CN103014101A

CN103014101A - 一种干扰素的纯化方法

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Publication number: CN103014101A
Application number: CN2012105698256A
Authority: CN
Inventors: 段志强; 杨栋; 陈玉军; 庞睿; 郑立运; 王晴; 吴贵海; 赵钰; 白宇; 张崇远; 杨超
Original assignee: BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd HAYAO GROUP
Current assignee: BIOLOGICAL ENGINEERING Co Ltd HAYAO GROUP
Priority date: 2012-12-25
Filing date: 2012-12-25
Publication date: 2013-04-03
Anticipated expiration: 2032-12-25
Also published as: CN103014101B

Abstract

本发明涉及一种干扰素的纯化方法，该方法包括以下步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物，再经过脱盐处理，得到干扰素。

Description

一种干扰素的纯化方法

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种干扰素的纯化方法。本发明在纯化工艺中采用了反相填料的精细分离纯化步骤。同现有技术相比较，可以大幅度的提高干扰素的纯度、比活、稳定性。

背景技术：

干扰素（IFN）是一种广谱抗病毒剂，主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制乙肝病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。

干扰素根据抗原特异性和分钟结构的不同，分为α、β、γ等型别，而在一特定的干扰素型别内，再根据氨基酸序列或组成方面的差异，划分出不同的亚型，比如：HuIFN（人干扰素）α1、α2等。而在一特定的干扰素亚型内，根据个别氨基酸的变异，以a、b、c在亚型后面进行标记，比如：HuIFNα-1a, α-2a, α-2b等。

HuIFNα已经可以通过基因重组生物工程技术进行量产。但其纯化工艺经过多年研究始终难以解决其纯度问题，比活下降明显，如现有技术“重组人干扰素_2b的提取和纯化” 微生物学免疫学进展 2004 年第32 卷第 1 期采用离子交换层析柱DEAE sepharose(FF)A柱，柱形XK30/50,以及sephacryl100/50XK层析柱，S-100填料，经过两次层析得到，经过测定，其比活1.2×10⁸IU/mg，蛋白纯度为95%。重组人a2b型干扰素的纯化与鉴定《生物工程学报》1994年第1期 5 页 61-65页采用单克隆抗体亲和层析一步纯化法对大肠杆菌表达的重组人a2b型干扰素进行了纯化，然后利用凝胶过滤高压液相层析、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳和Ｎ端２５个氨基酸的序列测定等方法对纯化产品进行了鉴定。表明一步纯化的重组人a2b达到95%，其比活性为2.54×10^８IU／mg。

本发明经过对不同纯化工艺的研究，筛选出一种纯化方法，本发明采用的技术方案是在纯化工艺中采用了阴离子柱层析，阳离子柱层析，反相填料柱层析三步分离纯化步骤。包括步骤：a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；f、对阳离子柱层析产物进行精细分离，采用反相填料柱层析处理，得到重组人干扰素。

同现有技术相比较，采用本专利的反相填料精细分离，rhIFN电泳纯度由90％提高到98％，HPLC纯度由90％提高到98％，其比活由0.9×10⁷IU/mg提高到3.5×10⁸IU/mg。-30℃条件下稳定性由原有的3个月提高到12个月。可见，采用本发明的重组人干扰素的纯化工艺，可以大幅度的提高rhIFN的纯度、比活、稳定性。

发明内容：

本发明提供一种干扰素的纯化方法，该方法包括以下步骤：

a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；

b、对发酵培养所得菌体进行包涵体的分离和洗涤，得到精制包涵体；

c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；

d、对复性产物进行阴离子柱层析处理，得到阴离子柱层析产物；

e、对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，得到阳离子柱层析产物；

f、采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物，再经过脱盐处理，得到干扰素。

其中，所述干扰素选自：干扰素α-1a, 干扰素α-2a, 干扰素α-2b，优选的是干扰素α-2b。

其中步骤a-c属于现有技术，可以根据现有技术中的方法获得。

本发明所述的步骤d-f属于纯化步骤，属于本发明的技术方案，其中，优选的技术方案如下：

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

使用平衡液（20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡8-10倍柱床体积。

样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2，然后用注射用水将其体积稀释四倍，即为上样液。

上样：上样时泵流速为8.0-49.9ml/min。上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积。

洗脱：使用预洗液（20mmol/L pH7.8 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，洗脱2-4个柱床体积。然后将进液管换至洗脱液（20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL）中，开始目标峰洗脱，收集OD₂₈₀大于0.3洗脱峰。

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

平衡：使用平衡液（20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min，平衡8-10倍柱床体积。

上样：上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，开始上样。上样结束后，换至平衡液中，平衡2-4个柱床体积，至记录笔回至基线。用预脱液（20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰，收集A280大于0.3的洗脱峰。

反相填料层析

采用C18高效液相色谱柱（WTARES PREPLC4000，WTARES C18柱，25mm*100mm*3），流动相A为6%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），流动相B为30%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），进行线性梯度洗脱，收集目标峰，采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA，即为纯化的rhIFN,取样检测。

经取样检测，经反相填料层析分离纯化的样品其电泳纯度与HPLC纯度均大于98％，经测定其比活可达到3.5×10⁸IU/mg 。该样品在-30℃条件下放置12个月，该样品电泳纯度和活性均无显著性变化。稳定性可以保证12个月。其他质量控制项目均符合药典要求。采用本发明的的生产工艺，可以大幅度的提高rhIFN的纯度、比活、稳定性。

