CN104356223A - 高纯度重组人干扰素α2b的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其包括以下步骤：a)将重组人干扰素α2b菌体裂解、复性，得复性产物；b)将复性产物依次通过阳离子柱、疏水柱和阴离子柱层析纯化，即得产品。本发明采用阳离子柱、疏水柱和阴离子柱的组合依次层析的方式极为有效的捕获重组人干扰素α2b，以及去除其中的杂蛋白和相关蛋白，经检测，采用本发明公开的制备方法得到的重组人干扰素α2b的RP-HPLC检测纯度大于95％，且重组人干扰素α2b的N端测序不含Met，如此可以有效避免在患者体内产生免疫反应及副作用，进而保证重组人干扰素α2b的临床疗效和使用安全。

Description

高纯度重组人干扰素α2b的制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种高纯度重组人干扰素α2b的制备方法。

背景技术

干扰素(IFN)是一类具有广谱抗病毒活性的蛋白质，根据干扰素氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为三类：α干扰素、β干扰素以及γ干扰素，其中α干扰素是应用较为广泛的一类干扰素，临床上主要用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎等病毒性疾病，也用作一些肿瘤化疗药物的联合用药。但是，重组蛋白药物在生产或储存时，其中的氨基酸易被修饰而产生各种变异体，这些变异体被称作相关蛋白(Relatedproteins)，具体的，这些相关蛋白的产生主要来自以下两个方面：一是原核系统在表达异源蛋白质时，因其N末端氨基酸的不完全加工导致的产品N末端含有多种结构形式，如N末端甲硫胺酰化、乙酰化、甲酰化以及氨基酸残基缺失等；二是干扰素本身化学降解会生成相关蛋白，如脱酰胺、氧化、水解等。相关蛋白的存在会带来一些不良后果，尤其是结构上的变异可能会在患者体内产生免疫反应及副作用，进而影响重组蛋白药物的临床疗效，因此，相关蛋白的分析及控制对于重组蛋白药物的安全、有效使用来说尤为重要。

目前，欧洲药典是采用RP-HPLC法(即反相高效液相色谱法)分离检测干扰素α2b中的大部分相关蛋白，而我国药典目前还没有采用上述方法检测相关蛋白，同时，中国和欧洲药典对干扰素α2b的N段序列的标准也有差异，具体如下表1所示：

干扰素α2b的质量标准

项目	中国药典2010	欧洲药典8.0
			电泳纯度	≥95％	≥99％

SE-HPLC纯度	≥95％	无
			RP-HPLC纯度	无	≥95％
比活性	≥1×108IU/mg	≥1.4×108IU/mg
			等电点	4.0-6.7	5.8-6.3
N段序列	(M)CDLPQTHSLGSRRTL	CDLPQTHSLGSRRTL

另外，在2014年度国家药品评价性抽验工作中，中国食品药品检定研究院李永红等人在2014年期刊《药物分析杂志》的第34卷第7期第1204-1207页发表了一篇名称为“2种重组人干扰素α2b相关蛋白分析方法的应用比较”的文章，该文章对国内8家企业的24批重组人干扰素α2b进行了相关蛋白方面的研究，其中仅有两家企业生产的重组人干扰素α2b中的相关蛋白符合欧洲药典标准，另外有5家企业产品中的甲硫胺酰化相关蛋白(Met-IFN)含量在18％-38％之间，同时，该文章还表明欧洲药典公开的上述方法无法检测出Met-IFN。Met-IFN是由于蛋白质在原核系统翻译时，起始密码子AUG所翻译的甲硫氨酸(Met)未被有效切除而形成的，它比干扰素α2b在N末端多了一个Met，因此可以通过N端测序来确认是否含有Met，而欧洲药典关于干扰素α2b的N端测序检测项中，其N末端是不允许有Met的存在，因此欧洲药典实则是通过N端测序来确认是否含有Met-IFN，从而弥补RP-HPLC法无法检测Met-IFN的缺陷。

