CN116120424A - 一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用 - Google Patents

一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：(1)PCR扩增目的基因；(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切；(3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)。干扰素α2b表达菌株破菌后，经硫酸铵沉淀，四步离子交换和疏水层析、以及超滤等分离纯化。本发明表达和纯化的重组人干扰素具有良好的效率、回收率和活性，产品质量远高于国家药典规定的质量标准。

Description

一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物标志物检测技术领域，具体涉及一种干扰素α2b重组表达质粒的构建、可溶性重组表达、分离纯化方法及其应用。
背景技术
干扰素α2b是干扰素α2的一个亚型，在众多的人干扰素种类中，干扰素α的抗病毒活性最强，是临床上治疗肿瘤最常用的干扰素。干扰素α至少含有13种亚型，其中干扰素α2(α2a和α2b)被广泛用于治疗乙型肝炎、丙型肝炎、带状疱疹、尖锐湿疣和某些白血病、恶性肿瘤等疾病。近年来，干扰素α2b被用于COVID-19病毒感染的患者，显示出较好的疗效。
人IFNα2b(UniProtKB数据库编号：P01563)全长188个氨基酸，其中1～23号氨基酸是信号肽，成熟蛋白中信号肽是要被去除的，一般所说的人IFNα2b也就是由24～188这165个氨基酸组成。
干扰素α2b的分子量在19kD左右，pI为6.0左右，生理条件下带负电。与II型干扰素对酸敏感不同的是，I型干扰素，包括干扰素α2b，具有耐酸性[10]，在pH 2.0～10.0中很稳定。干扰素α2b对热也是比较稳定的，在-20℃下可长期稳定保存。
重组人干扰素α2b作为一种上市药物，被广泛用于治疗慢性丙型肝炎、慢性乙型肝炎、恶性黑色素瘤等多种疾病的治疗，产生了良好的临床疗效和经济效益。目前国内厂家生产的干扰素都是经过基因工程表达生产，并且以大肠杆菌表达为主。大肠杆菌表达的人干扰素α2b以包涵体的形式表达，包涵体产物需通过变性复性以及其后的纯化才能获得生物活性。干扰素复性得率低，纯化时需要经过四步色谱处理，工艺繁琐，成本高，而且无法去除未完全复性的中间产物，从而影响产品质量和疗效。
建立可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵工艺，并建立其在此基础上的高效、快速和稳定的纯化工艺。通过发酵罐发酵获得可溶性重组人干扰素α2b的高密度发酵，收集菌体后，通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析、QSepharose Fast Flow阴离子交换层析、SP Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、OctylSepharose Fast Flow疏水层析进行纯化，并对纯化产物进行生物活性分析。
重组人干扰素α2b工程菌的发酵密度OD600达到38.5，可溶性重组人干扰素α2b占菌体总蛋白的14.0％；100克湿菌可平均纯化获得240mg纯度接近100％的重组人IFNα2b，比活为1.81x108IU/mg。
干扰素α2b在临床上具有广泛的应用，但是其大规模生产一直是一个难题。目前，国内工业化生产的rIFNα2b大多是以不溶性包涵体表达，以包涵体变复性为纯化手段，经过包涵体清洗、离心、复性、离心、层析等手段获得原液。在包涵体变复性工艺中，复性操作困难，活性损失大、复性耗时长，生产成本高，设备投资大等缺点，而且复性机理复杂，过程难以控制。因此，rIFNα2b在产品的均一性和批间一致性等方面都存在着不小的挑战。而且，在变复性工艺中需要加入变性剂和氧化还原系统，增加了杂质的加入，提高了质控的难度；因此，以包涵体变复性工艺生产的重组干扰素α2b通常无法达到欧盟的质量标准。开发高质量的重组干扰素α2b的表达和生产工艺、建立快速稳定的纯化工艺势在必行。
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供了一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用。
为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：本发明的一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：
(1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；
(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；
(3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)；
(4)干扰素α2b的纯化:step1 IFNα2b的粗提；Step2 IFNα2b的层析纯化。
进一步地，在步骤(1)中，所述的上游引物IFNα2b-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