本发明的工艺方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：

层析方式的选择：针对现有技术设计了5种层析方式，用这5种方式对复性溶液进行纯化，然后进行测定，实验结果如下：

经过检测发现，方式5效果最好。

具体实施方式：

以下对本发明予以进一步详尽说明。

实施例1

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

疏水柱层析（INdEX层析柱，Phenyl Sepharose FF填料）

平衡：使用平衡液(20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.8mol/L硫酸铵)，调节泵流速为30.0-49.9ml/min。平衡2-4倍柱床体积，至流出液PH值为4.5-5.0结束。

样品预处理：在上步洗脱液中加入硫酸铵，调节硫酸铵终浓度为0.8mol/L，静置半小时以上，即为样品液。

上样：以30.0-49.9ml/min流速上样。上样结束后，用平衡缓冲液平衡1-2倍柱床体积。

洗脱：使用洗脱液(80mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.05M NaCl)，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，开始洗脱，收集A280大于0.3洗脱峰。取样检测。

实施例2

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

样品预处理：将复性产物用冰醋酸调其PH值为4.5，然后用注射用水将其体积稀释四倍，即为上样液。

上样：调节泵流速为30.0-49.9ml/min，开始上样。上样结束后，换至平衡液中，平衡2-4个柱床体积，至记录笔回至基线。用预脱液（20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，至杂质峰洗下为止。换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰，收集A280大于0.3的洗脱峰。

疏水柱层析（INdEX层析柱，Phenyl Sepharose FF填料）

实施例3

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

疏水柱层析（INdEX层析柱，Phenyl Sepharose FF填料）

实施例4

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

反相填料层析

采用半制备型MKF-RP--M-255020250x5020102-13柱。配制洗脱液A为含50mmolNaCl和20mmol Tris-HCl 缓冲液(pH 8)，洗脱液B为含50mmolNaCl溶液20mmol Tris-HCl 60%乙腈(pH 8)。先用洗脱液A洗脱，再用梯度洗脱15％-90％洗脱液B洗脱，10-55分钟收集样品峰。被收集的样品经低温蒸发，除去有机物质，然后透析浓缩，取样检测。

实施例5

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

反相填料层析

采用C18高效液相色谱柱（WTARES PREPLC4000，WTARES C18柱，25mm*100mm*3）,流动相A为6%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），流动相B为30%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），进行线性梯度洗脱，收集目标峰，采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA，即为纯化的rhIFN,取样检测。

经取样检测，其电泳纯度与HPLC纯度均大于98％以上，经测定其比活可达到3.0×10⁸IU/mg 。该样品在-30℃条件下放置12个月，该样品电泳纯度和比活均无显著性变化，其稳定性可以保证12个月。其他质量控制项目均符合药典要求。

Claims

1.一种干扰素的纯化方法，该方法包括以下步骤：

a、选用工程菌做菌株进行发酵培养；

c、对精制包涵体进行复性，获得复性产物；

2.根据权利要求1的纯化方法，其中，所述干扰素选自：干扰素α-1a,干扰素α-2a, 干扰素α-2b。

3.根据权利要求1的纯化方法，其中，所述干扰素是干扰素α-2b。

4.根据权利要求1的纯化方法，其中，所述对复性产物进行阴离子柱层析处理方法如下：

阴离子柱层析（XK50/30层析柱，Q sepharose FF填料）

使用平衡液（20mmol/L PH8.2 Tris-HCl缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min，平衡8-10倍柱床体积，

样品预处理：将复性产物用2mol/L pH8.2 Tris-HCl调其PH值为8.2，然后用注射用水将其体积稀释四倍，即为上样液，

上样：上样时泵流速为8.0-49.9ml/min，上样结束后用平衡液平衡2-4个柱床体积，

洗脱：使用预洗液（20mmol/L pH7.8 NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，洗脱2-4个柱床体积，然后将进液管换至洗脱液（20mmol/L pH7.8 NaH2PO4-Na2HPO4缓冲液、0.1MNaCL）中，开始目标峰洗脱，收集OD₂₈₀大于0.3洗脱峰。

5.根据权利要求1的纯化方法，其中，所述对阴离子柱层析产物进行阳离子柱层析，方法如下：

阳离子柱层析（XK50/30层析柱，CM Sepharose FF填料）

平衡：使用平衡液（20mmol/L PH4.5 HAc-NaAc缓冲液），调节泵流速为30.0-49.9ml/min，平衡8-10倍柱床体积，

上样：上样液为上步得到的A280大于0.3的洗脱液，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，开始上样，上样结束后，换至平衡液中，平衡2-4个柱床体积，至记录笔回至基线，用预脱液（20mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.15 MNaCL缓冲液）进行预洗，调节泵流速为30.0-49.9ml/min，至杂质峰洗下为止，换至洗脱液(50mmol/L PH4.5HAc-NaAc缓冲液、0.2 MNaCL缓冲液)进行洗脱目的峰，收集A280大于0.3的洗脱峰。

6.根据权利要求1的纯化方法，其中，所述采用反相填料柱层析处理上步的阳离子柱层析产物，方法如下：

反相填料层析

采用C18高效液相色谱柱（WTARES PREPLC4000，WTARESC18柱，25mm*100mm*3），流动相A为6%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），流动相B为30%乙腈，0.1%TFA（三氟乙酸），进行线性梯度洗脱，收集目标峰，采用旋转蒸发或冷冻干燥的方法去除乙腈和TFA，即为纯化的rhIFN。