上述现有技术表明，采用RP-HPLC法无法检测分离重组人干扰素α2b中的Met-IFN，而国内的相关资料虽然可以通过一些分离纯化方法得到高纯度的重组人干扰素α2b，如名称为“一种新的重组人干扰素α2b的分离纯化方法”(专利号为CN1749274B)的中国专利公开了以下方案：包涵体复性后再依次经过疏水柱M1、CM、M2层析和S-100分子筛层析，即得纯化产品；名称为“一种重组人干扰素α2b(rhIFNα2b)原液的制备方法”(专利号为CN 100355774C)的中国专利公开了以下步骤：包涵体复性后经DEAE、CM、SP层析，得纯化产品；名称为“一种干扰素的纯化方法”(专利号为CN 103014101A)的中国专利公开了以下步骤：包涵体复性后经阴离子柱、阳离子柱、反相填料柱层析，得纯化产品，该纯化产品的电泳纯度可由90％提高到98％，SE-HPLC纯度可由90％提高到98％，但是该方法也难以去除Met-IFN，同时其采用了有机溶剂洗脱，存在安全隐患，并易对蛋白质造成损伤，因此限制了干扰素的大规模生产及应用。上述现有技术多以电泳及SE-HPLC纯度做为质控及评价指标，未见反相纯度研究报告，也未指出得到的重组人干扰素α2b中是否含有Met-IFN，同时我国药典也并未对Met-IFN提出检测要求，鉴于重组人干扰素α2b与其相关蛋白的性质接近，如何通过纯化方法去除相关蛋白一直是技术人员的研究难点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度重组人干扰素α2b的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其包括以下步骤：

a)将重组人干扰素α2b菌体裂解、复性，得复性产物；

b)将复性产物依次通过阳离子柱、疏水柱和阴离子柱层析纯化，即得产品。

上述技术方案产生的有益效果在于：采用本发明公开的上述方法可以有效地除去重组人干扰素α2b中的包括Met-IFN在内的各种相关蛋白，从而有效提高产品的纯度，其中步骤a可以通过现有的常规方法制得所需的复性产物。

具体的方案为：所述步骤b的阳离子柱层析方法为：采用缓冲液A预平衡阳离子交换介质后上样，用缓冲液B进行第一次洗脱，待基线归零后，用缓冲液C进行第二次洗脱，收集第二个蛋白洗脱峰的洗脱液；

所述的缓冲液A是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-柠檬酸、乙酸-乙酸钠或Bis-Tris-盐酸，缓冲液A的pH为3.6-6.0、浓度20-50mM；缓冲液B是加有50-100mM氯化钠溶液的缓冲液A；缓冲液C是加有100-200mM氯化钠溶液的缓冲液A；所述的阳离子交换介质为CM-Sepharose FF、SP-Sepharose FF、S-Sepharose FF或SP-Sepharose XL。所述的阳离子柱层析是采用等度洗脱模式收集得到大部分的重组人干扰素α2b，具体采用该步骤层析分离得到的重组人干扰素α2b含量高达50-60％。

进一步的，所述步骤b的疏水柱层析方法为：向阳离子柱层析收集的洗脱液中加入硫酸铵溶液至洗脱液中硫酸铵浓度为0.8-1.5M，采用缓冲液D预平衡疏水层析介质后上样，用缓冲液E进行第一次洗脱，待基线归零后，用缓冲液F进行第二次洗脱，收集第一个蛋白洗脱峰的洗脱液；

所述的缓冲液D是浓度为0.8-1.5M的硫酸铵溶液，缓冲液E是浓度为0.4-0.7M的硫酸铵溶液，缓冲液F是浓度为0.1-0.2M的硫酸铵溶液；

所述的疏水层析交换介质为Butyl Sepharose 4FF、OctylSepharose 4FF或Phenyl Sepharose 6FF，本发明通过上述的疏水柱层析分离可以有效地去除重组人干扰素α2b中的杂蛋白及相关蛋白。