进一步地，在步骤(1)中，所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCREnhancer 1μL，High-Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
更进一步地，在步骤(2)中，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；在步骤(4)中，IFNα2b的粗提:S1菌体裂解：将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH4Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清；
S2硫酸铵沉淀：取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。
进一步地，在步骤(4)中，IFNα2b的层析纯化包括如下步骤：S1样品处理；S2Phenyl Sepharose Fast Flow层析；S3脱盐；S4 Q Sepharose Fast Flow层析；，S5更换缓冲液；S6 SP Sepharose Fast Flow层析；S7 Octyl Sepharose Fast Flow纯化；S8超滤更换缓冲液。
进一步地，在步骤(4)中，S1样品处理:取硫酸铵沉淀样品，加入10倍体积的缓冲液A，溶解后，加入10倍体积的缓冲液B，搅拌10分钟，12000g的离心力离心30min，，取上清备用；缓冲液A为20mM PB、pH 7.0；缓冲液B为20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0；
S2 Phenyl Sepharose Fast Flow层析:先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用2-3个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用5-6个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，接收洗脱峰，最后用3-4个柱体积的纯化水冲洗层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM～100mMPB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0。
更进一步地，在步骤(4)中，S3脱盐：IFNα2b的Phenyl Sepharose Fast Flow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为10mM PB、pH 7.0，超滤至电导5mS/cm，用纯水稀释3倍，离心取上清液备用；
S4 Q Sepharose Fast Flow层析：
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用7-10个柱体积的平衡缓冲液平衡柱子，开始上样，样品上样结束后，用10个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，接收洗脱峰，最后用2-3个柱体积的再生缓冲液再生层析柱；平衡缓冲液为10mMPB、pH 7.0，洗脱缓冲液为10mM PB、50～120mM NaCl、pH 5.8～6.4；再生缓冲液为10mM PB、1M NaCl、pH7.4。
进一步地，在步骤(4)中，S5更换缓冲液：IFNα2b的Q层析洗脱液，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，超滤液为10mM PB、pH5.8，超滤至电导小于2.0mS/cm，pH接近5.80，离心取上清备用；
S6 SP Sepharose Fast Flow层析：
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用2体积的洗涤缓冲液洗涤，接着用洗脱缓冲液洗脱，接收洗脱峰，再用50mM PB、pH 7.4洗脱，最后用2个柱体积的再生缓冲液再生层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、pH 5.8，洗涤缓冲液为45mM PB、pH 5.8，洗脱缓冲液为40mM～70mM PB、pH 6.0～7.2，再生缓冲液为20mM PB、1M NaCl、pH7.4。
进一步地，在步骤(4)中，S7 Octyl Sepharose Fast Flow纯化
样品的处理：INFα2b的SP Sepharose Fast Flow层析产物和同体积的20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0混合，0.45μm滤膜过滤，备用；
层析过程：先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用3体积的洗涤缓冲液洗涤，接着用洗脱缓冲液(20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH7.0)洗脱，接收洗脱峰，再用3-4个柱体积的纯化水再生层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0，洗涤缓冲液为20mM PB、1.0M硫酸铵、pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0。
