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG2-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG2-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。
4.根据权利要求1所述的聚乙二醇修饰干扰素的纯化方法，其特征在于，所述获取聚乙二醇修饰干扰素的反应液包括：
向IFN-α2b原液中加入50mM HAC-NaAC缓冲液；调节pH值为4.0；再加入mPEG-pALD和还原剂氰基硼氢化钠10mM，其中，mPEG-pALD与IFN-α2b的摩尔比为2：1；控制反应温度为4-8℃，搅拌条件下反应23小时；加入终浓度为10mM的甘氨酸终止反应，得到所述反应液。
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