另外，所述步骤b的阴离子层析方法为：将疏水柱层析收集的洗脱液稀释5-10倍，采用缓冲液G预平衡阴离子交换介质后上样，先用缓冲液H洗涤10-20个柱体积，然后再用缓冲液I洗脱，收集洗脱峰；

所述的缓冲液G磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、硼酸-硼酸、Tris-盐酸或甘氨酸-氢氧化钠，缓冲液G的pH为7.4-9.0、浓度5-50mM；缓冲液H为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Bis-Tris-盐酸或乙酸-乙酸钠，缓冲液H的pH为4.5-7.0、浓度10-50mM，且缓冲液H中含有0-50mM氯化钠；缓冲液I为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Bis-Tris-盐酸或乙酸-乙酸钠，缓冲液I的pH为4.5-7.0、浓度20-50mM，且缓冲液I中含有50-80mM氯化钠；

所述的阴离子交换介质为Q-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF或Q-Sepharose XL，本发明通过上述的阴离子交换层析分离可以进一步的去除杂蛋白及相关蛋白，使制得的目标产物重组人干扰素α2b的纯度得以显著提高。

作为进一步的优选方案，所述步骤a的具体操作步骤如下：

1)按照1g:3ml的质量体积比向重组人干扰素α2b菌体中加入6M盐酸胍，在3-5℃条件下搅拌裂解4h，得裂解液；

2)将裂解液装入透析袋中，依次透析pH7.4的PBS两次、pH3.0的20mM醋酸两次以使裂解液复性；

3)将复性的裂解液离心，取上清液过滤，得到的滤液即为复性产物。

与现有技术相比，本发明是将裂解的菌体即包涵体直接装入透析袋中透析复性，这样可以有效避免包涵体洗涤的繁琐步骤和目标产物的损失，提高制备效率，同时，本发明采用阳离子柱、疏水柱和阴离子柱的组合依次层析的方式极为有效的捕获重组人干扰素α2b，以及去除其中的杂蛋白和相关蛋白，经检测，采用本发明公开的制备方法得到的重组人干扰素α2b的RP-HPLC检测纯度大于95％，有效地去除了各种相关蛋白；同时N端测序结果证实其不含Met-IFN，如此可以有效避免在患者体内产生免疫反应及副作用，进而保证重组人干扰素α2b的临床疗效和使用安全。

本发明所提供的纯化工艺采用离子交换、疏水层析两种基础层析模式，能极为有效去除干扰素相关蛋白，所获产品反相HPLC纯度大于95％。

附图说明

图1是重组人干扰素α2b的RP-HPLC法纯度检测图谱；

图2是重组人干扰素α2b的电泳图谱；

图3(a)、(b)、(c)是重组人干扰素α2b的N末端测序图谱；

图4是重组人干扰素α2b的SE-HPLC图谱。

具体实施方式

为了进一步说明本发明公开的技术方案，以下通过实施例1-5来做具体说明：

实施例1：重组人干扰素α2b的复性

1)收集大肠杆菌表达的重组人干扰素α2b发酵后所获的菌体，该菌体通过常规技术即可获取，然后按1g:3ml的比例向该菌体中加入6M盐酸胍溶解，在4℃搅拌裂解4h，得到裂解液；

2)将裂解液倒入透析袋，按1:10的体积比对pH7.4的PBS进行透析，每4h换透析液一次，共2次，然后再按1:10的体积比对pH3.0的20mM醋酸进行透析，每4h换透析液一次，共2次，得到复性的裂解液；

3)将复性的裂解液在8000g、15min条件下离心，取上清液并过滤，得到的滤液即为复性产物。

实施例2：重组人干扰素α2b的纯化

1)阳离子柱层析纯化：阳离子柱交换介质CM-Sepharose FF经pH3.6的50mM乙酸-乙酸钠平衡后，以实施例1的复性产物作为上样液上样，然后先用含100mM氯化钠、50mM乙酸-乙酸钠的pH为3.6的缓冲液洗涤5-10个柱体积，再用含200mM氯化钠、50mM乙酸-乙酸钠的pH为3.6的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液；