进一步地，在步骤(4)中，S8超滤更换缓冲液：IFNα2b的Octyl Sepharose FastFlow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为20mM PB、10mMArg、10mM Met、pH 7.0，使用20倍体积的超滤液脱盐，得纯化的干扰素α2b蛋白质原液。
本发明所述的干扰素α2b在制备干扰素药物中的应用。
有益效果：本发明建立的重组人干扰素α2b表达工程菌表达的干扰素α2b以可溶形式表达啊，因此，不再需要传统的包涵体变复性工艺；本发明建立的重组人干扰素α2b分离纯化工艺生产的干扰素α2b蛋白质原液具有良好的效率、回收率和活性，产品质量远高于国家药典规定的质量标准。
附图说明
图1为本发明的IFNα2b的PCR扩增产物图。
图2为本发明的重组质粒pET28a-IFNα2b的鉴定图。
图3为本发明的不同诱导温度对IFNα2b可溶性表达的影响图。
图4为本发明的不同pH的抽提缓冲液对IFNα2b可溶性表达的影响图。
图5为本发明的IFNα2b工程菌发酵产物。1、蛋白质分子量标准：116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kDa；2-4、IFNα2b表达工程菌发酵产物。
图6为本发明的Phenyl Sepharose Fast Flow层析分离的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果。1、Phenyl Sepharose FF层次前的样品；2、蛋白质分子量标准；3、上样穿过组分；4、Phenyl Sepharose FF层次分离的样品；5、用DDW洗脱组分。
图7为本发明的Q Sepharose Fast Flow层析分离纯化的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果。1、Q Sepharose FF层析前的样品；2、上样穿过组分；3、Q Sepharose FF层析后纯化的样品；4、1M NaCl的洗脱组分；5、蛋白质分子量标准。
图8为本发明的SP Sepharose Fast Flow层析分离的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果。1、SP Sepharose FF层析前的样品；2、上样穿过组分；3、洗脱峰1；4、SP SepharoseFF层析后的分离样品；5、洗脱峰3；6、1M NaCl的洗脱组分；7、蛋白质分子量标准。
图9为本发明的Octyl Sepharose Fast Flow层析分离纯化的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果。1、蛋白质分子量标准；2、Octyl Sepharose FF层析前的样品；3、OctylSepharose FF层析分离的样品；4、用DDW洗脱组分。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更加全面的描述，附图中给出了本发明的若干实施例，但是本发明可以通过不同的形式来实现，并不限于文本所描述的实施例，相反的，提供这些实施例是为了使对本发明公开的内容更加透彻全面。
实施例1
本发明的一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，包括如下步骤：
(1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；所述的上游引物IFNα2b-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High-Fidelity DNApolymerase0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；
(3)IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)。
试验例1
引物设计及目的基因的PCR扩增
设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段。上下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点，具体的IFNα2b引物序列如表1所示：
表1
本发明采用PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增，PCR反应体系为：2x TrisBuffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High-Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL。PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
试验例2
重组表达质粒的构建