2)疏水柱层析纯化：向阳离子柱层析收集的洗脱液中加入硫酸铵至其中的硫酸铵浓度为1.5M，疏水柱层析交换介质Butyl-Sepharose4FF经1.5M硫酸铵预平衡后上样，然后先用0.7M硫酸铵洗涤5-10个柱体积，再用0.2M硫酸铵洗脱，收集目标峰的洗脱液。

3)阴离子柱层析纯化：将疏水柱层析收集的洗脱液用水稀释10倍，阴离子柱交换介质DEAE Sepharose FF经pH为9.0的20mM Tris-盐酸预平衡后上样，然后先用含20mM氯化钠、50mM Bis-Tris-盐酸的pH为7.0的缓冲液洗涤10-20个柱体积，再用含80mM氯化钠、pH为7.0的50mM Bis-Tris-盐酸的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液，即为高纯度重组人干扰素α2b。

实施例3：重组人干扰素α2b的纯化

1)阳离子柱层析纯化：阳离子柱交换介质SP-Sepharose经pH为6.0的30mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠平衡后，以实施例1的复性产物作为上样液上样，然后先用含50mM氯化钠、30mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH为6.0的缓冲液洗涤5-10个柱体积，再用含100mM氯化钠、20mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠pH为6.0的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液；

2)疏水柱层析纯化：向阳离子柱层析收集的洗脱液中加入硫酸铵至其中的硫酸铵浓度为1.0M，疏水柱层析交换介质Octyl-Sepharose4FF经1.0M硫酸铵预平衡后上样，然后先用0.5M硫酸铵洗涤5-10个柱体积，再用0.15M硫酸铵洗脱，收集目标峰的洗脱液。

3)阴离子柱层析纯化：将疏水柱层析收集的洗脱液用水稀释7倍，阴离子柱交换介质Q-Sepharose FF经pH为7.4的50mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠预平衡后上样，然后先用含10mM氯化钠、10mM乙酸-乙酸钠的pH为4.5的缓冲液洗涤10-20个柱体积，再用含50mM氯化钠、20mM乙酸-乙酸钠pH为4.5的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液，即为高纯度重组人干扰素α2b。

实施例4：重组人干扰素α2b的纯化

1)阳离子柱层析纯化：阳离子柱交换介质S-Sepharose FF经pH5.0的20mM柠檬酸-柠檬酸钠平衡后，以实施例1的复性产物作为上样液上样，然后先用含60mM氯化钠、20mM柠檬酸-柠檬酸钠pH为5.0的缓冲液洗涤5-10个柱体积，再用含120mM氯化钠、20mM柠檬酸-柠檬酸钠pH为5.0的的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液；

2)疏水柱层析纯化：向阳离子柱层析收集的洗脱液中加入硫酸铵至其中的硫酸铵浓度为0.8M，疏水柱层析交换介质Phenyl-Sepharose6FF经0.8M硫酸铵预平衡后上样，然后先用0.4M硫酸铵洗涤5-10个柱体积，再用0.1M硫酸铵洗脱，收集目标峰的洗脱液。

3)阴离子柱层析纯化：将疏水柱层析收集的洗脱液用水稀释5倍，阴离子柱交换介质Q Sepharose XL经pH 8.0的5mM甘氨酸-氢氧化钠预平衡后上样，然后先用pH为6.0的40mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠洗涤10-20个柱体积，再用含60mM氯化钠、pH为6.0的40mM磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液洗脱，收集目标峰的洗脱液，即为高纯度重组人干扰素α2b。

所述的实施例2-4采用阳离子柱、疏水柱和阴离子柱的组合依次层析的方式能够有效的捕获重组人干扰素α2b，以及去除其中的杂蛋白和相关蛋白，经检测，上述实施例得到的重组人干扰素α2b的RP-HPLC检测纯度大于95％，比活大于4×10⁸IU/mg，电泳及SE-HPLC纯度均大于99％。

实施例5：重组人干扰素α2b的纯度检测

1、RP-HPLC法纯度检测：

采用十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，规格为：柱4.6mm×250mm，孔径30nm，粒径5um；