将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析。胶回收目的基因片段及载体片段，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；连接产物转化感受态细胞Top10；挑取单克隆，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，即为表达干扰素α2b的重组工程菌株。
干扰素α2b的表达条件的优化
不同诱导温度
加入终浓度为1mM的IPTG，将含重组质粒的BL21(DE3)分别在37℃小量诱导表达12h和20℃小量诱导表达16h，超声时Buffer选择PBS。分别取超声后的总蛋白、上清、沉淀制样，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，分析比较目的蛋白在不同温度条件下的可溶性差异。
不同缓冲液
加入终浓度为1mM的IPTG，将含重组质粒的BL21(DE3)在20℃小量诱导表达16h。超声时，选用不同的Buffer：25mM HAc-NaAc(pH4.5)、25mM HAc-NaAc(pH5.0)、25mM HAc-NaAc(pH5.5)、25mM HAc-NaAc(pH6.0)、20mM Tris-HCl(pH7.9)，分别取超声后的总蛋白、上清、沉淀制样，进行12％SDS-PAGE凝胶电泳，分析不同缓冲液对目的蛋白可溶性的影响。
实验结果
目的片段的扩增
设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，预期扩增产物的大小约为512bp。PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，可以看到条带清晰单一，片段大小与预期的结果一致，结果见图1。图1为本发明的IFNα2b的PCR扩增产物图。M:DNA Marker DL2000；1:IFNα2b基因的扩增片段
重组质粒pET28a-IFNα2b的鉴定
IFNα2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，挑取单克隆进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定(图2)。酶切片段大小与预期(约506bp)相符的阳性克隆采用T7引物进行DNA测序分析。测序结果使用BLAST程序进行比对分析，比对结果与预期一致，证明IFNα2b片段已成功插入pET28a载体，且其阅读框序列保持不变。
试验例3
干扰素α2b表达条件的优化结果
不同诱导温度对IFNα2b可溶性表达的影响
大肠杆菌的最适生长温度是37℃，该温度下的蛋白表达容易错误折叠，形成包涵体，而低温诱导有利于蛋白质的正确折叠。因此，本发明选择37℃和20℃这两个温度条件来比较不同诱导温度对IFNα2b可溶性表达的影响。
图2为本发明的重组质粒pET28a-IFNα2b的鉴定图。(a)菌落PCR鉴定图。M:DNAMarker DL2000；1:阴性对照；2-4:pET28a-IFNα2b的不同单克隆；(b)酶切鉴定M:DNAMarker DL2000；1:pET28a-IFNα2b经NcoI和XhoI双酶切。
图3为本发明的不同诱导温度对IFNα2b可溶性表达的影响图。(a)1:未诱导；2:20℃总蛋白；3:20℃上清；4:20℃沉淀；5:37℃总蛋白；6:37℃上清；7:37℃沉淀；M:ProteinMarker。(b)对左图IFNα2b表达的定量分析不同诱导温度条件下可溶性IFNα2b的比例。
本发明中将上清与沉淀中的目的蛋白量之和作为总蛋白量，计算出上清中可溶性表达的IFNα2b与IFNβ2b总蛋白量的百分比(即IFNα2b的可溶性比例)。如图3所示，20℃诱导条件下，多达80.6％的IFNα2b以可溶的形式存在于上清中；而在37℃诱导条件下，这一比例只有8.1％，二者相差有十倍，所以本发明选择20℃作为优化的诱导温度。
不同pH的缓冲液对IFNα2b可溶性表达的影响
本发明选取pH为6.0，5.5，5.0和4.5的25mM HAc-NaAc缓冲液以及pH为7.9的20mMTris-HCl缓冲液，比较不同pH的缓冲液对IFNα2b可溶性表达的影响。
图4为本发明的不同pH的抽提缓冲液对IFNα2b可溶性表达的影响图。(a)1:未诱导；2、3:20mM Tris-HCl(pH为7.9)的上清、沉淀；4、5:25mM HAc-NaAc(pH6.0)的上清、沉淀；6、7:25mM HAc-NaAc(pH5.5)的上清、沉淀；8、9:25mM HAc-NaAc(pH5.0)的上清、沉淀；10、11:25mM HAc-NaAc(pH4.5)的上清、沉淀。(b)对左图IFNα2b可溶性表达的定量分析不同pH的抽提缓冲液中可溶性IFNα2b的比例。从图4可以看出，在pH 4～6之间，IFNα2b的可溶性随着pH的降低而变差，至pH 4.5时，几乎所有蛋白都沉淀了。pH在6.0以上变化时对可溶性影响不大。
试验例4
干扰素α2b的纯化
一、材料
1、工程菌株表达可溶性重组人IFNα2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)由南京大学生命科学学院华子春教授实验室构建并赠送。