流动相A为700ml纯水+2ml三氟乙酸+300ml色谱纯乙腈；流动相B为200ml纯水+2ml三氟乙酸+800ml色谱纯乙腈；流速1.0ml/min；

在室温下进行梯度洗脱，具体的梯度参数见表2，实施例3制得的重组人干扰素α2b的进样量不低于50μg，检测结果如附图1所示，按面积归一法计算重组人干扰素α2b的纯度，结果如下表3，从中可以看出，重组人干扰素α2b的RP-HPLC法检测纯度高达97.82％。

表2梯度参数

时间/min	流动相A/％	流动相B/％
			0-1	72	28
1-5	72-67	28-33

5-20	67-63	33-37
			20-30	63-57	37-43
30-40	57-40	43-60
			40-42	40	60
42-50	40-72	60-28
			50-60	72	28

表3RP-HPLC法纯度检测计算结果

峰	面积/％	保留时间/min	峰面积/(μV·S)
				1	0.10	8.517	27583
2	0.05	10.197	15909
				3	0.04	11.176	12181
4	0.24	12.110	67956
				5	0.02	13.202	6120
6	0.08	14.576	22305
				7	0.54	15.358	150811
8	0.67	16.916	186185
				9	0.31	17.853	86630
10	97.82	19.057	27250464
				11	0.02	26.302	5954
12	0.09	27.625	24774

2、电泳纯度检测：

1)样品处理：

测试溶液a：实施例3制得的重组人干扰素α2b用电泳的上样缓冲液(以下简称buffer)稀释至浓度为0.5mg/ml；

测试溶液b：测试溶液a用buffer稀释5倍，浓度为0.1mg/ml；

参照溶液c：取重组人干扰素α2b标准品用buffer溶解，浓度为0.625mg/ml；

参照溶液d：参照溶液c用buffer稀释5倍,浓度为0.125mg/ml；

参照溶液e：参照溶液d用buffer稀释5倍,浓度为0.025mg/ml；

参照溶液f：参照溶液e用buffer稀释5倍,浓度为0.005mg/ml；

参照溶液g：参照溶液f用buffer稀释5倍,浓度为0.001mg/ml；

将上述的测试溶液与参照溶液置于含盖的测试管，沸水水浴2min。

2)电泳

根据电泳仪器使用手册开始电泳，所述的各溶液a-g的上样体积均为50ul，分离胶为14％聚丙烯酰胺，采用银染法染色。

3)判定条件

采用参比法，电泳结果在满足以下条件时即可对测试样品进行评价：①参照溶液g条带可见；②测试溶液a与测试溶液b的条带有色差梯度；③参照溶液c-g的条带均有色差梯度。

4)合格判定标准

测试溶液a中没有超过一条杂带比参照溶液f主条带颜色更深的条带；没有超过三条杂带比参照溶液g主条带颜色深的条带。此时，可以判定样品电泳纯度大于99％。

5)结果

如图2所示，样品和标准品自左向右分别为测试溶液a、b以及参照溶液c-g，从图中可以看出：该电泳符合上述判定条件；且测试溶液a没有杂带比参照溶液f主条带颜色更深，没有超过三条杂带比参照溶液g主条带颜色深的条带，符合上述合格判定标准。因此可判定该检测样品的电泳纯度大于99％。

3、N末端测序：

采用PPSQ-33A全自动蛋白质多肽测序仪(由中国科学院上海生命科学研究院检测)检测实施例3制得的重组人干扰素α2b的N末端序列，测序图谱如图3(a)、(b)、(c)所示，分析结果表明，重组人干扰素α2b的N末端15个氨基酸序列为：

NH2-Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Ser-Arg-Arg-Thr-Leu，从中可以看出第一个循环未见Met，由此可以判定采用本发明制备得到的重组人干扰素α2b中不含甲硫胺酰化相关蛋白Met-IFN。

4、SE-HPLC法纯度检测：

采用现有技术常规的SE-HPLC法检测实施例3制得的重组人干扰素α2b的纯度，检测图谱如图4所示，按面积归一法计算重组人干扰素α2b的纯度，结果下表4，从中可以明显看出，重组人干扰素α2b的SE-HPLC法检测纯度高达99.70％。

表4SE-HPLC法纯度检测计算结果

峰号	保留时间/min	峰面积/(μV·S)	面积/％
				1	16.215	858.235	0.0789
2	17.398	1084890.250	99.6952
				3	20.948	2458.635	0.2259
总计	—	1088207.120	100.0000

Claims (5)

1.一种高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其包括以下步骤：

a)将重组人干扰素α2b菌体裂解、复性，得复性产物；

b)将复性产物依次通过阳离子柱、疏水柱和阴离子柱层析纯化，即得产品。

2.根据权利要求1所述的高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于：所述步骤b的阳离子柱层析方法为：采用缓冲液A预平衡阳离子交换介质后上样，用缓冲液B进行第一次洗脱，待基线归零后，用缓冲液C进行第二次洗脱，收集第二个蛋白洗脱峰的洗脱液；

所述的缓冲液A是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、柠檬酸-柠檬酸钠、磷酸氢二钠-柠檬酸、乙酸-乙酸钠或Bis-Tris-盐酸，缓冲液A的pH为3.6-6.0、浓度20-50mM；缓冲液B是加有50-100mM氯化钠溶液的缓冲液A；缓冲液C是加有100-200mM氯化钠溶液的缓冲液A；

所述的阳离子交换介质为CM-Sepharose FF、SP-Sepharose FF、S-Sepharose FF或SP-Sepharose XL。

3.根据权利要求1或2所述的高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于：所述步骤b的疏水柱层析方法为：向阳离子柱层析收集的洗脱液中加入硫酸铵溶液至洗脱液中硫酸铵浓度为0.8-1.5M，采用缓冲液D预平衡疏水层析介质后上样，用缓冲液E进行第一次洗脱，待基线归零后，用缓冲液F进行第二次洗脱，收集第一个蛋白洗脱峰的洗脱液；

所述的缓冲液D是浓度为0.8-1.5M的硫酸铵溶液，缓冲液E是浓度为0.4-0.7M的硫酸铵溶液，缓冲液F是浓度为0.1-0.2M的硫酸铵溶液；

所述的疏水层析交换介质为Butyl Sepharose 4FF、OctylSepharose 4FF或Phenyl Sepharose 6FF。

4.根据权利要求3所述的高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于：所述步骤b的阴离子层析方法为：将疏水柱层析收集的洗脱液稀释5-10，采用缓冲液G预平衡阴离子交换介质后上样，先用缓冲液H洗涤10-20个柱体积，然后再用缓冲液I洗脱，收集第一个洗脱峰；

所述的缓冲液G磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、硼酸-硼酸钠、Tris-盐酸或甘氨酸-氢氧化钠，缓冲液G的pH为7.4-9.0、浓度5-50mM；缓冲液H为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Bis-Tris-盐酸或乙酸-乙酸钠，缓冲液H的pH为4.5-7.0、浓度10-50mM，且缓冲液H中含有0-20mM氯化钠；缓冲液I为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Bis-Tris-盐酸或乙酸-乙酸钠，缓冲液I的pH为4.5-7.0、浓度20-50mM，且缓冲液I中含有50-80mM氯化钠；

所述的阴离子交换介质为Q-Sepharose FF、DEAE-Sepharose FF或Q-Sepharose XL。

5.根据权利要求4所述的高纯度重组人干扰素α2b的制备方法，其特征在于：所述步骤a的具体操作步骤如下：

1)按照1g:3ml的质量体积比向重组人干扰素α2b菌体中加入6M盐酸胍，在3-5℃条件下搅拌裂解4h，得裂解液；

2)将裂解液装入透析袋中，依次透析pH7.4的PBS两次、pH3.0的20mM醋酸两次以使裂解液复性；

3)将复性的裂解液离心，取上清液过滤，得到的滤液即为复性产物。