2、主要试剂Phenyl Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow、SPSepharose Fast Flow和Octyl Sepharose Fast Flow填料均由江苏苏青生物技术有限公司惠赠，GE公司的填料也产生类似的纯化效益和结果；IPTG购自上海源叶生物科技有限公司；氯化铵、氯化钠、硫酸铵、磷酸二氢钠和磷酸氢二钠都是分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白质分子量标准购自赛默飞世尔科技公司。
二、实验方法
1IFNα2b的发酵
从-80℃冰箱中取出种子菌，融化后按接种量3μL接入到含0.3mg卡那霉素的3ml试管LB培养基中，37℃、220rpm，摇床培养12小时，得一级种子液。吸取一级种子液，按接种量50μL接入到含5.0mg卡那霉素的50ml摇瓶LB培养基中，37℃、220rpm，摇床培养12小时，得二级种子液。吸取二级种子液1mL接入到含50mg卡那霉素的1L摇瓶LB培养基中，共2支摇瓶，37℃、220rpm，摇床培养12小时，得三级种子液。将三级种子液全加入到含18L优化培养基的50L发酵罐中，37℃、转速300rpm、通气量1000L/H，分别在培养1小时时提速到330rpm、培养2小时时提速到360rpm、培养3小时时提速到390rpm、培养4小时时提速到440rpm，降温至24℃加入1.9g诱导剂IPTG。发酵过程中流加20％葡萄糖溶液控制发酵液pH值相对恒定。培养10-13小时后结束发酵，10000g的离心力离心10min获得发酵菌。
2IFNα2b的粗提
2.1菌体裂解
将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH4Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清。
2.2硫酸铵沉淀
取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。
3IFNα2b的层析纯化
3.1样品处理
取硫酸铵沉淀样品，加入10倍体积的缓冲液A(20mM PB、pH 7.0)，溶解后，加入10倍体积的缓冲液B(20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0)，搅拌10分钟，12000g的离心力离心30min，，取上清备用。
3.2Phenyl Sepharose Fast Flow层析
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用2-3个柱体积的平衡缓冲液(20mMPB、1.2M硫酸铵、pH 7.0)平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用5-6个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液(20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0)洗脱，接收洗脱峰，最后用3-4个柱体积的纯化水冲洗层析柱。
3.3脱盐
IFNα2b的Phenyl Sepharose Fast Flow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为10mM PB、pH 7.0，超滤至电导5mS/cm，用纯水稀释3倍，离心取上清液备用；
3.4Q Sepharose Fast Flow层析
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用7-10个柱体积的平衡缓冲液(10mMPB、pH 7.0)平衡柱子，开始上样，样品上样结束后，用10个柱体积的平衡缓冲液(10mM PB、pH 7.0)冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液(10mM PB、50～120mM NaCl、pH 5.8～6.4)洗脱，接收洗脱峰，最后用2-3个柱体积的再生缓冲液(10mM PB、1M NaCl、pH7.4)再生层析柱。
3.5更换缓冲液
IFNα2b的Q层析洗脱液，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，超滤液为10mM PB、pH5.8，超滤至电导小于2.0mS/cm，pH接近5.80，离心取上清备用。
3.6SP Sepharose Fast Flow层析
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液(20mMPB、pH 5.8)平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液(20mM PB、pH 5.8)冲洗层析柱，然后用2体积的洗涤缓冲液(45mM PB、pH 5.8)洗涤，接着用洗脱缓冲液(40mM～70mM PB、pH 6.0～7.2)洗脱，接收洗脱峰，再用50mM PB、pH 7.4洗脱，最后用2个柱体积的再生缓冲液(20mM PB、1M NaCl、pH 7.4)再生层析柱。
3.7Octyl Sepharose Fast Flow纯化
样品的处理：INFα2b的SP Sepharose Fast Flow层析产物和同体积的20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0混合，0.45μm滤膜过滤，备用；
层析过程：先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液(20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0)平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液(20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0)冲洗层析柱，然后用3体积的洗涤缓冲液(20mMPB、1.0M硫酸铵、pH 7.0)洗涤，接着用洗脱缓冲液(20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH7.0)洗脱，接收洗脱峰，再用3-4个柱体积的纯化水再生层析柱。
3.8超滤更换缓冲液
IFNα2b的Octyl Sepharose Fast Flow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为20mM PB、10mM Arg、10mM Met、pH 7.0，使用20倍体积的超滤液脱盐，得原液。
4IFNα2b的生物活性检测
根据中国药典2020年版第三部3523-干扰素生物学活性测定法的第二法(报告基因法)[11]测定干扰素原液的活性。
三、实验结果
1IFNα2b工程菌发酵结果
本发明建立起了IFNα2b工程菌的20升发酵体系，经过优化，工程菌的发酵密度OD600可以达到38.5，离心收集菌体后，可收获1.5kg的湿菌。发酵菌中有明显的表达条带，表达量达到总菌体的14.0％(灰度扫描)，见图1，且都以可溶性形式存在；成熟人IFNα2b由165个氨基酸组成，分子量约为19.46kD，其在SDS-PAGE图中的位置也与理论值相符合。
图5为本发明的IFNα2b工程菌发酵产物。1、蛋白质分子量标准：116，66.2，45，35，25，18.4，14.4kDa；2-4、IFNα2b表达工程菌发酵产物。
2IFNα2b的纯化结果
通过高压破碎、硫酸铵分级沉淀、Phenyl Sepharose Fast Flow层析(图6)、QSepharose Fast Flow层析(图7)、SP Sepharose Fast Flow层析(图8)、Octyl SepharoseFast Flow层析(图9)等步骤的纯化，有效地去除了杂质，获得的IFNα2b原液的纯度接近100％。100克湿菌中，平均可纯化出240mg的IFNα2b；20升发酵菌体可纯化获得3.6g的IFNα2b。该纯化工艺获得了高质量的纯化效果、展现出良好的回收率。纯化过程中杂质去除情况及原液的纯度如图6-图9所示。
图6为本发明的Phenyl Sepharose Fast Flow层析分离的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果图。1、Phenyl Sepharose FF层次前的样品；2、蛋白质分子量标准；3、上样穿过组分；4、Phenyl Sepharose FF层次分离的样品；5、用DDW洗脱组分。
图7为本发明的Q Sepharose Fast Flow层析分离纯化的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果图。
1Q Sepharose FF层析前的样品；2、上样穿过组分；3、Q Sepharose FF层析后纯化的样品；4、1M NaCl的洗脱组分；5、蛋白质分子量标准。
图8为本发明的SP Sepharose Fast Flow层析分离的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果图。
1、SP Sepharose FF层析前的样品；2、上样穿过组分；3、洗脱峰1；4、SP SepharoseFF层析后的分离样品；5、洗脱峰3；6、1M NaCl的洗脱组分；7、蛋白质分子量标准。
图9为本发明的Octyl Sepharose Fast Flow层析分离纯化的IFNα2b蛋白质的SDS-PAGE分析结果图。
1蛋白质分子量标准；2Octyl Sepharose FF层析前的样品；3Octyl Sepharose FF层析分离的样品；4、用DDW洗脱组分。
3IFNα2b的纯化过程分析
在纯化过程中，为了降低纯化介质的成本，本文在对比的基础上，采用了国产填料，国产介质表现出层析分离效果和良好的回收率如表1所示。
表1
4 IFNα2b原液的活性
四、结论
根据中国药典2020年版第三部3523-干扰素生物学活性测定法的第二法(报告基因法)测定干扰素原液的活性，结果比活为1.81x108IU/mg，高于药典要求的不低于1.0x108IU/mg的比活要求，产物具有高活性(比药典要求的比活高81％)。
本发明实现了人IFNα2b工程的高密度发酵，20升的发酵体系，菌体密度OD600达38.5，离心后收集的湿菌约为1.5kg，蛋白表达量占全菌蛋白的14％左右，且都以可溶性形式存在。发酵产物通过高压破菌、硫酸铵分级沉淀、疏水层析Phenyl Sepharose FastFlow、阴离子交换层析Q Sepharose Fast Flow、阳离子交换层析SP Sepharose FastFlow、疏水层析Octyl Sepharose Fast Flow的纯化方法，得到纯品人IFNα2b，比活达到1.81x 108IU/mg，与国家药典规定的质量标准比活1.0x 108IU/mg相比，比活提高了81％。每1kg湿菌可纯化得到2.4g的高活性质量的重组人IFNα2b纯品，其纯度(SDS-PAGE方法)为100％，显著高于国家药典规定的>95％的纯度(SDS-PAGE方法)。
该纯化方法所涉及的试剂简单，不涉及复杂的包涵体变复性工艺过程，有利于快速纯化，不仅可以极大地缩短生产周期，还可以降低试剂费用支出，降低质控难度，提高批间一致性，进而提高产品质量。
在本发明中，纯化工艺所涉及到的纯化填料，本发明比较了国产产品与进口产品的纯化效果，实践证明，国产的纯化填料，能很好地满足IFNα2b的纯化需求，纯化得到的rhIFNα2b，无论从纯度、活性、还是得率上，都表现优异。性能优越的国产填料，不仅能够确保原材料供应链安全，而且能极大地降低成本。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 江苏靶标生物医药研究所有限公司
<120> 一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用
<130> 2022
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(上游引物IFN 2b-F)
<400> 1
catgccatgg gctgtgacct gccgcag 27
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(下游引物IFN 2b-R)
<400> 2
ccgctcgagc tattctttag aacgcagaga ttc 33

Claims (10)

1.一种干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)PCR扩增目的基因：引物设计及目的基因的PCR扩增；设计一对特异性引物扩增IFNα2b基因片段，上游引物和下游引物中分别引入NcoI和XhoI酶切位点；PCR方法对IFNα2b基因片段进行扩增；
(2)将原核表达载体pET28a(+)和PCR合成的DNA片段均经NcoI和XhoI进行双酶切，产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分析；胶回收目的基因片段及载体片段，然后用T4 DNA连接酶将载体和目的片段连接；
(3)IFNβ2b基因片段经PCR扩增和双酶切，与同样经双酶切的pET28a载体连接，转化到Top10感受态细胞中，以菌落PCR进行阳性克隆筛选；菌落PCR筛选为阳性的菌落，进行质粒提取，并进行NcoI和XhoI双酶切鉴定，同时进行基因测序，将测序正确的质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)；挑取单克隆，制得表达干扰素α2b的工程菌株IFNα2b/BL21(DE3)；
(4)干扰素α2b的纯化:step1 IFNα2b的粗提；Step2 IFNα2b的层析纯化。
2.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的上游引物IFNα2b-F的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述的下游引物IFNα2b-R的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述的PCR反应体系为：2x Tris Buffer 25μL，dNTP Mix(10μM each)1μL，Primer F(10μM)1μL，Primer R(10μM)1μL，Template DNA 1.5μL，50x PCR Enhancer 1μL，High-Fidelity DNA polymerase 0.5μL，ddH2O 19μL，共50μL；PCR反应条件为：95℃预变性5min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸35s，共32个循环；72℃再延伸7min；PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
4.根据权利要求3所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(2)中，以T4 DNA连接酶于22℃连接1.5h；在步骤(4)中，IFNα2b的粗提:S1菌体裂解：将约300g湿菌体用3000ml裂解液(50mmol/L NH4Cl，5mol/L EDTA，pH8.0)重悬，1200bar高压裂解三次，10000g的离心力离心50min，取上清；
S2硫酸铵沉淀：取裂解上清边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为25％，继续搅拌60min；12000g的离心力离心30min，取上清；上清中边搅拌边加入固体硫酸铵至饱和度为55％，继续搅拌60min，12000g的离心力离心30min，留蛋白沉淀。
5.根据权利要求4所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，其特征在于：在步骤(4)中，IFNα2b的层析纯化包括如下步骤：S1样品处理；S2 Phenyl SepharoseFast Flow层析；S3脱盐；S4 Q Sepharose Fast Flow层析；，S5更换缓冲液；S6 SPSepharose Fast Flow层析；S7 Octyl Sepharose Fast Flow纯化；S8超滤更换缓冲液；在步骤(4)中，S1样品处理:取硫酸铵沉淀样品，加入10倍体积的缓冲液A，溶解后，加入10倍体积的缓冲液B，搅拌10分钟，12000g的离心力离心30min，，取上清备用；缓冲液A为20mM PB、pH 7.0；缓冲液B为20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0；
S2 Phenyl Sepharose Fast Flow层析:先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用2-3个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用5-6个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，接收洗脱峰，最后用3-4个柱体积的纯化水冲洗层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0。
6.根据权利要求5所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(4)中，S3脱盐：IFNα2b的Phenyl Sepharose Fast Flow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为10mM PB、pH 7.0，超滤至电导5mS/cm，用纯水稀释3倍，离心取上清液备用；
S4 Q Sepharose Fast Flow层析：
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用7-10个柱体积的平衡缓冲液(10mM PB、pH7.0)平衡柱子，开始上样，样品上样结束后，用10个柱体积的平衡缓冲液(10mM PB、pH 7.0)冲洗层析柱，然后用洗脱缓冲液洗脱，接收洗脱峰，最后用2-3个柱体积的再生缓冲液再生层析柱；洗脱缓冲液为10mM PB、50～120mM NaCl、pH 5.8～6.4；再生缓冲液为10mM PB、1MNaCl、pH 7.4。
7.根据权利要求6所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(4)中，S5更换缓冲液：IFNα2b的Q层析洗脱液，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，超滤液为10mM PB、pH 5.8，超滤至电导小于2.0mS/cm，pH接近5.80，离心取上清备用；
S6 SP Sepharose Fast Flow层析：
先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用2体积的洗涤缓冲液洗涤，接着用洗脱缓冲液(40mM～70mM PB、pH 6.0～7.2)洗脱，接收洗脱峰，再用50mMPB、pH 7.4洗脱，最后用2个柱体积的再生缓冲液再生层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、pH5.8，洗涤缓冲液为45mM PB、pH 5.8，洗脱缓冲液为40mM～70mM PB、pH 6.0～7.2，再生缓冲液为20mM PB、1M NaCl、pH 7.4。
8.根据权利要求7所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法，其特征在于：在步骤(4)中，S7 Octyl Sepharose Fast Flow纯化
样品的处理：INFα2b的SP Sepharose Fast Flow层析产物和同体积的20mM PB、2.4M硫酸铵、pH 7.0混合，0.45μm滤膜过滤，备用；
层析过程：先用2-3个柱体积的纯化水洗去保护液，再用3-4个柱体积的平衡缓冲液平衡层析柱，开始上样，样品上样结束后，用3个柱体积的平衡缓冲液冲洗层析柱，然后用3体积的洗涤缓冲液洗涤，接着用洗脱缓冲液(20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0)洗脱，接收洗脱峰，再用3-4个柱体积的纯化水再生层析柱；平衡缓冲液为20mM PB、1.2M硫酸铵、pH 7.0，洗涤缓冲液为20mM PB、1.0M硫酸铵、pH 7.0，洗脱缓冲液为20mM～100mM PB、0.1M～0.7M硫酸铵、pH 7.0。
9.根据权利要求8所述的干扰素α2b可溶性重组表达和分离纯化方法及其应用，其特征在于：在步骤(4)中，S8超滤更换缓冲液：IFNα2b的Octyl Sepharose Fast Flow层析产物，用分子截留量为10KD的中空纤维超滤膜超滤，所用超滤液为20mM PB、10mM Arg、10mM Met、pH 7.0，使用20倍体积的超滤液脱盐，得纯化的干扰素α2b蛋白质原液。
10.权利要求1至9任一项所述的干扰素α2b在制备干扰素药物中的应用。
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